基于EST-SSR標(biāo)記的19份子蓮品種資源遺傳多樣性分析

李怡鵬， 石 林， 楊夢(mèng)飛， 鄭寨生， 張尚法， 王凌云

(金華市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院/浙江省特色水生蔬菜育種與栽培重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 浙江 金華 321000)

蓮在生產(chǎn)用途上被分為三類，分別是藕蓮、子蓮和花蓮[1]。子蓮，以采收蓮子為主，花苞多，花瓣以單瓣為主，花色以紅色居多，偶有白色，蓮蓬大，結(jié)實(shí)率高，但地下莖細(xì)長(zhǎng)，分枝多[2]。近幾年隨著市場(chǎng)的需求變化，子蓮品種又有加工干蓮與鮮蓮之分[3]。現(xiàn)階段最常見(jiàn)的有性雜交育種仍然是子蓮遺傳育種的主要技術(shù)之一，而選配雜交親本組合是進(jìn)行雜交育種最先啟動(dòng)也是最重要的環(huán)節(jié)[4-5]。親本組的選配首先考慮到的是其優(yōu)良的表型性狀，為了能讓兩者的優(yōu)良性狀更好地結(jié)合遺傳，必須考慮兩者之間的遺傳距離，確定其親緣關(guān)系[6]。傳統(tǒng)的育種方法主要是利用表型確定親本之間的親緣關(guān)系，由于子蓮的一些重要農(nóng)藝性狀遺傳能力相對(duì)來(lái)說(shuō)會(huì)比較弱，或者極易受到環(huán)境等因素的影響，所以這種方法育種的效率不高[7]。

近年來(lái)，隨著分子生物技術(shù)的迅速發(fā)展，利用RAPD、SRAP、AFLP、ISSR、基因組SSR等分子標(biāo)記進(jìn)行蓮種質(zhì)資源遺傳多樣性分析及親緣關(guān)系鑒定的研究越來(lái)越多。吳景棟等[8]在2011年采用14對(duì)RAPD有效引物對(duì)30份蓮種質(zhì)資源進(jìn)行PCR擴(kuò)增,結(jié)果表明花蓮與子蓮的相似遺傳系數(shù)較高。歐陽(yáng)冬梅等[9]在2013 年開(kāi)發(fā)了 11對(duì)SRAP引物對(duì)40份蓮材料進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增出多態(tài)性條帶 127 條,多態(tài)性頻率為69.0%，表明蓮屬具有豐富的遺傳多樣性。楊美等[10]在2011年利用AFLP分子標(biāo)記，對(duì)395份花蓮原始種質(zhì)進(jìn)行了DNA多態(tài)性分析。劉藝平等[11]在2013年用篩選出的5條ISSR引物分別對(duì)6份野生半野生荷花品系和27份荷花栽培品種材料基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增,分析出野生半野生品系的各項(xiàng)參數(shù)值均低于栽培品種。分子標(biāo)記由于受環(huán)境因素影響小，且數(shù)量多，因而可以快速鑒別親本之間的親緣關(guān)系，在育種篩選親本的過(guò)程中節(jié)省大量的人力、物力和時(shí)間。

EST-SSR標(biāo)記除了具有多等位性、共顯性、高穩(wěn)定性等特點(diǎn)外，還可以在近緣種甚至遠(yuǎn)緣種間通用，這不僅節(jié)約合成引物的成本，還使物種間比較譜圖的繪制和圖譜的整合更為便捷[12]。徐玉仙等[13]在2015年利用EST-SSR分子標(biāo)記對(duì)30個(gè)亞洲蓮、6個(gè)美洲蓮及14個(gè)亞美雜交蓮品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)亞洲蓮與美洲蓮雜交育成的后代品種與亞洲蓮品種的親緣關(guān)系比較接近。本研究采用EST-SSR技術(shù)，利用篩選的24對(duì)引物對(duì)浙江省金華市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院國(guó)家水生蔬菜育種創(chuàng)新基地保存的19份子蓮品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，了解其親緣關(guān)系，為子蓮的種質(zhì)資源保存及定向育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

材料為金華市農(nóng)科院水生蔬菜種質(zhì)資源圃內(nèi)的19個(gè)子蓮品種(見(jiàn)表1)，栽培情況良好，管理水平相當(dāng)，葉片稀疏、長(zhǎng)勢(shì)一致。

1.2 DNA提取

稱取子蓮新鮮幼嫩葉片80 mg，參照徐玉仙[13]的DNA提取試劑盒法，提取后-20 ℃下長(zhǎng)期保存。

1.3 PCR反應(yīng)體系

PCR反應(yīng)體系如下：

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體積為10.0 μL，其中包括2×ES Taqmix 5.0 μL；DNA模板1.0 μL；引物(濃度10 μmol/L)0.5 μL；ddH2O 3.5 μL。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序如下：

94 ℃預(yù)變性3 min，然后進(jìn)入循環(huán)，94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min，溫度降到4 ℃即完成擴(kuò)增并保存。

上述PCR產(chǎn)物首先經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠預(yù)檢測(cè)，然后向PCR產(chǎn)物中加入6 μL變性劑94 ℃變性5 min，立即放于冰上冷卻，冷卻后直接跑膠或-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

根據(jù)聚丙烯酞胺電泳的結(jié)果，相同片段大小的條帶記為一個(gè)標(biāo)記等位基因，有帶為1，無(wú)帶為0，缺失為2。在19份子蓮材料中統(tǒng)計(jì)EST-SSR位點(diǎn)的等位基因變異，將統(tǒng)計(jì)的數(shù)據(jù)輸入電腦，根據(jù)以下公式計(jì)算每對(duì)引物的多態(tài)性信息含量(PIC)值：

式中，n表示等位基因總數(shù)，qi和qj分別為第i和第j個(gè)等位基因的頻率。

利用NTSYS-pc Version 2.10軟件計(jì)算所有材料間的遺傳相似性系數(shù)，基于這些遺傳相似性系數(shù)用非加權(quán)平均法(Unweighted Pair-Group Method with Arithmetic means,UPGMA)構(gòu)建聚類樹(shù)系圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取結(jié)果

DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。DNA主帶清晰、完整，彌散較少，符合SSR對(duì)DNA的要求。

圖1 部分DNA的電泳檢測(cè)結(jié)果

核酸測(cè)定儀檢測(cè)稀釋50倍的DNA樣品，讀取DNA濃度值(表2)。A260/A280值多數(shù)大于1.8，在2.0左右，DNA純度較高，符合SSR分析的需要。

表2 稀釋50倍DNA濃度

2.2 EST-SSR多態(tài)性分析

從80對(duì)多態(tài)性EST-SSR引物中進(jìn)一步獲得24對(duì)穩(wěn)定擴(kuò)增、高多態(tài)性的引物對(duì)19份子蓮品種進(jìn)行遺傳多樣性分析(見(jiàn)圖2)。利用優(yōu)化后的反應(yīng)體系對(duì)24對(duì)EST-SSR引物進(jìn)行擴(kuò)增篩選。結(jié)果顯示，24對(duì)引物擴(kuò)增結(jié)果清晰明亮，多態(tài)性條帶豐富，適合對(duì)19個(gè)子蓮品種進(jìn)行EST-SSR-PCR擴(kuò)增。多態(tài)性信息量(PIC)可用來(lái)評(píng)估每對(duì)引物標(biāo)記的多態(tài)性信息量水平(高：PIC>0.5；適中：0.5>PIC>0.25；低：PIC<0.25)[14]。在本試驗(yàn)篩選的24對(duì)EST-SSR引物中，所得PIC值最低的為0.58(NNFB_83)，最高的為0.91(NNFB_1491)，平均每對(duì)引物的PIC值為0.77，表明本試驗(yàn)所篩選的24對(duì)EST-SSR引物具有較高的多態(tài)性，可以對(duì)子蓮種質(zhì)資源進(jìn)行有效的遺傳多樣性分析。引物信息見(jiàn)表3。

表3 用于遺傳性分析的24對(duì)EST-SSR引物信息

圖2 部分子蓮品種的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

2.3 基于EST-SSR的遺傳多樣性分析

根據(jù)24對(duì)EST-SSR引物的擴(kuò)增結(jié)果，用NTSYS 2.11軟件，依據(jù)相似系數(shù)和非加權(quán)組平均法(UPGMA)進(jìn)行聚類分析，得出19份子蓮種質(zhì)資源的聚類圖(圖3)。從圖3可看出，19份試驗(yàn)的子蓮品種的遺傳相似系數(shù)(GS)范圍為0.42～0.94。根據(jù)遺傳相似系數(shù)越小遺傳距離越大，其兩者之間的親緣關(guān)系就越疏遠(yuǎn)的理論基礎(chǔ)?？梢钥闯霰驹囼?yàn)所提供的19個(gè)子蓮品種之間差異明顯，具有較豐富的遺傳多樣性。依據(jù)圖3，發(fā)現(xiàn)在相似系數(shù)為0.55處時(shí)，所供試材料被分為4組，第Ⅰ組有7個(gè)，分別是建選6號(hào)、處州白蓮、紅花建蓮、建選10號(hào)、建選30號(hào)、建選2號(hào)和建選17號(hào)。第Ⅱ組只有建選35號(hào)一個(gè)品種。第Ⅲ組有4個(gè)，分別是太空5號(hào)、滿天星、太空3號(hào)、京廣1號(hào)。第Ⅳ組則分別是金芙蓉1號(hào)、星空牡丹、宣蓮、太空36號(hào)、XS-4、初平芙蓉和湘蓮。

圖3 子蓮種質(zhì)資源的聚類樹(shù)圖

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)把供試的子蓮分為4組，其中紅花建蓮和4個(gè)建選系的品種都分在了第Ⅰ組里，紅花建蓮作為建寧的地方品種很可能是建選系列的親本材料，這與建選系列的選育過(guò)程相吻合[15]，同時(shí)發(fā)現(xiàn)處州白蓮與紅花建蓮的相似系數(shù)為0.99，且他們的農(nóng)藝學(xué)性狀也沒(méi)有太大的差別，分布地域也相鄰。因此，推測(cè)這兩個(gè)品種很有可能是同一個(gè)品種，由于地域的不同被分別命名，成為地方品種。還有一種可能就是因?yàn)閮傻叵噜彛Y源圃在引種時(shí)發(fā)生串種，引到的都是同一個(gè)品種。第Ⅱ組只有建選35號(hào)一個(gè)品種，它與其他子蓮品種的遺傳距離都比較大，相對(duì)靠近紅花建蓮，這與建選35號(hào)是紅花建蓮和太空蓮20號(hào)的雜交后代相符合[16]。第Ⅲ組有4個(gè)，分別是太空5號(hào)、滿天星、太空3號(hào)、京廣1號(hào)。太空3號(hào)和太空5號(hào)都是由謝克強(qiáng)等[17]選育出的新品種，而京廣1號(hào)是由太空3號(hào)采用離子注入法選育出來(lái)的子蓮品種，其親緣關(guān)系符合現(xiàn)有結(jié)論[18]。第Ⅳ組則分別是金芙蓉1號(hào)、星空牡丹、宣蓮、太空36號(hào)、XS-4、初平芙蓉和湘蓮，金芙蓉是以星空牡丹為親本選育出來(lái)的，其兩者在一個(gè)亞群里。太空36號(hào)與湘蓮的遺傳距離比較近，而太空36號(hào)是通過(guò)子蓮衛(wèi)星搭載、太空誘變選育而來(lái)，所以其可能是湘蓮太空誘變的后代。

大多數(shù)分子標(biāo)記方法可以有效地把蓮種質(zhì)資源分為藕蓮、子蓮和花蓮三大類，但在細(xì)分遺傳距離較近的種質(zhì)資源時(shí)，不同方法會(huì)有差異。例如本實(shí)驗(yàn)結(jié)果在太空36號(hào)和星空牡丹的分類上與歐陽(yáng)冬梅等[9]利用SRAP構(gòu)建蓮指紋圖譜的結(jié)論一致，但在建選17號(hào)的分類上，SRAP表明其與紅花建蓮相距較遠(yuǎn)，而EST-SSR揭示其與紅花建蓮相近，兩者有較大差異，同時(shí)在京廣1號(hào)的分類上也存在差異。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與汪雪芹[19]利用SSR做的子蓮遺傳多樣性的分析結(jié)果相近。說(shuō)明利用EST-SSR標(biāo)記技術(shù)對(duì)遺傳距離較近的種質(zhì)資源遺傳多樣性分析是可行的[20]，子蓮基本上都是異花授粉，不同品種之間的基因很容易通過(guò)蟲(chóng)媒進(jìn)行交流，造成了品種間遺傳資源的混合和品種內(nèi)遺傳較大的差異，即使同一區(qū)域內(nèi)的不同品種也會(huì)有較大的差異[21]。通過(guò)EST-SSR分子標(biāo)記可以有效解決子蓮種質(zhì)資源混亂、遺傳背景不清晰和親緣關(guān)系等問(wèn)題，為今后子蓮的種質(zhì)資源保存及定向育種提供理論基礎(chǔ)。