中草藥復方對斷奶仔兔免疫性能及抗氧化性能的影響

韓 昱， 劉 月， 張 寧， 周國璽， 馮海偉， 張立永， 張富梅

（1.河北北方學院，河北張家口 075000；2.河北省畜牧獸醫(yī)研究所，河北保定 071000；3.河北省張家口市農(nóng)業(yè)綜合行政執(zhí)法支隊，河北張家口 075000；4.北京金星鴨業(yè)有限公司，北京 100076）

我國作為養(yǎng)殖兔和出口兔最多的國家， 兔產(chǎn)業(yè)極大地帶動了我國各項產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟發(fā)展。 斷奶仔兔作為兔生長的基礎階段， 在兔整個發(fā)育過程中起著至關重要的作用。 但是斷奶仔兔由于免疫機能不完善，難以抵抗外界的侵害，是飼養(yǎng)管理過程中比較棘手的一個問題。 由此導致的腹瀉是影響斷奶仔兔生產(chǎn)養(yǎng)殖的主要原因。據(jù)統(tǒng)計，在一個平均為20%死亡率的兔群中，70%以上系腹瀉病所致（趙泮峰，2011；桑英智，2011）?？股赜捎谀退幮?、藥物殘留等諸多弊病，作為預防兔腹瀉的藥物已成為過去，隨著無抗養(yǎng)殖時代的到來，尋求抗生素替代品，采用綠色有效的方法預防兔腹瀉，并且研究其作用機制成為一種趨勢（徐文龍，2009）。本研究通過在斷奶仔兔日糧中添加中草藥復方，研究其對仔兔免疫性能和抗氧化性能的影響，從而為減少斷奶仔兔腹瀉，促進生長，保障養(yǎng)兔業(yè)健康綠色發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 基礎日糧由張家口某養(yǎng)兔場提供。中草藥購自河北北方學院校醫(yī)院，主要成分為白頭翁、茵陳、黃連、黨參、黃芪等，粉碎后過60 目篩，按比例均勻混合于飼料中并加工成顆粒料。

1.2 試驗設計 本試驗選取體重相近、健康的30日齡伊拉兔斷奶幼兔60 只，公母各半，隨機分為2 組，每組3 個重復，每個重復10 只。 A 組為對照組，飼喂基礎日糧，B 組為試驗組，飼喂基礎日糧+1%中草藥復方。 各組仔兔斷奶后自由采食5 d 進入試驗期，試驗期60 d。 試驗期間飼喂量、飼喂次數(shù)及時間相同， 在同一飼養(yǎng)環(huán)境及管理方法下進行飼養(yǎng)。

1.3 試驗測定項目和方法 于試驗第30 天和60天分別從對照組及試驗組中每個重復中隨機選擇4 只兔，公母各半，每組共12 只，無菌耳緣靜脈采血5 mL，靜置3 h，3000 r/min 離心10 min，制備血清， 并將血清分裝到1.5 mL 離心管中，-20 ℃冷凍保存。將兔剖解，取脾臟、胸腺和肝臟，進行相關指標測定。

1.3.1 免疫指標測定方法

1.3.1.1 免疫器官指數(shù)測定 摘出新鮮的脾臟和胸腺，去掉其表面的脂肪組織并進行稱重，計算其指數(shù)。

免疫器官指數(shù)/（g/kg）＝器官鮮重/活體重量。

1.3.1.2 血清IgG 含量及血清細胞因子 （IL-2、IL-6） 含量測定 血清樣品送北京華英生物技術(shù)研究所。 血清IL-2、IL-6 含量采用酶聯(lián)免疫法測定，血清IgG 含量采用比色法進行測定（A6 半自動生化儀）。

1.3.1.3 脾 臟IL-2、IFN-γ mRNA 表 達 量 測 定取脾臟樣品相同位置， 用4 ℃生理鹽水進行沖洗后， 用錫箔紙包裹， 先放入液氮中速凍， 然后移入-80 ℃冰箱中待用。 樣品按試劑盒（Invitrogen）操作說明進行總RNA 提取，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 質(zhì)量， 并經(jīng)紫外分光光度計測得A260/A280值在1.8 ～2.0，驗證所提RNA 質(zhì)量合格。取1.0 ～5.0 μg 總RNA，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Roche）操作說明反轉(zhuǎn)錄合成cDNA， 并以此為模板利用熒光定量PCR 技術(shù)測定IL-2 基因表達量。 PCR反應體系20 μL，其中包括5 μL cDNA 模板，上、下游引物各0.4 μL。

IL-2 上、 下游引物序列分別為：CTACTGCTGGATTTACAGGTGCT和TCTGTGACCTTCTTGGGCATAT；IFN-γ 上、 下游引物序列分別 為：TTCTTCAGCCTCACTCTCTCC 和TGTTGTCACTCTCCTCTTTCC；內(nèi)參GAPDH 上、下游引物序列分別為：CGCCTGGAGAAAGCTGCTA 和ACGACCTGGTCCTCGGTGTA；PCR 反應條件為：預變性95 ℃10 min；然后95 ℃15 s，60 ℃60 s，75 ～95 ℃，每20 s 升溫1 ℃，40 個循環(huán)。

1.3.2 血清抗氧化指標測定 測定血清中谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量。 以上均采用721 型分光光度計進行測定，操作按試劑盒說明書進行。

1.4 數(shù)據(jù)處理及分析 試驗數(shù)據(jù)使用統(tǒng)計軟件SPSS 19.0 進行分析， 結(jié)果用“平均值±標準差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 中草藥復方對仔兔免疫性能的影響

2.1.1 中草藥復方對仔兔免疫器官指數(shù)的影響表1 顯示，與對照組相比，試驗30 d 仔兔脾臟指數(shù)顯著提高17.78%（P＜0.05），而試驗60 d 脾臟指數(shù)在一定程度得到提高（P＞0.05）。 另外，試驗30 d 和60 d 胸腺指數(shù)均有一定提高，但差異均不顯著（P＞0.05）。 由此說明，中草藥復方能夠有效提高仔兔的免疫器官指數(shù)。

表1 中草藥復方對仔兔免疫器官指數(shù)的影響g/kg

2.1.2 中草藥復方對仔兔血清免疫指標的影響表2 顯示，試驗30 d 試驗組仔兔血清中IgG 含量較對照組增多，但差異不顯著（P＞0.05），IL-2 和IL-6 含量分別顯著升高20.91%和9.33%（P＜0.05）； 試 驗60 d 仔 兔 血 清 中IgG 含 量 升 高10.36%（P＜0.05），IL-2 和IL-6 含量分別極顯著升高61.71%和22.88%（P＜0.01）。 由此說明，飼料中添加中草藥復方能夠有效提高伊拉兔仔兔血液中的免疫指標水平。

表2 中草藥復方對仔兔血清免疫指標的影響

2.1.3 中草藥復方對仔兔脾臟IL-2、IFN-γ mRNA 表達量的影響 圖1 和圖2 顯示， 與對照組相比， 試驗組在試驗30 d 和60 d 的IL-2 mRNA表達量均得到顯著提高（P＜0.05），IFN-γ mRNA表達量在一定程度上提高， 但差異不顯著 （P＞0.05）。 由此在分子機制層面說明，中草藥復方能夠有效改善伊拉兔仔兔免疫性能。

圖1 中草藥復方對仔兔脾臟IL-2 mRNA 表達量的影響

圖2 中草藥復方對仔兔脾臟IFN-γ mRNA 表達量的影響

2.2 中草藥復方對仔兔血清抗氧化性能的影響由表3 可見，斷奶仔兔日糧中添加中草藥復方，總體趨勢可以增加血清中GSH-Px 和SOD 活性，降低MDA 含量， 即可以顯著改善仔兔機體的抗氧化性能。其中試驗組30 d GSH-Px 和SOD 水平以及60 d SOD 水平較對照組分別顯著提高3.37%、14.05%和13.57%（P＜0.05），60 d MDA 含量較對照組極顯著降低17.24%（P＜0.01）。

表3 中草藥復方對仔兔血清抗氧化指標的影響

3 討論

3.1 中草藥復方對斷奶仔兔免疫性能的影響仔兔腹瀉多發(fā)生在斷奶至斷奶后2 個月這個階段， 該階段仔兔的免疫性能直接影響其對腹瀉致病菌的抵抗力。免疫器官指數(shù)、血清中IgG 以及細胞因子IL-2 和IL-6 含量的變化可以反映機體免疫性能的高低。 在一定范圍內(nèi)免疫器官指數(shù)越高其免疫功能越強（張永翠，2008）。 IgG 是血清中主要的免疫球蛋白，具有抗細菌、抗病毒、抗外毒素等多種活性（馬春全，2004）。 IL-2 和IL-6 是機體重要的細胞因子。 IL-2 主要由T 細胞產(chǎn)生，最顯著的作用是影響T 淋巴細胞的生長，也能夠促進B 細胞的生長及分化。 IL-6 主要由單核巨噬細胞、Th2 細胞、血管內(nèi)皮細胞、成纖維細胞產(chǎn)生。能夠刺激活化B 細胞增殖，分泌抗體，刺激T 細胞增 殖（Ahrens，2021；Holmer，2014；Smolen，2006）。IFN-γ 是由機體內(nèi)活化的T 淋巴細胞和NK 細胞產(chǎn)生的一種糖蛋白，IFN-γ 除具有抗病毒、抗胞內(nèi)寄生菌和寄生原蟲的作用外， 還具有獨特而強大的免疫調(diào)節(jié)功能（龍振洲，1998）。

李學釗等（2016）研究發(fā)現(xiàn)，中草藥飼料添加劑能夠有效增加獺兔免疫器官指數(shù)， 尤其是顯著增加胸腺質(zhì)量和指數(shù)；左曉磊等（2015）研究發(fā)現(xiàn)，中草藥制劑能夠提高獺兔胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)；崔艷麗等（2008）通過小鼠腹腔注射0.25%或0.1%黃芪多糖， 發(fā)現(xiàn)其能增加小鼠脾細胞數(shù)及脾臟重量。有研究表明，添加中草藥制劑可提高獺兔血清中IgG、IgA 含量， 其中添加1.5%中草藥制劑組IgG 含量差異顯著 （郭劍英等，2012）； 郝福星等（2008）發(fā)現(xiàn)，復方中草藥制劑可明顯提高仔豬血清中IL-2 含量；高文婧等（2019）發(fā)現(xiàn)，復合中草藥添加劑能夠提高蘆花雛雞脾臟IL-2m RNA 的表達量。李云鑫（2020）發(fā)現(xiàn)，六位中草藥能夠有效提高細胞因子IL-2 和IFN-γ 的mRNA 表達水平，從而提高肉雞免疫性能。

本研究針對斷奶仔兔腹瀉率和死亡率高的現(xiàn)狀，按照中醫(yī)辯證理論篩選了具有清熱解毒、涼血止痢、滋補氣血、健脾和胃、消食化積效果的中草藥復方， 課題組前期試驗證明其能夠顯著降低斷奶仔兔腹瀉率和死亡率（韓福生等，2018）。本試驗研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)， 所用中草藥復方可以明顯提高仔兔脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)， 可以顯著提高血清中IgG 含量和IL-2 和IL-6 水平。 為了從分子機制上進行探討， 對脾臟中IL-2 和IFN-γ mMRA 表達量進行了測定分析， 發(fā)現(xiàn)試驗組兩種基因表達量均升高，其中IL-2 mMRA 表達量變化顯著。 研究表明， 該中草藥復方顯示了能提高斷奶仔兔的免疫性能的作用， 這從一個很重要的方面證實了該中草藥復方在預防仔兔腹瀉應用上的可行性。中草藥復方中黨參和黃芪的使用， 通過對仔兔氣血的滋補，可以提高機體的抗病力和免疫力，從而顯著降低斷奶仔兔腹瀉率和死亡率。

3.2 中草藥復方對斷奶兔仔兔抗氧化性能的影響 GSH-Px、SOD 的活性可以充分反映動物機體的抗氧化能力， 其主要作用是可以幫助動物機體抵擋自由基的傷害。當自由基攻擊動物機體時，機體就會產(chǎn)生MDA， 因此當動物機體MDA 含量升高時，就表明機體正在遭受自由基的傷害（申瑞玲等，2000）。有數(shù)據(jù)顯示，把中草藥復方添加在斷奶仔豬的日糧中進行飼喂， 可以增強其自身的抗氧化能力， 是因中草藥可以明顯提升血清中超氧化物酶的活性，降低自由基對機體的損傷程度，同時也不會產(chǎn)生更多的MDA（尹富貴等，2007）。 本試驗結(jié)果表明， 中草藥復方能夠有效增強仔兔血清中GSH-Px 和SOD 活性， 尤其顯著增強SOD 活性，另外對MDA 含量也有較好的降低作用。 說明該中草藥復方可以有效改善仔兔體內(nèi)的抗氧化性能。 這從另一方面闡述了中草藥復方在預防仔兔腹瀉、提高生產(chǎn)性能方面的可行性。

4 結(jié)論

本試驗結(jié)果表明， 所用中草藥復方能夠明顯增強斷奶仔兔的免疫力，提高其抗氧化性能，并且對增強其機體抵抗力， 減少腹瀉的發(fā)生具有積極作用。