響應(yīng)面法優(yōu)化大豆分離蛋白提取及復(fù)合酶解制備活性肽

孫會(huì)剛，陳志軒，周中馳，李凡松，王繼良，張傳麗，陳學(xué)紅，李同祥*

(1.徐州工程學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，江蘇 徐州 221018;2.廊坊農(nóng)林科學(xué)院，河北 廊坊 065000)

大豆蛋白活性肽不但可以為人體提供大豆所能提供的營(yíng)養(yǎng)成分，而且由于其自身特有的各種功能特性被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)與醫(yī)療領(lǐng)域[1]。目前而言，美國(guó)和日本在大豆蛋白活性肽研究方面遙遙領(lǐng)先世界其他國(guó)家，他們使用大豆蛋白活性肽作為原料用于生產(chǎn)幼兒食品、面包、飲料、運(yùn)動(dòng)員專用食品等多種食品。大豆活性肽在國(guó)外也常常作為功能保健食品的主要配料使用[2]。盡管我國(guó)大豆資源豐富，但是，我國(guó)的技術(shù)工藝不夠成熟，所以目前對(duì)大豆蛋白活性肽的研究探索始終處于初級(jí)開發(fā)應(yīng)用階段。雖然也取得了一些成效，大豆蛋白活性肽也可以進(jìn)行工業(yè)化大規(guī)模的生產(chǎn)，但是市場(chǎng)上的大豆蛋白活性肽產(chǎn)品還較少，根本不能滿足不斷增加的市場(chǎng)需求量，更無法與美、日兩國(guó)媲美[3]。

利用大豆分離蛋白制備活性肽，首先要獲得較高大豆蛋白的提取率，目前報(bào)道的大豆分離蛋白提取方法主要有酶解酸沉法[4]、膜分離法[5-7]及堿提酸沉法[8-9]等。但在大豆深加工領(lǐng)域，由于成本低、技術(shù)水平要求低等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用最多的仍然是堿提酸沉法。對(duì)于大豆分離蛋白提取方法的優(yōu)化已有相關(guān)報(bào)道，但多數(shù)采用單因素或者正交的方法對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化，而且涉及的影響因素也不夠全面，本文采用響應(yīng)曲面優(yōu)化法對(duì)大豆分離蛋白提取的影響因素進(jìn)行較全面的研究，有望更好地提高提取率。

為了獲得高抗菌活性的大豆肽，本研究對(duì)大豆分離蛋白的提取方法進(jìn)行優(yōu)化，采用復(fù)合酶酶解法獲得了高抗菌活性的大豆肽，為開發(fā)新型具有防腐保鮮及保健功能的食品添加劑提供了新的思路和資源。

1 材料與方法

1.1 材料

黃豆：來自廊坊農(nóng)科院。

胰蛋白酶(豬胰)：購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；糜蛋白酶：購(gòu)自南京都萊生物技術(shù)有限公司；其余試劑：均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：根據(jù)參考文獻(xiàn)[10]制作。

1.2.2 大豆分離蛋白的提取

取適量黃豆去雜、烘干、粉碎、過篩，加入無菌水，液料比為10∶1，用NaOH調(diào)節(jié)pH值為堿性，水浴加熱并攪拌，7000 r/min離心15 min去渣，重復(fù)3次，取上清；HCl調(diào)pH值為酸性，水浴加熱并攪拌，7000 r/min離心15 min去渣，重復(fù)3次，取上清，加水溶解沉淀，用透析袋透析大豆分離蛋白水溶液過夜，真空冷凍干燥獲得粗蛋白。

蛋白質(zhì)提取率=提取的粗蛋白重量/原料大豆重量。

1.2.3 大豆分離蛋白提取的單因素優(yōu)化

根據(jù)報(bào)道，大豆分離蛋白提取主要受堿提pH值、堿提時(shí)間、堿提溫度和酸沉pH的影響。因此，以大豆分離蛋白提取率為考察指標(biāo)，分別考察堿提pH(8，9，10，11，12)、堿提時(shí)間(40，50，60，70，80 min)、堿提溫度(30，40，50，60，70 ℃)和酸沉pH(2.5，3.5，4.5，5.5，6.5)對(duì)大豆分離蛋白提取率的影響。

1.2.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化大豆分離蛋白提取

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取堿提時(shí)間、堿提溫度、堿提pH、酸沉pH 4個(gè)變量為響應(yīng)因子，以大豆分離蛋白提取率為響應(yīng)值，采用Design Expert 8.0軟件設(shè)計(jì)四因素三水平響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)[11-12]。分析各自變量對(duì)大豆分離蛋白提取率的顯著性，建立數(shù)學(xué)模型，進(jìn)行方差分析及回歸分析，確定堿提酸沉法提取大豆分離蛋白的最佳工藝參數(shù)。實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素及水平Table 1 The factors and levels of response surface test

1.2.5 大豆分離蛋白酶解實(shí)驗(yàn)

取大豆分離粗蛋白2.0 g，加入無菌水60 mL攪拌溶解，90 ℃水浴10 min滅菌，溫度降到室溫后用 1 mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值為7.5，按4000 U/g加入酶，45 ℃水浴4 h，沸水浴20 min使酶滅活，7000 r/min離心15 min去沉淀，重復(fù)3次，上清液即為酶解液。復(fù)合酶解所用到的酶及其性質(zhì)見表2。

表2 實(shí)驗(yàn)所用酶的性質(zhì)Table 2 The properties of the enzymes used in the test

1.2.6 活性肽抑菌實(shí)驗(yàn)

用牛津杯法測(cè)定活性肽的抑菌活性[13]。

1.2.7 活性肽的抗氧化活性

采用比色法進(jìn)行定量分析[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆分離蛋白的提取優(yōu)化

2.1.1 堿提pH值對(duì)大豆分離蛋白提取率的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：堿提pH值對(duì)大豆分離蛋白提取率有較明顯的影響，見圖1。

圖1 堿提pH對(duì)大豆分離蛋白提取率的影響Fig.1 Effect of alkali extraction pH on extraction rate of soybean protein isolate

由圖1可知，當(dāng)pH值為8～11時(shí)，大豆分離蛋白的提取率隨著pH值的升高而升高，pH值為11時(shí)提取率最高，為28.15%。繼續(xù)增加pH值，提取率反而會(huì)下降，且下降較明顯。提取率在pH 9～11之間變化幅度較小，所以響應(yīng)面優(yōu)化中堿提pH值的變量選取9，10，11。

2.1.2 堿提時(shí)間對(duì)大豆分離蛋白提取率的影響

圖2 堿提時(shí)間對(duì)大豆分離蛋白提取率的影響Fig.2 Effect of alkali extraction time on extraction rate of soybean protein isolate

堿提時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)的提取率有一定影響但不明顯，提取率數(shù)值變化幅度較小。由圖2可知在40～70 min時(shí)，提取率緩慢上升；超過70 min后，蛋白質(zhì)提取率下降且下降幅度大，蛋白質(zhì)在堿提70 min左右達(dá)到平衡狀態(tài)；超過70 min，則會(huì)浸出許多非蛋白質(zhì)物質(zhì)，影響所得蛋白質(zhì)的純度，進(jìn)而影響蛋白提取效率，而且蛋白質(zhì)長(zhǎng)時(shí)間處于堿性環(huán)境下自身質(zhì)會(huì)水解變性，蛋白提取效率也會(huì)下降。響應(yīng)面優(yōu)化蛋白質(zhì)堿提時(shí)間變量為50，60，70 min。

2.1.3 堿提溫度對(duì)大豆分離蛋白提取率的影響

堿提溫度對(duì)蛋白質(zhì)的提取率有一定影響，且影響也明顯。由圖3可知，隨著溫度不斷上升，蛋白質(zhì)提取率呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，在30～50 ℃范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)速率不斷加快，大量蛋白質(zhì)分子進(jìn)入堿提液，蛋白質(zhì)提取率從27.25%提高到28.25%。溫度超過50 ℃后，蛋白質(zhì)提取率開始降低，70 ℃時(shí)提取率為27.65%。這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)在高溫下變性，從而打破分子表面?zhèn)孺溁鶊F(tuán)與水分子相互作用力的平衡，堿提液的黏度增加，不利于蛋白質(zhì)的溶出[15]。響應(yīng)面優(yōu)化蛋白質(zhì)提取溫度選取40，50，60 ℃。

圖3 堿提溫度對(duì)大豆分離蛋白提取率的影響Fig.3 Effect of alkali extraction temperature on extraction rate of soybean protein isolate

2.1.4 酸沉pH對(duì)大豆分離蛋白提取率的影響

酸沉pH對(duì)大豆分離蛋白提取率有一定影響。由圖4可知，大豆分離蛋白在其等電點(diǎn)pH 4.5附近提取率最大，這是因?yàn)榇藭r(shí)大豆蛋白表面所攜帶的正、負(fù)電荷數(shù)量相差不大，呈電中性，蛋白質(zhì)分子之間靜電斥力大大減弱，反而增強(qiáng)了與水分子之間的相互作用力，此時(shí)蛋白質(zhì)分子會(huì)聚集沉淀。此外在強(qiáng)酸條件下，肽鍵會(huì)被破壞，導(dǎo)致多肽鏈縮短，蛋白質(zhì)沉淀會(huì)逐漸消失，所以在pH為2.5時(shí)，酸沉無沉淀。響應(yīng)面優(yōu)化蛋白質(zhì)酸沉pH變量為3.5，4.5，5.5。

圖4 酸沉pH對(duì)大豆分離蛋白提取率的影響Fig.4 Effect of acid precipitation pH on extraction rate of soybean protein isolate

2.2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，通過響應(yīng)面設(shè)計(jì)法中的Box-Behnken對(duì)大豆分離蛋白提取進(jìn)行優(yōu)化。在29個(gè)實(shí)驗(yàn)組合條件下，設(shè)計(jì)方案和結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、預(yù)測(cè)值及結(jié)果Table 3 Response surface test design, predicted values and results

續(xù) 表

2.3 模型的建立與顯著性分析

采用Design Expert 8.0軟件可得響應(yīng)值和被檢變量的邏輯關(guān)系。獲得大豆分離蛋白提取的二次多元回歸方程(Y)為：Y=28.32+2.55A+0.63B+0.17C-0.22D+0.4AB+0.18AC+0.36AD-0.33BC+0.11BD-0.075CD-1.61A2-1.57B2-0.32C2+6.67×10-3D2。

利用軟件進(jìn)一步對(duì)模型進(jìn)行分析以驗(yàn)證其有效性，模型的方差分析和顯著性分析見表4。

表4 回歸方程方差分析和顯著性檢驗(yàn)Table 4 Analysis of variance and significance test of regression equation

由表4方差分析結(jié)果可知，在該實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，響?yīng)值的決定系數(shù)(R2)為98.38%，表明蛋白質(zhì)提取率中有98.38%的變化可以使用該模型解釋。RAdj2=96.75%，表明大豆分離蛋白提取模型能在96.75%程度上解釋實(shí)驗(yàn)結(jié)果，僅有3.25%不能用該模型表示。失擬項(xiàng)不顯著(P>0.05)，說明該模型擬合度較好。其中P值越小，則表明該變量對(duì)提取率的影響越大：A與B的P值小于0.0001，C與D的P值大于0.05，由此可知影響蛋白提取率的主要因素是堿提pH值與酸沉pH值，而堿提時(shí)間、堿提溫度對(duì)大豆分離蛋白提取的影響較小。

圖5 大豆分離蛋白影響因素三維響應(yīng)曲面圖Fig.5 Three-dimensional response surface diagrams of influencing factors of soybean protein isolate

由圖5可知，隨著堿提溫度不斷上升、堿提時(shí)間增加，蛋白提取率都呈先升后降的趨勢(shì)且曲面變化幅度小，所以堿提溫度和堿提時(shí)間兩因素對(duì)蛋白提取率的影響很小。酸沉pH值不斷升高，蛋白提取率呈先升后降的趨勢(shì)且在蛋白質(zhì)等電點(diǎn)附近達(dá)到最高點(diǎn)，曲面整體變化幅度非常大，表明酸沉pH對(duì)蛋白提取率的影響很大。堿提pH值曲面變化幅度類似酸沉pH值的變化幅度，又比堿提溫度、堿提時(shí)間的變化幅度略大。所以酸沉pH值與堿提pH值對(duì)黃豆中大豆分離蛋白提取率的影響最大，堿提溫度與堿提時(shí)間的影響最小。

由此模型預(yù)測(cè)出大豆分離蛋白的最佳提取條件(見表5)，理論上蛋白提取率可達(dá)29.65%，根據(jù)實(shí)際操作條件對(duì)此模型進(jìn)行驗(yàn)證(見表6)，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，實(shí)際蛋白提取率為29.25%，與預(yù)測(cè)值相差0.40%，因此該模型可以較準(zhǔn)確地確定大豆分離蛋白的最佳提取工藝。大豆分離蛋白含量約為40%，有文獻(xiàn)報(bào)道提取率達(dá)到70%以上[16]，主要是因?yàn)樘崛÷识x不同，文獻(xiàn)提取率的定義是：提取的蛋白/原料中蛋白的含量，本研究中提取率為提取的蛋白重量/原料重量，如換算成文獻(xiàn)報(bào)道的提取率，應(yīng)該提取率也為75%左右。且文獻(xiàn)中大豆分離蛋白提取多為提取后離心沉淀產(chǎn)物，而本研究中大豆蛋白提取以后經(jīng)透析純化后冷凍干燥獲得，相對(duì)蛋白純度更高。

表5 模型預(yù)測(cè)最佳提取條件

表6 實(shí)際測(cè)定最佳提取條件Table 6 The optimal extraction conditions of actual determination

2.4 復(fù)合酶解活性肽的抑菌活性

采用牛津杯法測(cè)定大豆分離蛋白活性肽的抑菌活性，結(jié)果顯示：用胰蛋白酶和糜蛋白酶單獨(dú)酶解制備的活性肽對(duì)金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、蠟樣芽孢桿菌均有抑菌活性，且活性大小差不多，而同時(shí)采用兩種酶復(fù)合酶解制備的活性肽抑菌活性比兩種酶單獨(dú)酶解制備的活性肽都要強(qiáng)，說明兩種酶復(fù)合酶解能制備活性更高的活性肽，見圖6。

圖6 3種酶解液抑菌活性對(duì)比Fig.6 Comparison of antibacterial activities of three hydrolysates

2.5 復(fù)合酶酶解活性肽的抗氧化活性

測(cè)定兩種酶單酶酶解活性肽和復(fù)合酶酶解活性肽結(jié)果顯示都有一定的抗氧化活性，且復(fù)合酶酶解制備的活性肽抗氧化活性最高，對(duì)DPPH自由基的清除率達(dá)到30.4%，見表7。

表7 3種酶解活性肽抗氧化能力測(cè)定Table 7 The determination of antioxidant capacity of three enzymatic active peptides

目前關(guān)于大豆分離蛋白活性肽抗氧化活性的報(bào)道不少，如孫莉莉等[17]采用堿性蛋白酶制備大豆活性肽并研究了其抗氧化活性，其對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力達(dá)到41.2%，但該抗菌肽是經(jīng)過分離純化的，所以本研究復(fù)合酶酶解制備的活性肽抗氧化活性高低還需要進(jìn)一步深入詳細(xì)的比較研究才能確定。

3 結(jié)論

經(jīng)單因素及響應(yīng)面優(yōu)化法確定大豆堿提酸沉法蛋白最佳提取工藝為堿提時(shí)間60 min、堿提溫度60 ℃、堿提pH值11.0、酸沉pH值5.0，最佳提取工藝提取大豆分離蛋白提取率為29.25%。采用胰蛋白酶、糜蛋白酶復(fù)合酶解法獲得對(duì)金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、蠟樣芽孢桿菌具有較高抑菌活性的大豆分離蛋白活性肽，且該活性肽對(duì)DPPH自由基的清除率達(dá)到37.5%，具有一定的抗氧化活性。該法制備的活性肽有望開發(fā)新型營(yíng)養(yǎng)保健食品，或作為食品添加劑添加到其他食品中起到防腐保鮮和營(yíng)養(yǎng)保健的功效，開發(fā)功能性食品。