山楂提取物對斷奶仔豬生長性能、免疫功能、抗氧化能力及腸道微生物的影響研究

湯文杰， 何 鵬， 刁 慧， 晏家友， 魏小蘭，周夢佳， 黃崇波，3， 鄺聲耀， 李書偉

（1.四川省畜牧科學(xué)研究院，動物遺傳育種四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 四川成都 610066；2.四川省畜科飼料有限公司，畜禽生物制品四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川省飼料科技研發(fā)中心，四川成都 610066；3.四川畜科生物發(fā)展有限公司，四川成都 611330）

山楂作為一種傳統(tǒng)中草藥， 其提取物的有效成分主要為黃酮類、多酚和有機(jī)酸。 研究表明，山楂提取物具有促生長、抑菌、殺菌、抗氧化等作用（Deki 等，2020），在醫(yī)藥、飼料添加劑、食品添加劑等方面有廣泛應(yīng)用。 山楂提取物具有天然、安全、環(huán)保、生物活性多樣等特點(diǎn)，研究和開發(fā)山楂提取物相關(guān)產(chǎn)品具有廣闊的應(yīng)用前景。 李莉等（2009） 選擇21 日齡快大型嶺南黃羽肉雞為試驗(yàn)動物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在飼糧中添加20 mg/kg 山楂葉提取物總黃酮能顯著提高4 ～6 周齡黃羽肉雞的日增重和采食量，降低料重比。謝棒祥等（2002）將山楂葉黃酮添加到商品代AA 肉雞日糧中也得到了類似結(jié)果， 并且山楂葉黃酮還具有調(diào)節(jié)血脂的功能。 Ahmadipour 等（2017）將山楂醇提取物以不同劑量添加到1 ～6 周齡肉雞日常飲用水中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)添加劑量為0.2 ml/L 時， 其日增重比空白對照組提高了12%， 料肉比降低了10.2%。 水產(chǎn)營養(yǎng)中，山楂提取物作為一種促生長劑，能提高水產(chǎn)動物生長性能，增強(qiáng)動物體免疫力。在金鯧魚基礎(chǔ)日糧中添加1000 mg/kg 的山楂提取物能顯著提高生產(chǎn)性能， 而低于或高于此水平則沒有明顯影響（Tan 等，2017）。 在豬營養(yǎng)領(lǐng)域，鮮見山楂提取物的相關(guān)應(yīng)用報(bào)道， 目前的研究主要集中于山楂粉和山楂渣的應(yīng)用研究上。 本試驗(yàn)旨在探究仔豬生長性能、免疫功能、抗氧化能力及腸道微生物數(shù)量的變化與山楂提取物的添加水平是否存在劑量效應(yīng)關(guān)系， 評估山楂提取物在無抗日糧中的作用效果，為減輕斷奶應(yīng)激和腹瀉，提高生長性能提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 本試驗(yàn)所用山楂提取物的主要成分為黃酮類化合物（≥15%）、多酚（≥10%），由四川某公司提供；金霉素有效含量為15%，購自內(nèi)蒙某生物公司； 乳化椰子油粉有效含量為50%，由湖南某公司惠贈。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)選取胎次相近、 體重為（8.85±0.73）kg、健康狀況良好的28 日齡“杜×長×大”斷奶仔豬30 頭，按體重相近的原則隨機(jī)分為5 組，每組6 個重復(fù)，每個重復(fù)1 頭仔豬，試驗(yàn)處理詳見表1。

表1 試驗(yàn)處理

1.3 試驗(yàn)日糧與飼養(yǎng)管理 試驗(yàn)基礎(chǔ)日糧參照美國NRC（2012）和我國豬飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)（NY/T 65-2004）設(shè)計(jì)，日糧組成和營養(yǎng)水平見表2。 預(yù)試期3 d，正式試驗(yàn)期28 d，自由采食和飲水，每日8：00、14：00 和20：00 定時投料飼喂三次，每次喂料前清除余料并稱重。 試驗(yàn)期間每日觀察仔豬的健康情況。

表2 日糧組成和營養(yǎng)水平

1.4 樣品采集 試驗(yàn)開始和結(jié)束時，分別對每頭仔豬進(jìn)行空腹稱重。 試驗(yàn)結(jié)束后每頭仔豬進(jìn)行前腔靜脈采血，3500 r/min 離心10 min 分離血清，-20 ℃保存?zhèn)溆茫?用于測定血清免疫指標(biāo)和抗氧化指標(biāo)。仔豬采用頸靜脈放血的方法處死，然后立即打開腹腔，迅速結(jié)扎分離出結(jié)腸，于冰上無菌操作取出結(jié)腸內(nèi)容物，4 ℃保存，立即送往實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)。

1.5 測定指標(biāo)與方法

1.5.1 生長性能及腹瀉率 根據(jù)試驗(yàn)期間的記錄，計(jì)算平均日增重（ADG）、平均日采食量（ADFI）和料重比（F/G）。每日觀察仔豬糞便，腹瀉狀況的判斷參照刁慧等（2020）的糞便評分方法。 統(tǒng)計(jì)仔豬腹瀉頭次數(shù)，并計(jì)算腹瀉率，腹瀉率/%＝[腹瀉頭次數(shù)/（仔豬頭數(shù)×總試驗(yàn)天數(shù)）]×100。

1.5.2 血清免疫指標(biāo) 采用多功能酶標(biāo)儀測定測定血清中免疫球蛋白（IgA、IgM 和IgG），ELISA 試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.5.3 血清抗氧化指標(biāo) 采用分光光度計(jì)測定血清總抗氧化能力 （T-AOC）、 總超氧化物歧化酶（T-SOD）、過氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）的活力。試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.5.4 腸道微生物菌群 結(jié)腸微生物采用平板涂布法計(jì)數(shù)，參照J(rèn)iang 等（2015）的方法：大腸桿菌用胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基，乳酸桿菌用MRS 培養(yǎng)基，梭狀芽孢桿菌用TSC 培養(yǎng)基。

1.6 數(shù)據(jù)處理 所有數(shù)據(jù)用Excel 2019 整理后，采用SAS 9.2 軟件進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），組間差異性比較采用Duncan’s 法進(jìn)行多重比較，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（SEM）”表示。P＜0.05 確定為差異顯著，P＜0.01 確定為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 山楂提取物對斷奶仔豬生長性能和腹瀉指數(shù)的影響 由表3 可見， 與CON 組相比，CF2 組和CF3 組斷奶仔豬的FBW 極顯著提高 （P＜0.01），ADG 和ADFI 顯著提高（P＜0.05），F(xiàn)/G 和腹瀉率顯著降低（P＜0.05）。 與CTC 組相比，CF2組和CF3 組斷奶仔豬的FBW、ADG 和ADFI 顯著提高（P＜0.05）。具體的，與CON 組相比，CTC 組、CF1 組、CF2 組 和CF3 組 的FBW 分 別 提 高 了1.73%（P＞0.05）、0.71%（P＞0.05）、13.51%（P＜0.01） 和7.60%（P＜0.01），ADG 分 別 提 高 了3.35%（P＞0.05）、1.49%（P＞0.05）、24.96%（P＜0.05） 和13.97%（P＜0.05）， 腹瀉率分別降低了53.93%（P＜0.05）、13.04%（P＞0.05）、52.97%（P＜0.05）和48.82%（P＜0.05）。 與CON 組相比，CF2組和CF3 組的ADFI 分別提高了13.66%（P＜0.05）和6.88%（P＜0.05），F(xiàn)/G 降低了9.04%（P＜0.05）和6.21%（P＞0.05）。 與CTC 組相比，CF2 組和CF3 組的末重分別提高了11.58%（P＜0.01）和5.76%（P＜0.01），ADG 分 別 提 高 了20.9%（P＜0.05） 和10.27%（P＜0.05），ADFI 分 別 提 高 了14.50%（P＜0.05） 和7.68%（P＜0.05），F(xiàn)/G 分別降低了5.29%（P＜0.05）和2.35%（P＞0.05）。 與CF3 組相比，CF2 組的末重、ADG、ADFI、F/G 和腹瀉率有一定改善，但是差異不顯著（P＞0.05）。

表3 山楂提取物對斷奶仔豬生長性能和腹瀉率的影響（n=6）

2.2 山楂提取物對斷奶仔豬血清免疫功能的影響 由表4 可見， 日糧添加山楂提取物對斷奶仔豬血清IgA 和IgM 有顯著影響（P＜0.05），對血清IgG 影響不顯著（P＞0.05）。 與CON 組相比，CF2組和CF3 組的血清IgA 分別提高21.54%（P＜0.05） 和22.24%（P＜0.05）；CF2 組的血清IgA 較CF3 組略有上升但二者差異不顯著（P＞0.05）。與CTC 組相比，CF2 組和CF3 組的血清IgA 分別提高13.66%（P＜0.05） 和14.31%（P＜0.05）。 CF2組和CF3 組的血清IgA 差異不顯著 （P＞0.05）。CF2 組 的 血 清IgM 顯 著 高 于CON 組、CTC 組、CF1 組和CF3 組（P＜0.05）。

表4 山楂提取物對斷奶仔豬血清免疫球蛋白含量的影響（n=6） μg/mL

2.3 山楂提取物對斷奶仔豬血清抗氧化能力的影響 由表5 可見， 日糧添加山楂提取物對斷奶仔豬血清T-SOD、GSH-Px 和MDA 有顯著的影響（P＜0.05），對血清T-AOC、CAT 影響不顯著（P＞0.05）。 CF2 組和CF3 組血清T-SOD 含量均顯著高于CON 組、CTC 組和CF1 組（P＜0.05），分別提 高 28.50% 和 26.96% 、15.19% 和 13.81% 、27.34%和25.81%。 CF2 組的血清T-SOD 含量較CF3 組略有提高但二者差異不顯著 （P＞0.05）。CF2 組血清GSH-Px 顯著高于CON 組、CTC 組、CF1 組和CF3 組（P＜0.05）， 分別提高18.02%、21.77%、22.42%和21.20%。 與CON 組相比，CF2組血清MDA 含量降低了28.09%（P＜0.05），其余各組血清MDA 含量差異不顯著（P＞0.05）。

表5 山楂提取物對斷奶仔豬血清抗氧化指標(biāo)的影響（n=6）

2.4 山楂提取物對斷奶仔豬結(jié)腸微生物的影響由表6 可見， 日糧添加山楂提取物會影響斷奶仔豬結(jié)腸乳酸桿菌和大腸桿菌數(shù)量。 CF2 組和CF3組結(jié)腸乳酸桿菌數(shù)量均顯著高于CON 組、CTC 組和CF1 組（P＜0.05），分別提高9.55%和14.36%、21.49%和16.22%、29.91%和24.28%；CF2 組和CF3 組的結(jié)腸乳酸桿菌數(shù)量差異不顯著 （P＞0.05）。 CTC 組、CF2 組和CF3 組結(jié)腸的大腸桿菌數(shù)量顯著低于CON 組和CF1 組 （P＜0.05），但CTC 組、CF2 組和CF3 組結(jié)腸的大腸桿菌數(shù)量差異不顯著（P＞0.05）。各處理組的梭狀芽孢桿菌數(shù)量差異均不顯著（P＞0.05）。

表6 山楂提取物對斷奶仔豬結(jié)腸細(xì)菌計(jì)數(shù)的影響（n=6）lg cfu/g

3 分析與討論

3.1 山楂提取物提升斷奶仔豬生長性能、降低腹瀉率 山楂含有多種有機(jī)酸和多酚類， 可以增加胃中酶的分泌和提高消化酶活性， 促進(jìn)胃蠕動及脂肪類食物的消化， 從而增強(qiáng)仔豬的食欲和采食量，促進(jìn)增重。 華瑩等（2011）研究表明，添加3%的山楂粉可提高斷奶仔豬的生長性能， 降低腹瀉率。戴永利等（2006）研究發(fā)現(xiàn)，在生長育肥豬的日糧中添加3%山楂粉能有效增強(qiáng)育肥豬的食欲和采食量，提升日增重，提高飼料利用率。 張美英等（2009）研究發(fā)現(xiàn)，在肉仔雞日糧中添加200 mg/kg山楂提取物可提高肉仔雞生產(chǎn)性能， 提高營養(yǎng)物質(zhì)的消化率和消化酶酶活。 導(dǎo)致仔豬腹瀉的原因非常復(fù)雜， 大腸桿菌和黃金葡萄球菌是其重要病因（成大榮等，2009）。 研究表明，山楂對于大腸桿菌、金黃色葡萄菌等細(xì)菌具有良好的殺菌效果（李小康等，2008；林玲等，2000）。本研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加適宜量的山楂提取物顯著提高了斷奶仔豬的生長性能（FBW、ADG 和ADFI），顯著降低F/G 和腹瀉率，與以上研究結(jié)果一致。仔豬的生長性能和抗腹瀉能力與仔豬機(jī)體的免疫功能和抗氧化能力密切相關(guān)， 因此進(jìn)一步研究了山楂提取物對仔豬免疫功能和抗氧化能力的作用。

3.2 山楂提取物改善斷奶仔豬免疫功能 血清免疫球蛋白含量是反映仔豬免疫功能的重要指標(biāo)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，適宜水平山楂提取物可顯著提高免疫球蛋白IgA 和IgM 含量。這可能與山楂提取物中的熊果酸和山楂黃酮類物質(zhì)有關(guān)。眾所周知免疫球蛋白主要由B 淋巴細(xì)胞產(chǎn)生。 林科等（2007）發(fā)現(xiàn)，山楂熊果酸可促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖，顯著提高脾指數(shù)。 王一倫等（2021）研究發(fā)現(xiàn)，山楂黃酮能激活小鼠脾淋巴細(xì)胞cGMP 和PKC 信號通路，促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖， 從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。因此山楂提取物可能是通過熊果酸和山楂黃酮促進(jìn)仔豬脾淋巴細(xì)胞的增殖， 提升血清中IgA 和IgM 含量，從而改善仔豬免疫功能。

3.3 山楂提取物提高斷奶仔豬抗氧化能力 在應(yīng)激狀況下， 仔豬機(jī)體會產(chǎn)生使其受到氧化損傷的活性氧和自由基，MDA 是反映脂肪氧化損傷程度的重要指標(biāo)， 氧化損傷可以被抗氧酶如CAT、T-SOD、GSH-Px 等緩解。 本研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加適宜水平山楂提取物增加了T-SOD 和GSHPx 活力， 并且降低了斷奶仔豬血清中MDA 的含量，但對T-AOC 和CAT 活力影響不顯著。華瑩等（2011）研究表明，添加3%的山楂粉可提高斷奶仔豬血清SOD，降低血清MDA 的含量。 閆君寶等（2005）研究表明，應(yīng)用6%的山楂水煎劑可明顯降低高脂飲食大鼠空腹血清胰島素和MDA 水平，表明其可增強(qiáng)機(jī)體抗脂質(zhì)氧化作用。以上研究與本試驗(yàn)結(jié)果一致。因此，山楂提取物不僅可通過本身所富含的多酚、黃酮和維生素C 等抗氧化物質(zhì)直接參與抗氧化過程，也能通過提升T-SOD 和GSH-Px 活力間接提高動物機(jī)體抗氧化能力，其提高抗氧化酶活力的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

3.4 山楂提取物改善斷奶仔豬腸道菌群 動物胃腸道內(nèi)正常微生物菌群在維持動物健康和正常生理狀態(tài)，提高動物機(jī)體的抵抗力，抑制潛在病原菌在動物胃腸道的定植等方面發(fā)揮著重要作用（張柏林等，2009）。 本研究發(fā)現(xiàn)，日糧添加適宜山楂提取物可以顯著提高結(jié)腸乳酸桿菌數(shù)量，降低大腸桿菌數(shù)量，但對梭狀芽孢桿菌數(shù)量影響不顯著。 Tadic（2008）研究發(fā)現(xiàn)，山楂乙醇提取物對大鼠胃潰瘍具有一定的防治作用，且體外抑菌試驗(yàn)表明，山楂乙醇提取物具有一定的殺菌活性，特別是某些革蘭氏陽性菌如李氏特菌和微球菌，但對白色念球菌沒有影響。李小康（2008）利用山楂提取液也得出了類似的結(jié)果。 張美英等（2009）研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加山楂提取物能顯著降低回腸、 盲腸中大腸桿菌的數(shù)量，并對空腸、回腸、盲腸中乳酸桿菌等有益菌的增殖有促進(jìn)作用。山楂提取液對保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌生長有促進(jìn)作用（戴遠(yuǎn)臣，2012）。 林玲等（2000）報(bào)道，山楂煎液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠桿菌等有較強(qiáng)的殺滅作用。 孫耀貴等（2013）研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加山楂葉總黃酮具有降低肉仔雞有害菌增殖等作用。以上研究與本試驗(yàn)結(jié)果一致。 這主要是由于山楂提取物富含黃酮、多酚和有機(jī)酸， 能選擇性調(diào)節(jié)腸道中微生物的生長，有利于促進(jìn)有益菌群增殖， 抑制有害菌群的增殖，從而引發(fā)腸道微生態(tài)的改變。同時有益菌的適度增殖有利于產(chǎn)生丁酸、乳酸等小分子酸及細(xì)菌素等抑菌物質(zhì)，這些均有助于動物對抗有害微生物，抵御病原微生物的侵襲。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)條件下， 日糧添加山楂提取物可改善斷奶仔豬免疫功能，提升斷奶仔豬抗氧化能力，改善腸道菌群結(jié)構(gòu)，進(jìn)而降低腹瀉率，提高生長性能，并且山楂提取物的最適添加量為600 mg/kg。