園林廢棄物高效降解菌的分離、篩選及鑒定

李 婷 蔣 朵 盧映菲 楊毅紅

（電子科技大學(xué)中山學(xué)院，廣東中山 528400）

園林廢棄物包括落葉、枯枝等，是城市園林綠化過程中常見的生物質(zhì)廢物，其主要成分是纖維素。為提高園林廢棄物利用效率，分離和篩選具有高效纖維素降解能力的降解菌株具有重要意義。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于纖維素降解的研究很多，包括單一高效菌株的篩選、鑒定及改造[1]，菌種的產(chǎn)酶性能、作用機(jī)理及應(yīng)用效果[2-7]，復(fù)合菌株的研究等[8-9]。例如，張夢(mèng)君等[1]從西藏高海拔的植物根際土壤中篩選具有高效降解纖維素能力的低溫真菌，得到可在低溫條件下生長(zhǎng)且有較強(qiáng)降解能力的菌株；趙鈺[2]從腐殖土中篩選出具有降解纖維素酶能力的放線菌，測(cè)定其酶活及其影響因素；孟建宇等[9]對(duì)酶活性高的菌株構(gòu)建復(fù)合系，測(cè)定其濾紙降解能力，發(fā)現(xiàn)復(fù)合菌的降解能力是單菌株的5～10倍。因此，本研究的主要目的是篩選并獲得高效園林廢棄物降解菌株，并在此基礎(chǔ)上與同類降解菌進(jìn)行比較分析，可為進(jìn)一步開展高效園林廢棄物降解菌種制備提供基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣本。對(duì)園林廢棄物堆積的腐殖土壤（0～20 cm土樣）及腐爛的樹葉進(jìn)行取樣，作為供試樣本。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑。沙氏培養(yǎng)基配方為蛋白胨10g、葡萄糖40g、瓊脂15.0g、氯霉素0.1g、蒸餾水1000mL；LB培養(yǎng)基配方為瓊脂20g、胰蛋白胨10g、酵母粉5g、NaCl 5 g、蒸餾水1 000 mL；CMC-Na培養(yǎng)基配方為CMC-Na15.0g、酵母粉 5.0 g、KH2PO41.0 g、瓊脂 2.0 g、MgSO40.5g、NaCl5.0g、蛋白胨 10.0g、蒸餾水 1000mL，調(diào)節(jié)pH值至7.2；產(chǎn)酶培養(yǎng)基配方為CMC-Na15.0g、酵母粉 5.0 g、KH2PO42.0 g、蒸餾水 1 000 mL，調(diào)節(jié)pH值至7.0。培養(yǎng)基均為121℃滅菌25 min后使用。試劑包括二硝基水楊酸（DNS試劑）、剛果紅染色劑等。試驗(yàn)所用試劑均為分析純。

1.1.3 主要儀器設(shè)備。試驗(yàn)儀器包括恒溫振蕩培養(yǎng)箱（上海智城分析儀器制造公司）、珠江牌培養(yǎng)箱（韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司）、立式高壓蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）、超凈工作臺(tái)（上海智城分析儀器制造公司）、高速冷凍離心機(jī)（鉑金埃爾默企業(yè)管理上海有限公司）、酶標(biāo)儀（鉑金埃爾默企業(yè)管理上海有限公司）、旋渦混合器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 園林廢棄物降解菌的分離與篩選。

（1）菌株分離。將采集的土樣、腐爛落葉置于無菌水中，振蕩均勻，稀釋成一系列不同稀釋度，取10-3、10-4、10-5、10-6稀釋液 100 μL， 分別涂布于沙氏培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基，每個(gè)梯度重復(fù)2次。LB培養(yǎng)基置于37℃培養(yǎng)24 h，沙氏培養(yǎng)基置于28℃培養(yǎng)72 h。待長(zhǎng)出菌落后，挑選單菌落接種于CMC-Na培養(yǎng)基上進(jìn)行初步分離，CMC-Na培養(yǎng)基上分離得到纖維素降解菌株55株，將細(xì)菌編號(hào)為1～40號(hào)、真菌編號(hào)為41～55號(hào)。細(xì)菌、真菌分別于37℃和28℃培養(yǎng)48 h。

（2）菌株篩選。菌株初篩采用剛果紅染色法，用1 mg/mL剛果紅染液染色1 h，棄去染液，加入1 mol/L NaCl溶液脫色1 h。纖維素降解菌的位置會(huì)形成透明圈，選出具有水解圈的菌株共計(jì)15株。復(fù)篩采用產(chǎn)酶培養(yǎng)菌液，然后分別測(cè)定菌液內(nèi)切型-β-葡聚糖酶活力（CMC酶活）、外切型-β-葡聚糖酶活。

（3）CMC酶活的測(cè)定。以1%羧甲基纖維素鈉溶液作為底物，測(cè)試組選取1%羧甲基纖維素鈉1 mL加入pH值=4.5的檸檬酸緩沖液0.5 mL、粗酶液0.5 mL，于50℃水浴鍋中反應(yīng)30 min。中止反應(yīng)后，加入DNS試劑1.5 mL，將各管搖勻，沸水浴5 min，取出。待冷卻至室溫后，定容至20 mL，加塞，顛倒混勻，并測(cè)量其在540 nm下的OD值?？瞻捉M不進(jìn)行50℃水浴，先加DNS以鈍化酶活，其他操作都與測(cè)試組相同。以每分鐘生成相當(dāng)于1 μg的葡萄糖為1個(gè)酶活單位。

（4）外切型-β-葡聚糖酶活力的測(cè)定。在試管中加入1%微晶纖維素底物溶液和緩沖液0.5 mL，再加入酶液0.5 mL，于50℃水浴鍋中反應(yīng)30 min。中止反應(yīng)后，與CMC酶的處理方式相同，在540 nm下測(cè)定其OD值?？瞻捉M不進(jìn)行50℃水浴，先加DNS用于鈍化酶活，其他操作都與對(duì)照組相同。以每分鐘生成相當(dāng)于1 μg的葡萄糖為1個(gè)酶活力單位。

1.2.2 纖維素降解菌鑒定。纖維素分解菌14、20、28、29、30、38號(hào)等菌株16S rDNA序列及系統(tǒng)發(fā)育分析。利用DNA提取試劑盒（Omega Soil DNA Kit）提取菌株基因組DNA，并以此DNA為模板，分別利用16S rDNA通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGC TCAG-3'）、1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）、ITS3（5'-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3'）和 ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。PCR的反應(yīng)體系為用量50 μL，DNA模板1 μL，10×Tagbuffer5.0μL，上、下游引物各 1μL，dNTP1μL，Taq酶1 μL，無菌去離子水 40 μL。 反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性 5 min，94℃變性 30 s，52℃退火 30 s，72℃延展1 min，72℃再次延展8 min，共30個(gè)循環(huán)。

取PCR產(chǎn)物5 μL在1.5%瓊脂凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)，然后送至賽默飛世爾公司進(jìn)行測(cè)序。將得到的序列在NCBI中進(jìn)行Blast比對(duì)，并在GenBank數(shù)據(jù)庫中獲取相似性較高的16S rDNA序列，然后利用MEGA 7.0版本軟件進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)行同源性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素降解菌的篩選

2.1.1 初篩。從降解菌菌株的剛果紅染色結(jié)果（表1）看出：水解圈直徑較大的為52號(hào)和4號(hào)菌株，形成的水解圈直徑分別達(dá)到36.00 mm和48.00 mm；水解圈與菌落大?。ㄖ睆剑┍戎递^大的為20號(hào)、39號(hào)菌株，比值大小分別為7.00和6.00。對(duì)水解圈比值較大的10株菌株進(jìn)行復(fù)篩。

表1 各樣品菌落與水解圈比對(duì)

2.1.2 復(fù)篩。測(cè)定上述10株菌株（4號(hào)、14號(hào)、20號(hào)、28號(hào)、29號(hào)、30號(hào)、31號(hào)、38號(hào)、39號(hào)、51號(hào)）的粗酶液酶活，并進(jìn)行復(fù)篩。CMC酶活和外切型-β-葡聚糖酶活測(cè)定結(jié)果見圖1。由圖1可知，這10株纖維素降解菌株中CMC酶活最大的為51號(hào)菌株（48.8 U/mL），其次為 4 號(hào)菌株（40.1 U/mL）、39 號(hào)菌株（38.2 U/mL）、31 號(hào)菌株（37.7U/mL）、14 號(hào)菌株（34.5U/mL）。 外切型-β-葡聚糖酶活最大的是51號(hào)菌株（6.6 U/mL），其次是 28 號(hào)菌株（6.2 U/mL）、4 號(hào)菌株（6.0 U/mL）、20號(hào)菌株（5.2 U/mL）。

2.2 菌株的鑒定

提取 4號(hào)、14號(hào)、20號(hào)、28號(hào)、29號(hào)、30號(hào)、31號(hào)、38號(hào)、39號(hào)、51號(hào)共10株菌株的總DNA，成功提取6株菌株的DNA。利用16S rDNA通用引物擴(kuò)增后外送測(cè)序，最終成功獲得4株菌株拼接序列，即14號(hào)、20號(hào)、29號(hào)和30號(hào)菌株。對(duì)各菌株及其相近序列進(jìn)行建樹，結(jié)果見圖2。由圖2可知，系統(tǒng)發(fā)育樹的各節(jié)點(diǎn)自展值高于70，該系統(tǒng)發(fā)育樹可信。14號(hào)菌、29號(hào)菌與假蕈狀芽孢桿菌（ACMV01000212）聚為一支，且可信度達(dá)到100%，初步可斷定14號(hào)、29號(hào)菌株為芽孢桿菌屬（Bacillus spp.）。20號(hào)菌株與假單胞菌 （LT718459）、蒙特氏假單胞菌（NR 114224）聚為一支，可信度達(dá)到79%，可將20號(hào)菌株初步歸為假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）。30號(hào)菌株與 3 株泛菌（NR 118857、KJ427829、MG450362）聚為一大支，與其中的泛菌（MG450362）聚為一小支，可信度達(dá)100%，30號(hào)菌株可初步判定為泛菌屬（Pantoea sp.）。

3 結(jié)論與討論

分離降解纖維素的微生物的方法眾多，本文結(jié)合王洪媛等[10]、張夢(mèng)君等[1]、王 偉等[11]及劉津[12]的研究，先分別在LB培養(yǎng)基、沙氏培養(yǎng)基上初步分離，隨后進(jìn)一步進(jìn)行初篩、復(fù)篩，篩選分離出酶活性較高的6株菌株。在進(jìn)行初篩時(shí)發(fā)現(xiàn)，水解圈直徑越大，酶活不一定越大，且水解圈比值與酶活大小也并非成一次函數(shù)的關(guān)系，用剛果紅染料染色CMC-Na、產(chǎn)生透明水解圈的方法作為判斷菌株產(chǎn)纖維素酶能力的唯一憑證是不可靠的。這在蔣明星等[13]、候景昊等[14]的研究中也有類似情況出現(xiàn)。在復(fù)篩中發(fā)現(xiàn)，CMC酶活高的菌株，其外切型-β-葡聚糖酶活反而低。這是由于外切型-β-葡聚糖酶可以逐步地剪切還原性和非還原性末端纖維素鏈，釋放可溶性纖維二糖或葡萄糖，CMC酶隨機(jī)水解較容易進(jìn)入的纖維素分子內(nèi)水解β-1，4糖苷鍵產(chǎn)生新的鏈末端[15]，這2種酶相互作用可以形成有效的纖維素降解體系。

隨后對(duì)14號(hào)、20號(hào)、29號(hào)和30號(hào)等4株菌株進(jìn)行DNA測(cè)序。從創(chuàng)建菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，4株菌株分屬3個(gè)屬，其中14號(hào)、29號(hào)菌株初步判定為芽孢桿菌屬（Bacillus spp.），20號(hào)菌株初步歸為假單胞菌屬（Pseudomonas sp.），30號(hào)菌株可初步歸為為泛菌屬（Pantoea sp.）。

王 偉等[11]在長(zhǎng)期堆放秸稈牛糞處和玉米水稻秸稈處篩選出2株纖維素分解菌，將菌株發(fā)酵培養(yǎng)96 h后，其CMC酶活分別為26.9、22.9 U/mL；孟建宇等[16]從內(nèi)蒙古大青山土壤中篩選出13株低溫纖維素降解細(xì)菌，其CMC酶活為5.9～10.7 U/mL；路強(qiáng)強(qiáng)等[15]研究了13株常見纖維素降解菌，其CMC酶活為1.4～21.5 U/mL，外切型-β-葡聚糖酶活為1.9～14.3 U/mL；張家齊[17]在園林廢棄物堆制栽培基質(zhì)過程中分離出8株降解細(xì)菌，其CMC酶活為31.0～49.0 U/mL（表2）。本文所篩選到的6株降解菌株，其CMC酶活為22.0～34.5 U/mL，外切型-β-葡聚糖酶活為2.0～6.2 U/mL，處于中上水平。

表2 本研究與其他文獻(xiàn)報(bào)道中CMC酶活和外切型-β-葡聚糖酶活