不同方法提取山桐子油的品質(zhì)及體外抗氧化活性研究

宋明發(fā)，楊蕓，白冉冉，梁芳芳，章乾，陳高飛，許粟，馬立志,3*

(1.貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴陽 550025；2.貴陽學(xué)院 食品與制藥工程學(xué)院，貴陽 550005；3.貴州省果品加工工程技術(shù)研究中心，貴陽 550005)

山桐子(IdesiapolycarpaMaxim.)是大風(fēng)子科，落葉喬木植物，又稱為水冬瓜、油葡萄、椅桐等，是油材兩用樹種[1]，分布于中國、日本、朝鮮等地[2]，山桐子是木本植物油料，有“樹上的油庫”的美譽(yù)，其果肉占總重的62.3%，種子占總重的36.7%[3]。山桐子果實(shí)含油率為36.71%[4]，山桐子中脂肪酸的成分主要有油酸、亞油酸[5]等，具有降血脂、降血壓、軟化血管等保健作用，還具有抗氧化能力和免疫能力[6]，山桐子中含有大量的天然活性成分，主要成分是甾醇和生育酚的同系物，β-谷甾醇的含量高達(dá)28.15%[7]，可應(yīng)用于工業(yè)用油、醫(yī)藥、化妝品、肥料[8]等行業(yè)。

目前，提取油脂的方法主要有壓榨法提取、水酶法提取[9]、超聲波輔助提取[10]、溶劑浸提提取[11]、超臨界CO2萃取[12]等，華婉等[13]研究山桐子的提取工藝，得出通過壓榨提取山桐子油，其出油率為21%；王玉琴等研究水酶法提取山桐子油，優(yōu)化得出提取率可達(dá)93.88%；劉春雷等[14]優(yōu)化索氏提取山桐子油工藝，結(jié)果表明，優(yōu)化后的提油率為28.50%；田瀟瀟等[15]對山桐子油的抗氧化能力進(jìn)行研究，結(jié)果表明ABTS自由基清除方面，果肉油為312.85 μmol TE/100 g，種子油為675.77 μmol TE/100 g，說明山桐子油具有抗氧化性。

本文以壓榨法、水酶法、有機(jī)溶劑浸提法分別提取山桐子油，對比3種不同提取方法在品質(zhì)及脂肪酸組成上的差異，為后續(xù)山桐子油的精煉提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料

山桐子鮮果：采于四川省古藺縣。石油醚、異丙醇、95%乙醇、乙醚、冰乙酸、甲醇、正己烷、丙酮(均為分析純)：天津市富宇精細(xì)化工有限公司；α-淀粉酶、纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶(均為BR)：北京奧博星生物技術(shù)有限公司；無水硫酸鈉、氫氧化鈉、硫代硫酸鈉(均為分析純)：成都金山化學(xué)試劑有限公司；百里香酚酞、碘化鉀(均為分析純)：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；可溶性淀粉(AR)：天津市永大化學(xué)試劑有限公司；韋氏試劑(AR)、2,2-聯(lián)氨-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺鹽(ABTS)、1,1-二苯基-2-苦基肼(DPPH)、維生素C：上海阿拉丁生物科技有限公司；三氯甲烷(AR)：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；重鉻酸鉀(AR)：重慶川江化學(xué)試劑廠；氫氧化鉀(AR)：重慶川東化工(集團(tuán))有限公司；37種脂肪酸甲酯混標(biāo)：上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

CS-2000高速多功能粉碎機(jī) 永康市天祺盛世工貿(mào)有限公司；CZR309榨油機(jī) 廣州德海威工業(yè)設(shè)備有限公司；N-1300旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海愛朗儀器有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；ZD-2A自動電位滴定儀 上海埃依琪實(shí)業(yè)有限公司；13型紫外分光光度計(jì)、202-1AB電熱恒溫干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司；WSL-2型羅維朋比色計(jì) 杭州大成光成儀器有限公司；GC-2014氣相色譜儀 島津企業(yè)管理(中國)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 壓榨法提取山桐子油

將山桐子鮮果放入80 ℃烘箱中處理10 h，直接放入榨油機(jī)，通過高溫壓榨提取山桐子油，對壓榨油脂進(jìn)行離心，取出上清液油，底部廢渣去除。

1.3.2 水酶法提取山桐子油

將山桐子干果按上述壓榨前處理后，放入粉碎機(jī)中，將山桐子干果打細(xì)，過20目篩，稱取一定量的山桐子過20目篩干粉，按料液比1∶4加入純凈水，攪拌均勻，加熱至90 ℃進(jìn)行殺菌5 min，冷卻至46 ℃左右，將料液混合液的pH調(diào)至5，添加復(fù)合酶(纖維素酶、α-淀粉酶、果膠酶、木瓜蛋白酶為1∶1∶1∶1，混合均勻后，在酶解溫度46 ℃下酶解4 h。酶解結(jié)束，于95 ℃水浴條件下滅酶5 min，在5000 r/min條件下離心20 min，吸取上層油。

1.3.3 有機(jī)溶劑浸提法提取山桐子油

將山桐子鮮果放入80 ℃烘箱中處理10 h，把山桐子干果打細(xì)并過20目篩，稱取一定量的山桐子過20目篩干粉，加入不同料液比1∶10的有機(jī)溶劑石油醚(60～90 ℃)，在溫度45 ℃下反應(yīng)62 min，將料液混合液進(jìn)行抽濾，濾液通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮去除有機(jī)溶劑，收集山桐子油。提油率計(jì)算公式如下：

式中：A1表示山桐子油的恒定質(zhì)量(g)；A0表示所用山桐子干果粉末的質(zhì)量(g)。

1.3.4 理化指標(biāo)的測定

本次實(shí)驗(yàn)中，過氧化值的測定參照GB 5009.227-2016，酸價(jià)的測定參照GB 5009.229-2016，碘值的測定參照GB/T 5532-2008，皂化值的測定參照GB/T 5534-2008，不皂化物的測定參照GB/T 5535.2-2008，色澤的測定參照GB/T 22460-2008。

1.3.5 脂肪酸組成分析

樣品的制備：參照GB 5009.168-2016。甲酯化處理：稱取山桐子油0.03 g放置在試管中，加入體積比為1∶1的苯-石油醚(沸程60～90 ℃)混合試劑2 mL，溶解樣品，待樣品完全溶解后，加入0.4 mol/L KOH-CH3OH溶液2 mL，渦旋混勻，放入43 ℃的恒溫水浴反應(yīng)35 min[16]，反應(yīng)結(jié)束后，加入5 mL純凈水，靜置40 min(待上清液澄清即可)，取上清液，用正己烷對上清液稀釋10倍，稀釋液經(jīng)過無水硫酸鈉，去除上清液中殘留的水分，使用0.4 μm有機(jī)濾膜進(jìn)行過濾，將濾液進(jìn)樣，待機(jī)檢測。氣相色譜條件：氣相色譜柱為SH-Rt-2560毛細(xì)管柱(100 m×0.25 mm×0.20 μm)，檢測器：FID檢測器，采用程序升溫，初始溫度130 ℃，保持5 min，以4 ℃/min升高至240 ℃，并保持20 min。

1.3.6 抗氧化活性研究

1.3.6.1 DPPH自由基清除率的測定

DPPH自由基清除率的測定：參照常晨等[17]的測定方法。

0.0001 mol/L DPPH溶液：稱取0.0039 g DPPH自由基，使用無水乙醇定容至100 mL容量瓶中。

測定方法：在含刻度試管中分別加入4 mL DPPH和1 mL不同質(zhì)量濃度樣品(4， 6， 8， 10， 12， 14 mg/mL)，使用渦旋振蕩器混勻，在室溫條件下，避光放置30 min，以無水乙醇為調(diào)零液，在517 nm處測定吸光度，為A1；同時(shí)以VC作陽性對照，濃度分別為0.02，0.04，0.06，0.08，0.10，0.12，0.14 mg/mL VC溶液代替樣品，為A2，并分別作空白實(shí)驗(yàn)和樣品對照組實(shí)驗(yàn)，按下列公式計(jì)算DPPH自由基清除率：

式中：A0為樣品空白組(DPPH+無水乙醇)吸光度；A1為樣品組(DPPH+樣品)吸光度；A2為樣品對照組(無水乙醇+樣品)吸光度。

1.3.6.2 ABTS自由基清除率的測定

ABTS自由基清除率的測定：參照王芳等[18]的測定方法。

7 mmol/L ABTS溶液：稱取0.3840 g ABTS，使用無水乙醇定容至100 mL容量瓶中；配制2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液：稱取0.0648 g過硫酸鉀，用無水乙醇定容至100 mL容量瓶中；ABTS混合工作液：將7 mmol/L ABTS溶液和2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液等體積混合，放置在4 ℃冰箱中過夜14 h，使用時(shí)用無水乙醇將其稀釋至吸光度為0.7～1。

測定方法：山桐子油樣品不同質(zhì)量濃度分別為4，6，8，10，12，14 mg/mL；陽性對照VC不同質(zhì)量濃度分別為0.02，0.04，0.06，0.08，0.10，0.12 mg/mL；在刻度試管中加入4 mL稀釋好的ABTS混合液，分別加入0.5 mL不同質(zhì)量濃度的山桐子油樣品，避光室溫反應(yīng)6 min，以無水乙醇為調(diào)零液，在734 nm處測定其吸光度值，為A1；以VC作陽性對照，濃度分別為0.02，0.04，0.06，0.08，0.10，0.12，0.14 mg/mL VC溶液代替樣品，為A2；并作空白實(shí)驗(yàn)和樣品對照組實(shí)驗(yàn)，按下列公式計(jì)算ABTS自由基清除率:

式中：A0為樣品空白組(ABTS混合液+無水乙醇)吸光度；A1為樣品組(ABTS混合液+樣品)吸光度；A2為樣品對照組(無水乙醇+樣品)吸光度。

1.3.6.3 羥基自由基清除率的測定

羥基自由基清除率的測定：參照周婷等[19]的測定方法，采用水楊酸比色法。

配制9 mmol/L FeSO4·7H2O溶液：稱取0.2502 g FeSO4·7H2O，用純水定容至100 mL；配制9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液：稱取0.1243 g水楊酸，用無水乙醇定容至100 mL；配制9 mmol/L H2O2溶液：量取0.091 mL 30% H2O2至100 mL容量瓶中，用純水定容。

測定方法：在刻度試管中加入不同質(zhì)量濃度(0.4，2，4，6，8，10 mg/mL)的山桐子油1 mL，依次加入1 mL FeSO4溶液、1 mL水楊酸-乙醇溶液，再加入1 mL H2O2溶液，搖勻，此時(shí)將試管移入37 ℃水浴鍋中反應(yīng)30 min，反應(yīng)結(jié)束后，以無水乙醇作為調(diào)零液，在510 nm處測定其吸光度，為A1；同時(shí)作陽性對照，取不同質(zhì)量濃度(0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mg/mL)的Vc溶液代替山桐子油，在相同條件下，測定其吸光度值，為A2。按下列公式計(jì)算羥基自由基清除率:

式中：A0為樣品空白組(FeSO4+水楊酸-乙醇溶液+H2O2+無水乙醇)吸光度；A1為樣品組(樣品+FeSO4+水楊酸-乙醇溶液+H2O2)吸光度；A2為樣品對照組(樣品+FeSO4+水楊酸-乙醇溶液+純水)吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Origin軟件作圖，得到的數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS軟件中Duncan分析對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及差異性檢驗(yàn)(顯著水平P=0.05)。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同方法提取山桐子油提油率的比較

由圖1可知，壓榨法、水酶法、浸提法提取山桐子油的提油率分別為20.90%(與華婉等研究的壓榨法提油率21.00%基本一致)、20.54%、28.47%(與劉春雷等研究的索氏提取法提油率28.50%基本一致)，浸提法>壓榨法>水酶法，浸提法相對于壓榨法和水酶法存在顯著性差異(P<0.05)，從提取得率來看，浸提法提取的山桐子油出油率最高，但存在一定的溶劑殘留。

圖1 不同方法提油率的比較Fig.1 Comparison of oil extraction rate by different methods

2.2 山桐子油的抗氧化能力

2.2.1 山桐子油DPPH自由基清除率的比較

由圖2和圖3可知，壓榨法、水酶法、溶劑浸提法3種方法的DPPH自由基清除率都隨著山桐子油濃度的增加而升高，當(dāng)山桐子油的質(zhì)量濃度為10.00 mg/mL時(shí)，壓榨法對DPPH自由基的清除率達(dá)51.45%，水酶法達(dá)63.05%，溶劑浸提法達(dá)33.11%，但Vc的質(zhì)量濃度為0.04 mg/mL時(shí)，對DPPH自由基的清除率達(dá)95.60%。對于DPPH自由基的清除能力，水酶法>壓榨法>浸提法，3種方法DPPH自由基清除能力的IC50值為浸提法15.83 mg/mL>壓榨法9.63 mg/mL>水酶法7.25 mg/mL>Vc 0.02 mg/mL，水酶法對DPPH自由基的清除能力最強(qiáng)，優(yōu)于呂秋兵等研究的冬瓜籽油(IC50值為10.23 mg/mL)對DPPH自由基的清除能力。

圖2 山桐子油對DPPH自由基的清除能力Fig.2 DPPH radical scavenging capacity of Idesia polycarpa Maxim. oils

圖3 Vc對DPPH自由基的清除能力Fig.3 DPPH radical scavenging capacity of Vc

2.2.2 山桐子油ABTS自由基清除率的比較

由圖4和圖5可知，壓榨法、水酶法、溶劑浸提法3種方法提取的山桐子油對ABTS自由基的清除能力都隨著山桐子油濃度的增加而顯著升高，當(dāng)濃度達(dá)到14.00 mg/mL時(shí)，壓榨法清除率達(dá)到93.33%，水酶法清除率達(dá)到95.65%，溶劑浸提法清除率僅達(dá)74.03%，對ABTS自由基的清除能力明顯低于壓榨法及水酶法，Vc濃度僅為0.04 mg/mL時(shí)，清除率高達(dá)99.28%。通過計(jì)算，3種方法對ABTS自由基清除能力的IC50值大小依次為溶劑浸提法9.69 mg/mL>壓榨法6.68 mg/mL>水酶法3.94 mg/mL>Vc 0.01 mg/mL，可以看出，水酶法在3種提取方法中對ABTS自由基的清除能力最強(qiáng)，顯著高于壓榨法及溶劑浸提法。

圖4 山桐子油對ABTS自由基的清除能力Fig.4 ABTS radical scavenging capacity of Idesia polycarpa Maxim. oils

圖5 Vc對ABTS自由基的清除能力Fig.5 ABTS radical scavenging capacity of Vc

2.2.3 山桐子油羥基自由基清除率的比較

由圖6和圖7可知，壓榨法、水酶法、溶劑浸提法對羥基自由基的清除能力都隨著山桐子油濃度的增加而逐漸升高。當(dāng)山桐子油和Vc濃度都為0.40 mg/mL時(shí)，壓榨法清除率為24.81%，水酶法清除率達(dá)22.59%，溶劑浸提法清除率達(dá)19.73%，Vc清除率高達(dá)55.66%，通過計(jì)算，3種方法對羥基自由基清除能力的IC50值大小依次為水酶法1.99 mg/mL>溶劑浸提法1.86 mg/mL>壓榨法1.82 mg/mL>Vc 0.34 mg/mL，可以得出，壓榨法對羥基自由基的清除能力較水酶法與溶劑浸提法顯示最強(qiáng)。

圖6 山桐子油對羥基自由基的清除能力Fig.6 ·OH radical scavenging capacity of Idesia polycarpa Maxim. oils

圖7 Vc對羥基自由基的清除能力Fig.7 ·OH radical scavenging capacity of Vc

半抑制濃度IC50表示當(dāng)自由基的清除率為50%時(shí)所需要抗氧化物質(zhì)的質(zhì)量濃度，IC50越小，說明該物質(zhì)對自由基的清除能力越強(qiáng)，在清除DPPH自由基方面，清除能力大小順序依次為：水酶法>壓榨法>溶劑浸提法；在清除ABTS自由基方面，清除能力順序依次為：水酶法>壓榨法>溶劑浸提法；在清除羥基自由基方面，清除能力順序依次為：壓榨法>溶劑浸提法>水酶法。相對于清除DPPH和ABTS自由基，山桐子油對羥基自由基的清除率最高，說明油中含有大量酚類物質(zhì)，這與含氧自由基羥基自由基的吸收能力呈正相關(guān)，從而對羥基自由基有更強(qiáng)的清除作用。

2.3 不同方法提取山桐子油理化指標(biāo)的比較

油脂的酸價(jià)是衡量油脂酸敗和新鮮程度及游離脂肪酸含量的重要指標(biāo)，酸價(jià)越低，分解的甘油三酯越少，油脂的品質(zhì)越好，由表1可知，壓榨法、水酶法、溶劑浸提法3種方法提取的山桐子油酸價(jià)分別為1.75，2.51，1.99，水酶法的酸價(jià)較高，由于山桐子粉末在水解體系中反應(yīng)，加快脂肪酸的水解，使得游離脂肪酸產(chǎn)生。過氧化值是反映油脂的酸敗和氧化程度的重要指標(biāo)，壓榨法、水酶法、溶劑浸提法提取山桐子油的過氧化值分別為0.06，0.01，0.02，壓榨法>溶劑浸提法>水酶法，水酶法與壓榨法和溶劑浸提法之間差異性顯著(P<0.05)，高溫會使得油脂發(fā)生氧化，提高油脂的過氧化值，同時(shí)會使油中的抗氧化物損失或發(fā)生氧化[20]，水酶法提取油脂條件溫和，其氧化程度最低。碘值反映油脂的不飽和程度，碘值越高，說明油脂的不飽和程度越高，油中不飽和脂肪酸含量高，壓榨法與水酶法差異不顯著；皂化值高低反映油脂中游離脂肪酸分子量大小，皂化值高，說明油脂游離脂肪酸分子量小；不皂化物包括自然界中脂類物質(zhì)，如甾醇、烴類、醇類、脂肪族類等，表1中壓榨法、水酶法、溶劑浸提法提取山桐子油不皂化物含量分別為1.28，1.09，1.81，溶劑浸提法>壓榨法>水酶法；從色澤上看，紅值中壓榨法>溶劑浸提法>水酶法。

表1 不同方法提取山桐子油理化指標(biāo)分析

2.4 不同方法提取山桐子油脂肪酸組成的比較

由表2可知，不同方法提取的山桐子油所含脂肪酸成分基本一致，都是由飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸組成，這與王玉琴等對山桐子品質(zhì)分析的研究基本一致，壓榨法、水酶法、浸提法的飽和脂肪酸分別為16.58%、16.72%、16.70%，水酶法>浸提法>壓榨法；壓榨法、水酶法、浸提法的不飽和脂肪酸分別為82.70%、82.56%、82.52%，壓榨法>水酶法>溶劑浸提法；壓榨法、水酶法、溶劑浸提法所含亞油酸分別為73.50%、73.50%、73.52%，顯著高于劉麗娜[21]研究的落葵籽油亞油酸含量22.06%。

表2 不同方法提取山桐子油脂肪酸組成分析Table 2 The fatty acid composition analysis of Idesia polycarpa Maxim. oils by different extraction methods

3 結(jié)論

本文研究不同方法提取山桐子油及對油脂品質(zhì)的影響，采用壓榨法、水酶法、溶劑浸提法提取山桐子油，壓榨法、水酶法、有機(jī)溶劑浸提法提取山桐子油得率分別為20.90%、20.54%、28.47%；浸提法的提取率最大，不皂化物含量最高，但耗時(shí)長，存在一定溶劑殘留；水酶法提取的山桐子油紅值最小，過氧化值最低，但耗時(shí)長，操作不便，壓榨法酸價(jià)、碘值、不皂化物高于水酶法，且提油耗時(shí)短，操作簡單。抗氧化結(jié)果表明，DPPH自由基清除能力大小順序：水酶法>壓榨法>溶劑浸提法；ABTS自由基清除能力大小順序：水酶法>壓榨法>溶劑浸提法，羥基自由基清除能力大小順序：壓榨法>溶劑浸提法>水酶法。水酶法的DPPH、ABTS自由基清除能力最強(qiáng)，IC50值分別為7.25，3.94 mg/mL；壓榨法的羥基自由基清除能力最強(qiáng)，其IC50值為1.82 mg/mL。通過GC分析，壓榨法、水酶法、浸提法提取山桐子油不飽和脂肪酸所含成分一致，但含量各有不同，壓榨法82.70%、水酶法82.56%、溶劑浸提法82.52%，壓榨法>水酶法>浸提法，因此，綜合考慮選取壓榨法提取山桐子油，為油料企業(yè)選擇提取山桐子油的方法提供了理論參考。