鎘脅迫對艾納香抗性生理、亞細胞鎘分布和鎘化學形態(tài)的影響

陳子涵， 任建國， 龐玉新， 王俊麗

(1.貴州醫(yī)科大學公共衛(wèi)生與健康學院，環(huán)境污染與疾病監(jiān)控教育部重點實驗室，貴州省食品營養(yǎng)與健康工程研究中心， 貴陽 550025;2.廣東藥科大學中藥資源學院， 廣東 云浮 527500)

由于草藥易于獲取且副作用較少，近年來世界各國對草藥的使用量明顯增加[1]。已有研究顯示，影響草藥產品質量的因素之一是重金屬含量超標，原因很可能是草藥種植基地的土壤受到重金屬污染，且多包含鎘[2-3]。2014年《全國土壤污染狀況調查公報》顯示，Cd作為我國耕地的主要污染物之一，被農作物吸收并積累在植物體內，通過食物鏈進入人體，損害人體腎臟、肝臟等臟器，進而引發(fā)癌癥。

已有研究報道，Cd對植物產生的損傷主要體現(xiàn)在DNA損傷、抑制DNA損傷修復系統(tǒng)、氧化應激和細胞死亡等方面[4]。為了抵御Cd的毒害，植物通過區(qū)室化隔離作用，如將重金屬隔離在液泡中或將Cd沉積在其他亞細胞組分中[5-6]來避免重金屬的毒害。此外，植物對細胞內Cd解毒的主要途徑之一是通過巰基化合物[如谷胱甘肽(GSH)，植物螯合肽(Phytochelatins，PCs)和金屬硫蛋白(Metallothinein，MT)]與重金屬進行螯合[7-8]，形成較小毒性的鎘絡合物，從而將Cd更快的轉移到儲存場所。有研究表明，GSH和PCs在重金屬Cd跨液泡膜轉運中起著核心作用，且PCs的作用遠超GSH[9]。此外，植物中Cd的生物活性與其化學形態(tài)有關[10]，植物通過形成生物活性低的化學形態(tài)Cd(果膠、蛋白螯合態(tài)和難溶性磷酸鹽形態(tài))，從而降低Cd的毒害作用[7-8]。Cd脅迫還會導致植物體內活性氧自由基(Reactive oxygen species，ROS)的過量積累[11]，進而攻擊生物膜上的多不飽和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acid，PUFA)，引發(fā)脂質過氧化作用，形成脂質過氧化產物，如丙二醛(MDA)，因此MDA能間接反映植物體內的過氧化程度[12-13]。此外，植物抗氧化防御系統(tǒng)，包括抗氧化酶系統(tǒng)，如超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和非酶系統(tǒng)，如抗壞血酸(ASA)、谷胱甘肽(GSH)可以通過對Cd脅迫下產生活性氧的解毒作用來提高鎘的耐受性[14]。

艾納香(Blumeabalsamifera(L.)DC)作為貴州省道地藥材，其藥效成分主要包括倍半萜內酯類化合物、黃酮類等多種化合物[15-16]，以艾納香葉片為唯一原材料制取的天然冰片[17]，具有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗炎、抗腫瘤等功效，在臨床上被廣泛應用，市場需求量較大[18-19]。為適應市場需求，在貴州省羅甸縣建立了艾納香規(guī)范化種植基地，但有研究表明，黔產艾納香對土壤重金屬元素Cd的富集能力較強[20-21]，為此有必要對Cd脅迫下的艾納香解毒機制進行探討。目前，關于Cd脅迫下艾納香各器官的生理生化改變[22]及鎘解毒機制[23]研究較少，為此本研究擬通過盆栽試驗，分析Cd脅迫對艾納香各器官抗性生理指標、Cd積累分布特征及Cd結合形態(tài)的影響，以探討艾納香對Cd的耐性和解毒機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1供試植物

選取貴州省羅甸縣艾納香GAP基地長勢一致的艾納香幼苗作為供試植物。

1.1.2供試土壤

貴陽市貴安新區(qū)黨武鎮(zhèn)農田土壤為試驗土壤。將土壤置于通風處自然風干，去除石塊等雜質后，捶碎，過3 mm篩并充分混合后用于盆栽試驗。土壤基本理化性質為：pH=7.56，速效氮114.92 mg/kg，有效磷12.791 mg/kg，速效鉀31.56 mg/kg，有機質12.81 mg/kg，土壤Cd的背景值為0.069 5 mg/kg，按照《土壤環(huán)境質量農用地土壤污染風險管控標準》(GB 15618-2018)，該土壤污染風險低。

1.2 試驗設計

采用盆栽試驗，稱取5 kg風干土壤，分別置于已編號的塑料盆中(直徑30 cm，高23 cm)。稱取一定量的CdCl2·2.5 H2O(分析純)，用去離子水配制成水溶液，均勻噴灑于供試土壤表面，根據課題組前期研究結果進行處理組濃度設計[23]，使供試土壤中外源鎘的質量分數分別為0.5 mg/kg和5 mg/kg 。沉降并靜置14 d后，充分混勻盆內土壤，選取長勢一致的艾納香幼苗隨機種植于盆中，每盆定植一株，每個處理3次重復，每重復3盆，每個處理組共9盆。以不額外施Cd的土壤為對照(0 mg/kg)。人工避雨，視盆內土壤水分狀況，不定期澆水。

1.3 測定指標與方法

1.3.1樣品的采集及預處理

盆栽培養(yǎng)150 d后，采集艾納香的根用20 mmol/L Na2-EDTA浸泡20 min后，與莖和葉一起用自來水、純水依次進行沖洗，室溫晾干。隨機選取部分樣品置于-80 ℃冰箱保存，用于抗性生理和Cd的亞細胞分布和化學結合態(tài)分析；部分樣品置于烘箱中烘干至恒重，用研缽研磨成粉狀，放入密封袋并置于干燥器中保存，用于測定各器官的Cd含量。

1.3.2各器官Cd質量分數及轉運系數的測定

分別稱取一定量根、莖、葉樣品，加入7 mL HNO3-H2O2(體積比5∶2)，用微波消解儀進行消解。用contrAA 700石墨爐原子吸收光譜儀測定Cd含量，進而計算各器官Cd質量分數。并根據下列公式計算轉運系數和富集系數。

富集系數=艾納香地上部Cd含量/土壤中Cd含量；

轉運系數=艾納香地上部Cd含量/根部Cd含量。

1.3.3各器官抗性生理的測定

用試劑盒測定各器官膜脂過氧化指標MDA含量、抗氧化酶系統(tǒng)指標SOD、POD活性和發(fā)揮螯合作用多肽指標NPT、GSH、植物金屬螯合肽(PCs)含量(南京建成生物工程研究所提供試劑盒)，每組設置3個重復。

1.3.4各器官亞細胞Cd質量分數的測定

參考Weng等[7]的方法，將各器官亞細胞組分分為細胞壁組分(FⅠ)、細胞器組分(FⅡ)和可溶組分(FⅢ，包括細胞質、液泡內高分子、大分子有機物質和無機離子)，并用原子吸收光譜儀測定各組分的Cd質量分數，每組設置3個重復。

1.3.5各器官化學結合形態(tài)Cd質量分數的測定

參考賀遠等[24]的方法，進行各器官化學結合形態(tài)Cd的提取，提取劑的提取順序依次為80%乙醇、去離子水、1 mol/L氯化鈉溶液、2% 醋酸、0.6 mol/L鹽酸溶液，并用原子吸收光譜儀測定F乙醇、F水、F氯化鈉、F醋酸、F鹽酸和F殘渣組分的Cd質量分數，每組設置3個重復。

1.4 數據統(tǒng)計與分析

采用Excel 2016軟件進行數據整理，SPSS 19.0軟件進行數據分析，對于服從正態(tài)分布且方差齊的數據，采用LSD法進行差異顯著性檢驗，對于服從正態(tài)分布但方差不齊的數據，采用Games-Howell軟件進行差異顯著性檢驗，對于不服從正態(tài)分布的數據采用非參數檢驗，顯著性水平設置為α=0.05，所有結果以均數±標準差(Mean±SD)表示。

2 結果與分析

2.1 Cd脅迫下艾納香各器官Cd的分布

不同Cd處理濃度下，艾納香各器官Cd質量分數及地上部富集系數和轉運系數變化情況如表1所示。結果顯示，隨著外源Cd濃度的增加，艾納香各器官Cd質量分數均明顯增加，且Cd質量分數從大到小表現(xiàn)為葉、莖、根。在0 mg/kg Cd處理濃度下，雖然沒有額外向土壤中施加Cd，但艾納香體各器官均有一定量的Cd存在，暗示了艾納香對Cd的富集作用。

表1 Cd 脅迫處理對艾納香各器官Cd 積累和富集系數、轉運系數的影響

各處理組中地上部富集系數和轉運系數均大于1，其中以0.5 mg/kg Cd處理濃度下的富集系數最大(8.163)，未額外施加Cd的處理組次之(2.397)，5 mg/kg Cd處理組最低(1.652)。轉運系數以未額外施加Cd的處理組最高(2.346)，5 mg/kg Cd處理組次之(1.899)，0.5 mg/kg Cd處理濃度下轉運系數最低(1.794)。表明艾納香對低濃度Cd具有較強的轉運能力。

2.2 Cd脅迫下艾納香各器官非蛋白巰基化合物變化

不同濃度Cd脅迫下，艾納香各器官GSH、NPT、PCs含量見表2。在不同外源Cd濃度脅迫下，各器官非蛋白巰基化合物(NPT)以莖部含量最高，葉其次，根最低，且艾納香各器官GSH、NPT、PCs含量均大于對照組。在0.5 mg/kg Cd處理濃度下，艾納香各器官GSH含量以莖(52.92 μmol/g)最高，根(21.49 μmol/g)其次，葉(17.06 μmol/g)最低；而PCs含量以葉(34.75 μmol/g)最高，根(30.50 μmol/g)其次，莖(18.59 μmol/g)最低。在5 mg/kg Cd處理濃度下，艾納香各器官GSH含量以莖(51.10 μmol/g)最高，根(24.27 μmol/g)其次，葉(18.77 μmol/g)最低；而PCs含量以葉(50.21 μmol/g)最高，莖(22.74 μmol/g)其次，根(21.87 μmol/g)最低。

表2 Cd脅迫處理對艾納香各器官GSH、NPT和PCs含量和相對比例的影響

不同濃度Cd脅迫導致各器官GSH和PCs分布有所變化(表2)。由表2可知，在根部：PCs以0.5 mg/kg處理組占比最高(58.96%)，5 mg/kg處理組占比最低(46.98%)；而GSH以5 mg/kg處理組占比最高(53.02%)，0.5 mg/kg處理組占比最低(41.04%)。在莖部：0、0.5、5 mg/kg各處理組均以GSH占比最高，分別為75.86%、75.38%、69.21%，PCs的相對比例隨著外源Cd處理濃度的增加而增加。在葉片中，0、0.5、5 mg/kg各處理組PCs占比最大，且各處理組之間PCs相對比例變化不明顯，分別為72.06%、72.38%、72.79%，GSH的相對比例隨著外源Cd處理濃度的增加而降低。

不同Cd脅迫處理下，根、莖和葉中GSH和PCs含量和相對比例變化結果表明，艾納香各器官對Cd脅迫響應具有組織特異性，表現(xiàn)為在莖部啟動以GSH為主的螯合解毒作用，而在葉片中啟動以PCs含量為主的螯合解毒作用。

2.3 Cd脅迫下艾納香各器官膜脂過氧化及抗氧化酶變化

隨著外源Cd脅迫濃度的增加，艾納香各器官MDA含量均增加，SOD、POD活性總體呈先升后降的趨勢，具體表現(xiàn)為0.5 mg/kg Cd處理濃度下，SOD和POD酶活性最高。各處理組SOD、POD活性和MDA含量均大于對照組，具體結果見表3。上述結果說明，Cd處理加劇了植株脂質過氧化程度，而植株抗氧化酶系統(tǒng)則表現(xiàn)出有限的Cd氧化脅迫清除能力。

表3 Cd脅迫處理對艾納香各器官MDA含量和SOD、POD活性的影響

2.4 Cd脅迫下艾納香各器官亞細胞Cd分布變化

隨著外源Cd脅迫濃度的增加，艾納香各器官亞細胞組分Cd質量分數明顯增加，主要以細胞壁組分(FⅠ)中Cd質量分數最高，其次為可溶性組分(FⅢ)，細胞器組分(FⅡ)最低(見表4)。

表4 Cd脅迫處理對艾納香各器官亞細胞組分Cd質量分數和相對比例的影響

從亞細胞Cd分布比例來看(表4)，不同外源Cd處理濃度下，各器官均以細胞壁組分(FⅠ)占比最高，可溶組分(FⅢ)次之，細胞器組分(FⅡ)最低，且以0.5 mg/kg Cd處理組中各器官細胞壁組分占比最大，但這3種組分Cd所占比例因外源Cd處理濃度的不同而有所不同。葉中細胞器組分Cd所占比例較根、莖高(0.5 mg/kg Cd處理組除外)。在根部，對照組、0.5 mg/kg處理組和5 mg/kg處理組的FⅠ、FⅡ和FⅢ的Cd占比分別為61.64%、2.74%、35.62%，79.23%、6.92%、13.85%和65.57%、14.09%、20.34%。在莖部，對照組、0.5 mg/kg處理組和5 mg/kg處理組的FⅠ、FⅡ和FⅢ的Cd占比分別為55.12%、5.61%、39.27%，75.25%、10.79%、13.96%和53.08%、17.39%、29.53%。在葉片中，對照組、0.5 mg/kg處理組和5 mg/kg處理組的FⅠ、FⅡ和FⅢ的Cd占比分別為50.46%、14.68%、34.86%，73.37%、9.34%、17.29%和47.93%、25.58%、26.49%。

2.5 Cd脅迫下艾納香各器官Cd結合形態(tài)的變化

艾納香各器官Cd的結合形態(tài)含量及占比如表5所示。從艾納香各器官不同結合形態(tài)Cd含量來看，在未施加外源Cd處理濃度下，艾納香各器官Cd結合形態(tài)含量較?。辉谑┘油庠碈d之后，艾納香各器官Cd化學結合形態(tài)含量均增加。0.5 mg/kg Cd處理濃度下，艾納香根Cd化學形態(tài)以氯化鈉提取態(tài)、醋酸提取態(tài)和鹽酸提取態(tài)為主，莖和葉片以氯化鈉提取態(tài)和醋酸提取態(tài)為主；5 mg/kg Cd處理濃度下，艾納香根和莖Cd化學形態(tài)以氯化鈉提取態(tài)和醋酸提取態(tài)為主，葉Cd化學形態(tài)以氯化鈉提取態(tài)、醋酸提取態(tài)和鹽酸提取態(tài)為主。各處理組不同器官的乙醇提取態(tài)和水提取態(tài)Cd含量均較低。

表5 Cd脅迫處理對艾納香各器官不同化學形態(tài)Cd含量及相對比例的影響

從各種提取態(tài)Cd占比來看：隨著外源Cd的施加，各器官乙醇提取態(tài)和水提取態(tài)Cd占比均減少(相比未外施Cd)，而其他提取態(tài)Cd占比因器官不同而有所差異。在根部，隨著外源Cd處理濃度的增加，醋酸提取態(tài)Cd占比明顯增加，鹽酸提取態(tài)Cd明顯減少，而氯化鈉提取態(tài)Cd則基本保持不變。在莖部，隨著外源Cd處理濃度的增加，92%以上的提取態(tài)Cd集中在氯化鈉提取態(tài)和醋酸提取態(tài)中，且不同Cd處理濃度下，二者所占比例差異較大：0.5 mg/kg Cd處理濃度下，氯化鈉提取態(tài)Cd占10.3%，醋酸提取態(tài)Cd占82.2%；5.0 mg/kg Cd處理濃度下，氯化鈉提取態(tài)Cd占58.5%，醋酸提取態(tài)Cd占34.4%。在葉片中，隨著外源Cd處理濃度的增加，各提取態(tài)Cd的占比趨勢不盡相同：在0.5 mg/kg Cd處理濃度下，氯化鈉提取態(tài)(40.2%)和醋酸提取態(tài)(41.1%)Cd占總提取態(tài)Cd的81%以上，而在5.0 mg/kg Cd處理濃度下，氯化鈉提取態(tài)(33.0%)、醋酸提取態(tài)(36.0%)和鹽酸提取態(tài)(25.8%)Cd占總提取態(tài)Cd的94%以上。從以上數據分析可看出，受外源Cd脅迫后，乙醇提取態(tài)和水提取態(tài)Cd的比例降低，而氯化鈉提取態(tài)和醋酸提取態(tài)Cd的相對比例增加，進而反映了艾納香對Cd的耐性機制。

3 討 論

3.1 艾納香體內Cd的器官積累分布特征

土壤中的重金屬污染物被植物吸收后，會將其分配到生長器官和細胞區(qū)室中，以達到對重金屬的耐性[25]。不同類型的植物，其器官積累Cd的數量有所不同。如在大豆(Glycinemax(Linn.) Merr.)中各器官的Cd富集效應為根>莖>葉>可食用部分[26]；在水稻中為根>莖>可食用部分>葉[26]。在木麻黃(Casuarinaequisetifolia.)中則為根>莖>小枝[27]。在棉花中各器官Cd的積累變化，隨著土壤Cd含量的變化略有不同，當土壤Cd含量<5 mg/kg時，棉花各部位Cd含量大小為葉片>莖>棉絮>根；當土壤Cd含量為5～20 mg/kg時，Cd含量為葉片>莖>根>棉絮[28]。在飛機草(Chromolaenaodorata)、三葉鬼針草(Bidenspilosa)中Cd含量則為葉片>莖>根[29]。在本試驗中，艾納香各器官Cd積累量表現(xiàn)為葉>莖>根，這與王俊麗等[23]的研究結果相一致。不同植物對重金屬的吸收、積累部位略有差異，除了與蒸騰作用有關外，更重要的可能是與植物基因型[30]以及不同器官胞內區(qū)室化、螯合作用大小有關[31]。

3.2 艾納香體內非蛋白巰基化合物對Cd脅迫的解毒作用

植物細胞通過體內的巰基化合物(NPT、PCs、GSH等)與Cd進行絡合，以達到對Cd的解毒作用[32]。重金屬脅迫下，植物體通過γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(GSH 1)，谷胱甘肽合成酶(GSH 2)啟動合成GSH[33]，進而再以GSH為前體在植物螯合肽合成酶(PCS)的作用下合成植物螯合肽[34]以絡合金屬離子；而GSH不僅用于植物螯合肽的生物合成，還能直接作為活性氧自由基的清除劑和引發(fā)抵抗活性氧和丙酮醛(有害物質)產生的信號轉導途徑和防御反應等的小分子來調動植物體對外界脅迫的防御作用[35]。

在本研究中，外源Cd處理組艾納香各器官的GSH和PCs含量均大于對照組，暗示GSH和PCs在艾納香Cd脅迫的解毒中起到了重要作用。本研究結果也顯示，在Cd脅迫下，艾納香不同器官中GSH和PCs的相對比例存在明顯差異。在葉中，以PCs為主，莖中以GSH為主，根中兩者相對比例因外源Cd處理濃度的不同有所不同。造成不同器官GSH和PCs的相對比例存在差異的原因可能與不同器官中Cd積累量的作用效應有關，高濃度Cd有助于提高植物螯合肽合成酶(PCS)活性，進而合成更多植物螯合肽[36]。

本研究中，艾納香各器官Cd含量順序為葉>莖>根，再結合葉、莖器官PCs和GSH的相對比例情況分析可知，PCs合成途徑比GSH合成途徑更耐Cd毒，這與PCs含有高比例-SH殘基有關[37]。對根部來說，外源Cd濃度為0和5.0 mg/kg的條件下，PCs和GSH的相對比例接近1∶1，而在0.5 mg/kg的條件下，PCs和GSH的相對比例大于1。從維持體內穩(wěn)態(tài)的角度來說，艾納香不同器官間非蛋白巰基化合物對Cd脅迫的差異響應作用有待進一步探討。

3.3 艾納香體內抗氧化酶系統(tǒng)對Cd脅迫的解毒作用

3.4 艾納香體內Cd的亞細胞分布特征

植物將重金屬離子隔離在細胞或組織中，以減輕重金屬的毒性，這種區(qū)室化作用是植物對重金屬解毒的重要機制，尤其以細胞壁沉積和液泡區(qū)室化為主[44]：一方面，Cd離子可以與細胞壁成分的官能團結合，如多糖[45]，將其固定在細胞壁中，這是植物抵抗Cd脅迫的第一道屏障[46]。另一方面，液泡對重金屬脅迫抵抗也至關重要。Cd離子以植物螯合肽-Cd復合物及谷胱甘肽-Cd復合物的形式在轉運蛋白的幫助下進入液泡固定，從而起到提高宿主Cd耐性的作用[47]。

金屬耐受蛋白(Metal tolerance proteins，MTPs)，通過螯合作用與重金屬陽離子形成螯合物，將其隔離在液泡中，降低了細胞質中重金屬離子的濃度，從而減輕了影響細胞質生化反應的重金屬毒性[25]；在本試驗中，在不同的外源Cd濃度處理下，艾納香各器官亞細胞組分Cd主要存在于細胞壁中，其次為可溶性組分，占比最小的為細胞器組分，這與Cd在秋茄樹(Kandeliaobovata)亞細胞組分中的分布情況一致[7]，但與王俊麗等[23]在艾納香Cd亞細胞分布的試驗結果存在差異，原因可能是種植所用土壤理化性狀不同：本次實驗所用土壤，有效磷含量(12.791 mg/kg)高于前期研究所用土壤(5.53 mg/kg)，速效鉀含量(31.56 mg/kg)則低于前期研究所用土壤(192.22 mg/kg)。在本研究中，葉細胞器組分Cd所占比例較根和莖高的原因可能與Cd優(yōu)先在葉綠體積累有關[48-49]。

3.5 艾納香體內Cd的化學結合形態(tài)形式

Cd的化學形態(tài)與其毒性密切相關。不同化學形態(tài)的Cd具有不同的遷移能力和毒性。無機鹽形態(tài)的Cd(80%乙醇提取)和水溶性Cd(去離子水提取)具有更高的遷移能力，且毒性明顯高于果膠磷酸鹽和蛋白質結合形態(tài)的Cd(用1 M NaCl提取)、難溶性磷酸鹽態(tài)Cd(2%醋酸提取)和草酸態(tài)Cd(0.6 M 鹽酸提取)[50]。本研究結果顯示，隨著外源Cd處理濃度的增加，氯化鈉提取態(tài)和醋酸提取態(tài)的Cd占比增大，而乙醇和水提取態(tài)的Cd占比減小，進而說明在外源Cd脅迫下，艾納香的根、莖、葉中積累的Cd以遷移力弱、毒性小的醋酸提取態(tài)和遷移力、毒性處于中間水平的氯化鈉提取態(tài)存在，以減輕Cd的毒害作用，提高艾納香耐鎘能力。本研究結果與水狐尾藻(Myriophyllumaquaticum)[51]、三色莧(AmaranthustricolorL.)[52]中的不同化學形態(tài)Cd分布模式基本一致。

4 結 論

綜上所述，艾納香主要通過細胞壁沉積、蛋白質和有機酸的結合及形成不溶物和提高非蛋白巰基化合物含量、抗氧化酶系統(tǒng)的防御能力來實現(xiàn)對 Cd 的耐受。