脫水誘導(dǎo)基因RD特性及功能*

龔束芳，初明洋，楊雅涵，喬坤，王金剛

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，哈爾濱 150030)(2020年8月28日收稿；2020年12月7日收修改稿)

RD2、RD17、RD19、RD20、RD21、RD22、RD26、RD28和RD29最初是在脫水處理10 h的模式植物擬南芥(Arabidopsisthaliana)中篩選到的15個(gè)cDNA片段，依其特性將其分為9個(gè)RD[1]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)這類基因受脫水脅迫誘導(dǎo)，但是每個(gè)RD還有各自不同的特點(diǎn)，其中包括脫水脅迫誘導(dǎo)基因表達(dá)量響應(yīng)的時(shí)間不同，以及受到誘導(dǎo)后的表達(dá)量不同等，初步認(rèn)為RD基因的表達(dá)是由不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑誘導(dǎo)。植物的脫水響應(yīng)可能導(dǎo)致激素水平的改變，促使脫落酸(abscisic acid，ABA)的合成，ABA在氣孔關(guān)閉、種子成熟和休眠中起作用[2]。在這些RD基因中，RD22和RD29基因明顯被ABA誘導(dǎo)，而RD19、RD21、RD28沒有顯著的誘導(dǎo)效應(yīng)[1]。RD的功能雖然都與調(diào)節(jié)植物脫水有關(guān)，是一類均對植物脫水脅迫有響應(yīng)的基因，但它們來自不同家族。從1992年發(fā)現(xiàn)至今，陸續(xù)有人對RD基因的功能進(jìn)行研究和報(bào)道，其中，對RD22和RD29這2個(gè)基因在植物應(yīng)對干旱、高鹽及低溫脅迫時(shí)發(fā)揮功能的研究相對較多[1-14]。

脫水脅迫信號與基因表達(dá)之間存在著依賴于ABA和不依賴于ABA的逆境脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑：ABA依賴途徑和非ABA依賴途徑[2]。另外從基因在植物應(yīng)對逆境脅迫時(shí)發(fā)揮的功能角度出發(fā)，RD基因分為功能基因和轉(zhuǎn)錄因子2種類型[3-14]。

ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑下對9個(gè)RD基因分類，發(fā)現(xiàn)RD2、RD17、RD20、RD22、RD26和RD29可被ABA誘導(dǎo)，而RD19、RD21及RD28則不能被ABA誘導(dǎo)，推測在干旱脅迫下這些基因的表達(dá)，至少存在3種獨(dú)立的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[3-14]。如圖1所示，其中2條ABA依賴途徑，1條非ABA依賴途徑，并且在ABA依賴的2條途徑中有1條途徑需要A.thalianamyeloblastosis 2(AtMYB2)和RD22 binding protein1(RD22BP1)2個(gè)蛋白質(zhì)的合成，共同激活RD22基因的表達(dá)[2]。

干旱脅迫下，植物接收信號后分為3種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑：2條ABA依賴途徑；1條非ABA依賴途徑

目前對RD基因的研究，發(fā)現(xiàn)其中RD17、RD20、RD22、RD28和RD29作為功能基因在植物應(yīng)對一些干旱、高鹽和低溫等非生物脅迫時(shí)使植物具有一定的耐受性；而RD19、RD21和RD26則作為轉(zhuǎn)錄因子，一方面也具有耐受一些干旱和高鹽等非生物脅迫的能力，另一方面還對其下游的其他基因起到調(diào)控的作用[3-28]。

1 RD蛋白結(jié)構(gòu)特性

每個(gè)RD都具有調(diào)節(jié)植物脫水的作用，但其結(jié)構(gòu)組成不同。對9個(gè)RD蛋白序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)RD19、RD21與硫醇蛋白酶(cysteine proteinase，CysP)具有顯著的序列相似性，且在同一物種中RD19與RD21的相似性要高于不同物種中RD19之間或RD21之間的相似性，這或許與RD19和RD21這2個(gè)蛋白來自同一家族有關(guān)[3]。RD22與豆科植物種子蛋白(unidentified seed protein，USP)具有一定相似性；RD28編碼一種膜蛋白，與大豆結(jié)節(jié)蛋白26具有局部相似性；RD17編碼的蛋白質(zhì)與ABA誘導(dǎo)相關(guān)蛋白(responsive to ABA，RAB)具有同源性[1]。RD20是Caleosin家族編碼Ca2+的結(jié)合蛋白[12]；RD26是No Apical Meristem，ATAF1，2，和Cup-Shaped Cotyledon 2(NAC)蛋白家族的成員[21]；而RD29與胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白(late embryogenesis abundant，LEA)具有一定的相似性[8]。

如圖2所示，進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)每個(gè)RD蛋白序列之間的相似性不高。但不同物種中的同一蛋白彼此之間具有較高的相似性，說明每種蛋白特性顯著。未發(fā)現(xiàn)與RD1、RD2、RD3、RD5和RD7相關(guān)的研究報(bào)道，而從RD蛋白進(jìn)化關(guān)系也發(fā)現(xiàn)它們之間的特性可能沒有明顯的規(guī)律(圖2A)；同一物種擬南芥中RD19和RD21的相似性較高(圖2B)；不同物種的RD22和RD17表現(xiàn)出較高相似性(圖2C和2F)；同樣地，不同物種的RD20親緣關(guān)系較近(圖2D)；同一物種的2個(gè)蛋白RD19和RD21以及RD29A和RD29B之間的相似性較高(圖2C和2F)。

A表示未報(bào)道的RD蛋白：Sl, Solanum lycopersicum; Ss, Saccharum spontaneum; Gh, Gossypium hirsutum; St, Solanum tuberosum; Gm, Glycine max；B為同一物種中RD19和RD21蛋白：At, Arabidopsis thaliana；C為不同物種中的RD22蛋白：Ks, Knorringia sibirica; As, Apostasia shenzhenica; Eg, Elaeis guineensis; Br, Brassica rapa; Pd, Prunus dulcis; Vv, Vitis vinifera; Ga, Gossypium arboreum; Na, Nicotiana attenuata；D為2個(gè)物種中的RD20蛋白：Bj, Brassica juncea；E表示同一物種中的RD19和RD21：Bp, Bordetella pertussis；F不同物種中的RD17蛋白：Aa, Anthurium amnicola; Pxb, Pyrus x bretschneideri; Pa, Prunus avium; Mn, Morus notabilis; Nc, Nymphaea colorata; Gs, Glycine soja; Es, Eutrema salsugineum; Cr, Capsella rubella; Als, Arabidopsis lyrata subsp. lyrata；G：RD29A和RD29B組成的RD29蛋白；黃線是一個(gè)單獨(dú)的RD26蛋白

為進(jìn)一步分析RD的蛋白序列組成，使用Multiple EM for Motif Elicitation(MEME)軟件進(jìn)行在線預(yù)測(http://meme-suite.org/)。9個(gè)RD的保守基序預(yù)測結(jié)果主要表現(xiàn)為3種類型(圖3)：1)由2個(gè)相似蛋白RD19和RD21組成，且含有3個(gè)共同的基序motif1、motif7和motif8；2)3個(gè)含有保守基序motif3的蛋白RD17、RD29A和RD29B；3)不含有保守基序的4個(gè)RD蛋白RD20、RD22、RD26以及RD28。我們以RD蛋白保守基序的這3種類型為主體，對RD蛋白的結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行介紹。

圖3 RD系統(tǒng)發(fā)育樹分析及蛋白保守域預(yù)測

1.1 相似結(jié)構(gòu)蛋白

Koizumi等[3]預(yù)測轉(zhuǎn)錄因子RD19和RD21分別含有368和462個(gè)氨基酸，二者序列相似性較高，且均與CysP蛋白具有同源性，分別具有表現(xiàn)為Cys161-His297-Asn317和 Cys158-His302-Asn329的催化三元組，這2個(gè)催化三元組是CysP家族的典型特征，也是RD19和RD21蛋白各自的催化位點(diǎn)。另外，發(fā)現(xiàn)RD19基因序列中含111 bp和281 bp的2個(gè)內(nèi)含子；與RD19不同，RD21則含有4個(gè)內(nèi)含子(表1)。RD19和RD21所包含的內(nèi)含子數(shù)目不同，且對應(yīng)的位置也有差異，推測它們可能是CysP家族中不同類型的2個(gè)成員[3]。觀察RD19和RD21 2個(gè)蛋白的基序組成也發(fā)現(xiàn)，預(yù)測的2個(gè)蛋白結(jié)構(gòu)域相似性很高。如圖3所示，motif1、motif7和motif8均存在于RD19和RD21蛋白中。

表1 RD蛋白家族功能特點(diǎn)及結(jié)構(gòu)示意圖

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥RD21由5個(gè)結(jié)構(gòu)域組成：信號肽、自抑制前體蛋白、蛋白酶結(jié)構(gòu)域、富含脯氨酸結(jié)構(gòu)域和顆粒蛋白結(jié)構(gòu)域[4]。而CysP家族的其他成員結(jié)構(gòu)不含有2個(gè)結(jié)構(gòu)域組成的C末端延伸序列、富含脯氨酸的結(jié)構(gòu)域和顆粒蛋白結(jié)構(gòu)域[5]。

1.2 親水性蛋白

脫水誘導(dǎo)蛋白RD17也被叫做冷調(diào)節(jié)蛋白cold-regulated 47(COR47)，含有1 073個(gè)核苷酸，編碼一個(gè)47 kDa的親水性多肽(親水指數(shù)為-1.1)，富含谷氨酸(占20%)和賴氨酸(占14%)(表1)。其多肽不僅與RAB具有較高的同源性，同時(shí)還與LEA蛋白序列相近：它具有絲氨酸簇(稱為S段)和富含賴氨酸(稱為K段)的重復(fù)序列，但不含半胱氨酸和色氨酸，RD17是一種酸性蛋白質(zhì)[6-7]。

Yamaguchi-Shinozaki和Shinozaki[8]通過基因組結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，在RD29上8 kb區(qū)域存在2個(gè)串聯(lián)的蛋白，將其分別命名為RD29A和RD29B(表1)。RD29A也稱為脫水素(low-temperature-induced，LTI78)蛋白或COR78[9]，而RD29B被稱為LTI65[10]，且2個(gè)基因均含有3個(gè)相近位置的內(nèi)含子。RD29A由711個(gè)氨基酸組成，RD29B含604個(gè)氨基酸，在RD29A中有一個(gè)112個(gè)氨基酸組成的2個(gè)重復(fù)序列(GFGDESGAELE KDFPTRSHD…GNFPVRSHELDLKNESDIDK)，而RD29B中未發(fā)現(xiàn)這段序列[8]。RD29A和RD29B蛋白都具有極強(qiáng)的親水性，并且2個(gè)蛋白結(jié)構(gòu)均與LEA蛋白具有一定的相似性，說明RD29的2個(gè)蛋白可能參與低溫脅迫誘導(dǎo)[8]。

我們不得不承認(rèn)，現(xiàn)代詩的進(jìn)一步成就的學(xué)習(xí)不能僅僅依靠課堂上的幾十分鐘，現(xiàn)代詩的美和它的寫作藝術(shù)都是值得我們學(xué)習(xí)和考究的。戴望舒在《雨巷》的創(chuàng)作中，不僅將中國詩歌的典雅清韻運(yùn)用得淋漓盡致，而且還將國外現(xiàn)代詩的精華與之結(jié)合，這無疑將現(xiàn)代詩向前推進(jìn)了一大步。他的大膽和勇敢造就了他，也成就了《雨巷》，成為現(xiàn)代詩的絕唱，使得無數(shù)讀者被它的美所感染。

RD29B對低溫脅迫的耐受性低于RD29A[10]，而RD17對植物類囊體膜具有低溫保護(hù)作用[23]。如圖3所示，RD17、RD29A和RD29B均含有motif3。此外，2個(gè)RD29還含有motif2、motif5和motif6，且2個(gè)RD29蛋白的主要區(qū)別是motif2基序的數(shù)量不同，而RD17蛋白僅含有motif3基序。

1.3 不含有保守基序的蛋白

RD蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果顯示，RD20、RD22、RD26和RD28這4個(gè)蛋白中未發(fā)現(xiàn)保守結(jié)構(gòu)域。擬南芥RD20是能與Ca2+結(jié)合的蛋白，其cDNA包含一個(gè)708 bp的開放閱讀框，并編碼一個(gè)由236個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，預(yù)測分子量為26.6 kDa[11]。盡管暫時(shí)未有報(bào)道與RD20同源的其他蛋白，但是如表1所示，Takahashi等發(fā)現(xiàn)它的氨基酸序列包含一個(gè)與鈣結(jié)合域(EF-hand motif)高度同源的序列[11]，并有研究發(fā)現(xiàn)RD20編碼的蛋白質(zhì)屬于鈣蛋白(Caleosin)家族，是油脂體(oil body，OB)相關(guān)蛋白[12]。RD20也被叫做鈣依賴(A.thalianacaleosin 3，AtCLO3)蛋白，具有作為過氧化酶所需的所有生化特性[13]。

RD22蛋白在很多物種中均被研究，如：擬南芥[14]、西伯利亞蓼(PolygonumsibiricumLaxm)[15]、檉柳(TamarixchinensisLour)16]、秋茄(Kandeliacandel(Linn.)Druce)[17]以及玉米(ZeamaysL.)等[18]。RD22的氨基酸序列數(shù)目大約為375～455[14-18]。其結(jié)構(gòu)主要包括4個(gè)區(qū)域(表1)：1)N 端疏水區(qū)；2)簡短的保守區(qū)域；3)重復(fù)序列區(qū)域；4)保守的BURP(BNM2、USP、RD22和PG1β)結(jié)構(gòu)域，即C端含有一個(gè)由200多個(gè)氨基酸組成的保守區(qū)域X5-CH-X10-CH-X23-27-CH-X8-W[8,18]。RD22的N端疏水區(qū)序列(前20個(gè)左右的氨基酸)因不同物種而存在較大差異，接下來約20個(gè)氨基酸序列較保守，其下游一般存在3～5個(gè)長度約19個(gè)氨基酸的重復(fù)序列(T-V-VG-GGV--)[15]。雖然這個(gè)重復(fù)序列因物種的不同而有所差異，但這7個(gè)固定的氨基酸殘基可能在維持 BURP 類蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能上起重要作用[19]。

轉(zhuǎn)錄因子RD26是植物特異性NAC家族成員，又名ANAC072，編碼297個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量為32.7 kDa，如表1所示，其N-末端NAC結(jié)構(gòu)域分別包含一12個(gè)氨基酸和一66個(gè)氨基酸的預(yù)測核定位信號(nuclear localization signals，NLS)序列[20-21]。

擬南芥RD28編碼質(zhì)膜水通道蛋白(aquaporin)，最初是在擬南芥中發(fā)現(xiàn)的一種脫水脅迫誘導(dǎo)蛋白，其氨基酸序列包含2段高度保守的膜間序列[1]。如表1所示，該基因編碼主要內(nèi)源性蛋白(major intrinsic protein，MIP)家族成員，其成員在促進(jìn)小分子在膜上的擴(kuò)散方面具有一定功能[22]。

RD蛋白保守結(jié)構(gòu)域的預(yù)測結(jié)果顯示，RD20、RD22、RD26和RD28這4個(gè)蛋白中不含保守基序，且其他5個(gè)RD蛋白的保守基序也存在差異，這可能與RD基因功能的差異性有關(guān)。

2 基因功能研究

目前對RD基因研究，發(fā)現(xiàn)其主要受干旱、高鹽以及低溫等非生物脅迫的影響；除非生物脅迫，RD基因還受到一些生物脅迫的影響，包括參與植物的免疫、衰老等。

2.1 非生物脅迫

2.1.1 干旱、高鹽、低溫誘導(dǎo)響應(yīng)基因

9個(gè)RD基因中，RD17、RD29A和RD29B受干旱、高鹽和低溫脅迫誘導(dǎo)，但其表達(dá)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑不同。有研究發(fā)現(xiàn)RD17受ABA和干旱脅迫誘導(dǎo)[7]，且對低溫脅迫也有一定的響應(yīng)[6]。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，RD17對類囊體膜具有低溫保護(hù)作用[23]，且能提高植物的抗凍性，推測RD17可能在低溫脅迫下作為一種膜穩(wěn)定劑發(fā)揮功能[24]。

Msanne等[25]研究證實(shí)低溫能夠誘導(dǎo)RD29A基因的表達(dá)，此外，在干旱和高鹽脅迫下，RD29A也受到較強(qiáng)的誘導(dǎo)。其啟動子中包含的順勢作用元件，在植物應(yīng)對干旱、高鹽或低溫條件時(shí)能夠調(diào)控RD29A的表達(dá)，其中一個(gè)脫水反應(yīng)元件dehydration-responsive element(DRE)在RD29A對環(huán)境信號的第一次快速響應(yīng)中起作用[26]。Nakashima等[27]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)去除RD29A啟動子中的ABA應(yīng)答元件ABA-responsive element(ABRE)而只保留DRE元件，在干旱、高鹽或低溫脅迫條件下同樣也能誘導(dǎo)RD29A基因的表達(dá)，表明這一過程不受ABA的調(diào)控。隨后進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)ABRE結(jié)合蛋白acid-responsive element binding 1(AREB1)和AREB2能與RD29A啟動子中的ABRE結(jié)合，而2個(gè)獨(dú)立的DRE結(jié)合蛋白DER-biding 1(DREB1)和DREB2在2種不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起著不同作用：DREB1受低溫脅迫誘導(dǎo)，而DREB2對干旱和高鹽脅迫有響應(yīng)[28]。此外，DRE在ABA誘導(dǎo)途徑中也作為ABRE的偶聯(lián)因子發(fā)揮作用，即DREB蛋白可能與AREB蛋白在RD29A的ABA依賴性基因表達(dá)中起協(xié)同作用[28]。這表明，RD29A的上游啟動子序列中DRE和ABRE元件可以通過分別驅(qū)動調(diào)控脅迫轉(zhuǎn)錄因子DREB1A、DREB2A以及AREB1、AREB2的表達(dá)，在植物應(yīng)對非生物脅迫時(shí)發(fā)揮重要作用[25]。也有研究將RD29A的啟動子與GUS基因融合后轉(zhuǎn)入擬南芥，發(fā)現(xiàn)與對照相比，脫水和冷處理后GUS基因在擬南芥的所有器官中表達(dá)[9,26]。

雖然RD29A和RD29B均受到這3種非生物脅迫的誘導(dǎo)，但它們對這些刺激的響應(yīng)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑不同。RD29B啟動子的-169到-51區(qū)域是誘導(dǎo)該基因脫水表達(dá)的調(diào)控區(qū)，還發(fā)現(xiàn)2個(gè)ABRE-like序列以及1個(gè)MYB(PyAACT/GG)序列[26]。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，在植物脫水條件下這2個(gè)ABRE在RD29B的表達(dá)中起正調(diào)控作用[29]。RD29B基因的表達(dá)同樣依賴于ABA的誘導(dǎo)，逆境脅迫會促使細(xì)胞內(nèi)ABA含量增加，激活basic leucine zipper(bZIP)轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控bZIP與ABRE的相互作用，促進(jìn)RD29B基因的表達(dá)[30]。與RD29A基因不同，RD29B主要受干旱和ABA誘導(dǎo)，對低溫脅迫響應(yīng)不明顯，且這種低溫脅迫不是由ABA本身誘導(dǎo)完成，而是由ABA合成途徑中代謝物參與誘導(dǎo)[10,26]。

RD22是脫水誘導(dǎo)基因RD中的典型成員。最初，RD22是一個(gè)在ABA信號通路下受干旱脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的基因[1]。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)RD22是一種多因子誘導(dǎo)型基因，受低溫、高鹽、干旱等脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)[15-19]。擬南芥RD22基因側(cè)翼區(qū)-207到-141的67 bp區(qū)域內(nèi)包含2個(gè)myelocytomatosis(MYC)識別位點(diǎn)和1個(gè)myeloblastosis(MYB)識別位點(diǎn)，對位點(diǎn)進(jìn)行堿基替換，發(fā)現(xiàn)第2個(gè)MYC位點(diǎn)可能是RD22啟動子的負(fù)調(diào)控因子，而第1個(gè)MYC位點(diǎn)和MYB位點(diǎn)在RD22基因的脫水反應(yīng)表達(dá)中都起正調(diào)控作用[31]。此外，ABA響應(yīng)元件(RYACGTGGYR)也與RD22基因參與干旱誘導(dǎo)及ABA應(yīng)答有關(guān)[32]。由此可知，擬南芥RD22的誘導(dǎo)表達(dá)是由ABA介導(dǎo)。RD22對ABA依賴性表達(dá)需要蛋白質(zhì)的生物合成[14]，其第1個(gè)MYC識別位點(diǎn)特異性結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子RD22BP1能被干旱、高鹽和ABA誘導(dǎo)，并能與MYB識別位點(diǎn)結(jié)合的AtMYB2基因協(xié)同激活RD22基因的轉(zhuǎn)錄[33]。目前在除擬南芥的其他植物中有研究報(bào)道，將檉柳和秋茄的RD22轉(zhuǎn)入煙草中均提高了煙草的耐鹽性[10,17]。大豆GmRD22的表達(dá)在滲透脅迫下能參與植物細(xì)胞的防護(hù)，并能減少NaCl和PEG處理對轉(zhuǎn)基因擬南芥根系伸長的負(fù)面影響，且提高轉(zhuǎn)基因水稻在NaCl和干旱脅迫下的存活率；另外在鹽脅迫下，GmRD22轉(zhuǎn)基因植株的木質(zhì)素含量還會明顯高于野生型，推測木質(zhì)素含量增加，會提高細(xì)胞壁對水分的固定，從而提高耐鹽脅迫能力[34]。但是研究發(fā)現(xiàn)西伯利亞蓼RD22的過表達(dá)并沒有提高煙草的耐鹽堿性[15]。葡萄中3個(gè)RD22基因?qū)Σ煌{迫的耐受性也不盡相同，VvRD22b和VvRD22c基因均受ABA調(diào)控，但是在近期的研究中發(fā)現(xiàn)VvRD22a不受ABA誘導(dǎo)表達(dá)[35]。3個(gè)葡萄VvRD22基因在鹽處理下均有響應(yīng)，但表達(dá)量不同[36]。這些結(jié)果表明RD22基因在不同物種中對非生物脅迫的耐受性存在一定的差異，且在同一物種的多個(gè)RD22基因?qū)δ承┟{迫處理也會表現(xiàn)出不同的耐受性。

2.1.2 同一途徑RD20和RD26的脅迫應(yīng)答

同樣受ABA信號誘導(dǎo)的2個(gè)基因RD20和RD26在應(yīng)對非生物脅迫時(shí)也表現(xiàn)不同。研究發(fā)現(xiàn)，在擬南芥RD20的1-kbp 5′側(cè)翼啟動子區(qū)，存在3個(gè)ABRE序列，表明RD20可能受ABA依賴的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控，隨后還發(fā)現(xiàn)有DRE的存在，所以推測RD20是一種由ABA誘導(dǎo)的干旱脅迫相關(guān)基因[11-12,37]。擬南芥RD20在植株的角果、莖、花和葉中表達(dá)，但在根和成熟種子中未檢測到[11]。在脫水條件下，RD20基因在花和葉中被強(qiáng)烈誘導(dǎo)[11]。這些結(jié)果表明，RD20可能在擬南芥脫水脅迫下的氣生組織中發(fā)揮作用，特別是在葉片和花中[11]。

Fujita等[20]發(fā)現(xiàn)RD26是一個(gè)由4個(gè)ABREs、1個(gè)DRE、2個(gè)MYB和1個(gè)MYC調(diào)節(jié)的ABA依賴性表達(dá)基因。另外在NaCl處理的ABA突變體中，仍然觀察到RD26受誘導(dǎo)顯著，意味著存在一種與ABA無關(guān)的NaCl信號通路涉及RD26的表達(dá)[20]。研究表明干旱、ABA和高鹽均可以誘導(dǎo)RD26基因的表達(dá)。此外，RD26還對茉莉酸甲酯、H2O2和玫瑰紅這類能產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species，ROS)的物質(zhì)敏感；過表達(dá)RD26還誘導(dǎo)許多應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)，如對干旱和高鹽脅迫有耐受性的RAFL06-15-P15、RAFL05-02-O17、RAFL06-13-E03以及RD20等[20-21]。GUS染色后的組織定位結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RD26啟動子在脫水后擬南芥植株的所有營養(yǎng)組織中都有表達(dá)[20]，ABA處理時(shí)，啟動子調(diào)控GUS不僅在葉片中表達(dá)，而且在轉(zhuǎn)基因植株的根中也有較低水平的作用[21]。

2.1.3 非ABA途徑響應(yīng)基因

此外，RD相關(guān)基因中有3個(gè)基因的表達(dá)不受ABA信號通路的調(diào)控，這3個(gè)基因分別是RD19、RD21和RD28。研究發(fā)現(xiàn)RD19和RD21受干旱和高鹽脅迫誘導(dǎo)后表達(dá)量提高，但不受低溫、高溫和ABA誘導(dǎo)[3]。此外，水通道蛋白能夠增加細(xì)胞膜的滲透性，擬南芥質(zhì)膜水通道蛋白RD28的表達(dá)可使非洲爪蟾卵母細(xì)胞的吸水率提高10～15倍[38]。同樣，在盤基網(wǎng)柄菌的營養(yǎng)細(xì)胞中過表達(dá)RD28，當(dāng)細(xì)胞懸浮在蒸餾水中時(shí)，蒸餾水能夠快速的被營養(yǎng)細(xì)胞吸收[39]。Huang等[40]發(fā)現(xiàn)RD28蛋白主要作用在保衛(wèi)細(xì)胞質(zhì)膜上且與氣孔運(yùn)動有關(guān)，在植物受到干旱脅迫時(shí)，RD28能夠抑制氣孔開放，減少水分散失，保護(hù)植物正常生長。綜上，當(dāng)植物處于缺水狀態(tài)時(shí)，RD28可以通過增加細(xì)胞的吸水能力，或者關(guān)閉氣孔減少水分輸出，進(jìn)一步緩解植物的缺水狀況。

2.2 生物脅迫

除非生物脅迫外，有些RD蛋白還受一些生物脅迫誘導(dǎo)。RD20的表達(dá)被某些病原體誘導(dǎo)，過表達(dá)RD20的植株主要還表現(xiàn)在葉片角質(zhì)層蠟質(zhì)組分的改變(含有更多的烷烴和醛)和對病菌(油菜鏈格孢菌和丁香假單胞菌)的抗性增強(qiáng)[41]。它的主要功能是產(chǎn)生調(diào)節(jié)氧化狀態(tài)和細(xì)胞死亡的脂蛋白[41]。Bernoux等[42]發(fā)現(xiàn)，擬南芥RD19能作為陽性轉(zhuǎn)錄因子，同時(shí)作為效應(yīng)器青枯菌Ⅲ型無毒效應(yīng)子蛋白(Pseudomonas outer protein P2，PopP2)引發(fā)青枯菌resistant to ralstonia solanacearum 1-R(RRS1-R)產(chǎn)生抗性的關(guān)鍵宿主因子，從而緩解青枯病對農(nóng)作物的損害。

CysP家族的成員RD21除參與非生物脅迫外，還參與到植物免疫、衰老等各種生物脅迫中。RD21能夠促進(jìn)細(xì)胞死亡，AtSerpin1作為一種擬南芥蛋白酶抑制劑，通過確定控制RD21活性的位點(diǎn)以及限制細(xì)胞死亡過程中所引起的損傷，進(jìn)一步控制RD21的活性，從而阻止RD21的促死亡功能，保護(hù)植物正常生長[43-44]。此外，Shindo等發(fā)現(xiàn)RD21對壞死營養(yǎng)性病原菌產(chǎn)生免疫[45]，另有研究者發(fā)現(xiàn)RD21是伏馬菌素(fumonisin B1，F(xiàn)B1)誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的負(fù)調(diào)控因子[46]。同樣地，RD26也被認(rèn)為在植物的防御和衰老中起關(guān)鍵作用[20]。比如在植物衰老過程中：1)RD26可以直接激活葉綠體囊泡，編碼一種對葉綠體蛋白降解至關(guān)重要的酪蛋白分解蛋白酶(caseinolytic protease D，ClpD)，伴隨著RD26在植物衰老時(shí)期的過度表達(dá)，導(dǎo)致大量酪蛋白損失；相比較而言，RD26敲除突變體中蛋白質(zhì)的損失較少[47]。2)RD26還直接激活參與賴氨酸分解代謝的賴氨酸酮戊二酸還原酶/酵母氨酸脫氫酶(lys ketoglutaratereductase/saccharopine dehydrogenase，LKR/SDH)以及對植物降解重要的pescadillo 1(PES1)蛋白，通過誘導(dǎo)LKR/SDH表達(dá)在植物衰老過程中促進(jìn)賴氨酸降解和加速植物醇分解代謝，幫助植物在衰老過程中維持線粒體呼吸[47]；代謝圖譜顯示RD26過表達(dá)導(dǎo)致γ-氨基丁酸(Gamma aminobutyric acid，GABA)減少，同時(shí)相應(yīng)的分解代謝基因也被誘導(dǎo)，而GABA的降解也有助于維持衰老過程中的線粒體呼吸[47]。3)RD26還能直接參與碳水化合物代謝和增強(qiáng)轉(zhuǎn)運(yùn)的amylase1(AMY1)、superfamilyprotein1(SFP1)和SWEET15的表達(dá)，促進(jìn)淀粉降解和衰老過程中單糖和雙糖的累積[47]?？傊?，在衰老過程中，RD26通過調(diào)控細(xì)胞降解層次譜中基因的表達(dá)發(fā)揮作用[47]。

3 展望

通過對RD調(diào)查研究，發(fā)現(xiàn)RD相關(guān)基因既具有典型的功能特征，又表現(xiàn)多元化的功能特點(diǎn)，了解RD參與的信號通路，有助于掌握RD基因的功能，我們將其總結(jié)如下(圖4)。RD19、RD21和RD28基因受干旱脅迫下非ABA信號通路誘導(dǎo)，它們通過第二信使，如蛋白激酶的作用與脫水響應(yīng)元件結(jié)合，激活基因表達(dá)[2]，其余6個(gè)RD基因均受ABA信號的誘導(dǎo)，其中RD20、RD26和RD29B主要受ABRE元件的調(diào)控在ABA通路下發(fā)揮作用[20,29,37]，而RD20和RD26作為轉(zhuǎn)錄因子還與DRE元件結(jié)合，誘導(dǎo)基因表達(dá)[12,21]。在ABA信號通路下RD22基因比較特殊，在干旱和鹽脅迫下MYB與AtMYB2蛋白結(jié)合后，同與RD22BP1蛋白質(zhì)結(jié)合的MYC元件共同激活RD22發(fā)揮作用[31,33]。此外，RD17和RD29A基因同屬于COR家族，這是由于冷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子DREB1與DRE元件結(jié)合，使它們對冷脅迫產(chǎn)生一定的耐受性[7,26]；另一個(gè)受干旱和鹽脅迫誘導(dǎo)的DREB2轉(zhuǎn)錄因子與AREB2相互作用，使RD17和RD29A對低溫、干旱和鹽脅迫均表現(xiàn)出耐受性[25,27-28]。

圖4 9個(gè)RD基因應(yīng)對非生物脅迫的表達(dá)調(diào)控網(wǎng)路

RD29A啟動子作為一種誘導(dǎo)型啟動子，在提高作物抗逆性的基因工程研究中起作用。研究基因的功能，是為了更好地利用基因，在分子或生理水平應(yīng)對人們不同的需求，調(diào)控不同植物在抗逆性上更好地發(fā)揮其功能。比如：1)目前RD29對非生物脅迫的響應(yīng)已被用作監(jiān)測植物脅迫響應(yīng)途徑的分子標(biāo)記，利用RD29A作為標(biāo)記基因，用于識別與應(yīng)激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的新分子[48]。Cheong等[49]檢測到鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶B亞基蛋白(calcineurin B-like 5，CBL5)的過表達(dá)能改變脅迫基因的表達(dá)(如RD29A，RD29B和Kin1)，并證明CBL5可能是植物鹽或干旱響應(yīng)的調(diào)節(jié)因子。2)RD29A啟動子還可以提高植物的抗逆性，并整合了許多應(yīng)激信號[48]。例如，有研究發(fā)現(xiàn)利用RD29A啟動子，可以最大限度地減少35 S啟動的膨大蛋白基因(Tobaccoβ-expansion23，TaEXPB23)這種組成性基因表達(dá)的負(fù)面影響，還能提高植物的抗旱性[50-51]。利用RD29A啟動子具有抗逆性這一特點(diǎn)，可以整合不同基因，豐富基因功能。

過表達(dá)RD26能誘導(dǎo)應(yīng)激相關(guān)基因RD20表達(dá)[21]，但有關(guān)2個(gè)基因的誘導(dǎo)路徑還不清楚，探究2個(gè)基因之間的關(guān)聯(lián)對進(jìn)一步了解RD基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)有幫助。RD19和RD21均來自CysP家族[3]，如圖2所示，同一物種中2個(gè)蛋白的相似性高于同一蛋白在不同物種中，進(jìn)一步研究2個(gè)基因在同一物種中的關(guān)聯(lián)，有助于了解CysP家族功能。此外，RD22基因在擬南芥[14]、西伯利亞蓼[15]、檉柳[16]、秋茄[17]以及玉米等[18]多個(gè)植物中的功能已經(jīng)有很多研究，發(fā)現(xiàn)在每種植物中該基因?qū)Ψ巧锩{迫的耐受性不同，研究更多物種中RD22基因功能有助于分析基因?qū)Ψ巧锩{迫耐受性與物種的關(guān)系。

RD相關(guān)基因研究開展較早，但由于其基因功能較為顯著，后期對RD基因的研究較少。但是還有很多RD沒有被研究，仍然有很多疑問等待解決。比如RD基因結(jié)構(gòu)和功能之間的關(guān)聯(lián)，亞細(xì)胞定位與時(shí)空表達(dá)的特性等問題，對于是否存在其他誘導(dǎo)路徑下的基因表達(dá)，以及每個(gè)基因之間的關(guān)聯(lián)都需要進(jìn)一步的研究來證實(shí)。