Gilbert綜合征與Crigler-Najjar綜合征Ⅱ型患者UGT1A1基因多態(tài)性分析

劉念晨， 白 潔， 梁 晨， 白 麗， 劉 霜， 段鐘平1b,， 鄭素軍

1 首都醫(yī)科大學附屬北京佑安醫(yī)院 a.肝病中心一科， b. 肝病中心四科， 北京 100069；2 肝衰竭與人工肝治療研究北京市重點實驗室， 北京 100069

遺傳性非結合性高膽紅素血癥，包括Crigler-Najjar綜合征Ⅰ型(CN-1)、Crigler-Najjar綜合征Ⅱ型(CN-2)和Gilbert綜合征(GS)，都是由膽紅素尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶1A1(UGT1A1)基因突變所引起的。在肝臟中，非結合膽紅素(IBil)在UGT1A1的催化下與葡萄糖醛酸結合，生成結合膽紅素(DBil)。當UGT1A1基因突變導致酶活性降低或喪失時，IBil因無法轉(zhuǎn)化為DBil而在體內(nèi)蓄積。

CN-1極為罕見，患者血清膽紅素水平可達30 mg/dL以上(30～50 mg/dL，513～855 μmol/L)，在此水平下，患者常伴有膽紅素腦病的危險[1]。CN-2的發(fā)病率約為1/100萬，是血清膽紅素水平介于6～20 mg/dL(102.6～342 μmol/L)的中度高膽紅素血癥[2]。GS為最常見的遺傳性疾病之一，血清膽紅素水平介于1～5 mg/dL(17～85 μmol/L)，表現(xiàn)為輕度高膽紅素血癥。CN-2與GS的交界值通常為6.0 mg/dL(102.6 μmol/L)，但有許多患者的膽紅素水平接近這一界值。有研究[3]認為，血清膽紅素水平隨基因型從GS到CN-2連續(xù)變化，但由于突變和基因多態(tài)性的結合，許多患者在兩個表型之間表現(xiàn)出中等水平的血清膽紅素，臨床上很難明確區(qū)分這兩種表型。本文重點研究了GS和CN-2兩種表型之間UGT1A1基因突變位點的差異。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集2010年1月1日—2019年12月31日就診于首都醫(yī)科大學附屬北京佑安醫(yī)院的GS與CN-2患者臨床資料。

1.2 觀察指標 所有患者均在本院檢測了血常規(guī)及肝功能，包括ALT、AST、TBil、DBil、IBil、ALP、GGT、TP、Alb、Glb等指標；于本院或外院完善Coombs試驗以除外溶血，并除外病毒性肝炎、自身免疫性肝炎、藥物性肝損傷及酒精性肝炎等導致膽紅素升高的情況。所有患者均進行UGT1A1基因檢測。以血清TBil水平102.6 μmol/L為臨界值區(qū)分GS與CN-2患者[2-3]。

1.3 檢測方法 血常規(guī)、肝功能等參數(shù)均采用本院檢驗科標準。采集患者空腹12 h的抗凝全血與血清用于提取DNA?；驒z測采用聚合酶鏈反應擴增后直接DNA測序的方法，對UGT1A1基因苯巴比妥反應增強元件(PBREM)區(qū)、啟動子TA盒以及5個外顯子進行遺傳分析。

1.4 倫理學審查 本研究方案經(jīng)由首都醫(yī)科大學附屬北京佑安醫(yī)院倫理委員會審批，批號：LL-2019-029-K。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。對于缺失值小于樣本總量10%的參數(shù)，分別為年齡(n=1，0.72%)、ALP(n=3，2.17%)、GGT(n=2，1.45%)、TP(n=6，4.35%)，使用期望最大化法進行處理。不符合正態(tài)分布的計量資料以M(P25～P75)表示，兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。計數(shù)資料兩組間比較采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。使用在線軟件SNPStats(https://www.snpstats.net/start.htm)進行連鎖不平衡(linkage disequilibrium, LD)和單倍型的分析，強LD被定義為|D′|和r2均>0.8，中度LD被定義為|D′|>0.8且r2>0.4。

2 結果

2.1 一般資料 共選取符合納入條件的患者138例，其中GS組109例，CN-2組29例。138例患者中，男115例，女23例，發(fā)病年齡9～72歲。CN-2組患者中女性比例、TBil、IBil水平較GS組更高，而GS組年齡、TP與Alb水平高于CN-2組，差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)(表1)。

表1 GS組與CN-2組一般資料比較

2.2 基因突變發(fā)生情況 138例患者均存在基因突變，突變位點共發(fā)生頻次563次。突變主要發(fā)生在啟動子上游PBREM區(qū)域-3279T>G突變(104例，75.36%)、-3152G>A突變(82例，59.42%)和啟動子TATA 盒TA 插入突變(88例，63.77%)，以及編碼區(qū)1號外顯子上的c.211 G>A(p.G71R)突變(66例，47.83%)，突變形式可表現(xiàn)為純合及雜合突變，綜合所有患者對于出現(xiàn)的突變位點頻次進行分析，每個突變位點的發(fā)生情況見表2。GS組在PBREM區(qū)域-3279T>G位點、-3152G>A位點及啟動子TATA 盒(TA)6>(TA)7突變的比例高于CN-2組，而CN-2組在c.211位點和c.1456位點的突變比例高于GS組，差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)。

表2 UGT1A1基因各突變位點發(fā)生情況

2.3 單倍型和雙倍型分析 對UGT1A1基因不同變異間的LD進行單倍型分析，結果顯示(TA)6>(TA)7與-3152G>A之間存在強LD(|D′|>0.8，r2>0.8)，(TA)6>(TA)7與-3279T>G、-3152G>A與-3279T>G、(TA)6>(TA)7與c.211G>A、-3279T>G與c.211G>A存在中度LD(|D′|均>0.8，r2均>0.4)(表3)。在138例患者中，頻率>1%的單倍型共有9種，詳見表4，它們共同構成了25種雙倍型，涵蓋135例患者(97.8%)；其中單倍型1、3、4在GS和CN-2兩種表型間的頻率差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)。圖1所示為25種雙倍型中頻率>1%的19種組合及其對應的TBil水平(log10轉(zhuǎn)換后)，其中雙倍型2/4、3/4、4/4、4/5、4/8對應的TBil水平相對更高。

表3 UGT1A1基因不同變異間的LD分析

表4 UGT1A1基因單倍型分布

3 討論

本研究對GS患者與CN-2患者一般資料的組間分析結果顯示，GS組年齡、TP與Alb水平明顯高于CN-2組(P值均<0.05)?？赡艿脑蚴荂N-2患者往往因黃疸水平高，就診年齡更早。另外，最近研究[4]發(fā)現(xiàn)膽紅素作用具有兩面性——輕度升高的血清膽紅素具有更好的抗氧化作用，而過高的血清膽紅素水平則具有促氧化作用。GS是一種良性的輕度高膽紅素血癥，目前研究[5-7]認為該病一般不需要治療，并且GS患者罹患包括心血管疾病、2型糖尿病和代謝綜合征在內(nèi)的各種疾病概率更低。而CN-2患者TP與Alb水平降低則表明其肝臟合成功能已經(jīng)在一定程度上受到了影響。

注：每種雙倍型對應的TBil水平表示為均數(shù)±標準差，虛線為TBil水平102.6 μmol/L對應的對數(shù)值。

本研究的主要目的是分析GS組與CN-2組UGT1A1基因突變位點的差異。在單個位點突變頻率的分析中，GS組發(fā)生PBREM區(qū)域及啟動子TATA 盒(TA)6>(TA)7突變的比例高于CN-2組，而CN-2組在c.211位點和c.1456位點的突變比例高于GS組，這與文獻報道的相一致。大多數(shù)CN-2患者有外顯子區(qū)域的純合錯義突變或復合雜合突變，酶活性降低到正常水平的10%以下[8]，而GS患者則常有啟動子、增強子和編碼區(qū)的突變，導致肝臟UGT1A1活性降低到正常的30%以下[9-10]。在對不同突變位點的LD分析中，(TA)6>(TA)7和-3152G>A之間存在強LD，(TA)6>(TA)7和-3279T>G、-3152G>A和-3279T>G、(TA)6>(TA)7和c.211G>A、-3279T>G和c.211G>A之間存在中度LD，這也可以解釋單倍型頻率分析的發(fā)現(xiàn)：在GS組中，單倍型1[-3279G—-3152A—(TA)7]出現(xiàn)的頻率高于CN-2組，而單倍型3(c.1456G)和單倍型4(c.211A—c.1456G)的頻率低于CN-2組(P值均<0.05)。

在138例患者中，頻率>1%的單倍型共有9種，它們組合可構成25種雙倍型，涵蓋了135例患者(97.8%)。分析25種雙倍型中出現(xiàn)頻率>1%的19種組合以及與其對應的TBil水平(圖1)，可見雙倍型2/4、3/4、4/4、4/5、4/8對應的TBil水平相對更高，其中位水平都在102.6 μmol/L以上，這也從另一個方面印證了突變位點c.211和c.1456在CN-2中出現(xiàn)的比例更高，以及單倍型3和4在CN-2中有更高的頻率，可以認為這兩種單倍型參與組成的雙倍型對膽紅素水平有比較大的影響。

綜上所述，GS和CN-2患者的常見UGT1A1基因突變位點以及主要單倍型有所不同，在CN-2中包含常見單倍型(c.1456G和c.211A—c.1456G)的雙倍型可對應更高的TBil水平。這有助于更好地區(qū)分膽紅素水平相近的兩種表型，常見單倍型/雙倍型的檢出也可以提高診斷效率。

本研究有一定的局限性。首先，研究只納入了高非結合膽紅素血癥人群，缺少性別、年齡相匹配的正常對照。第二，研究的樣本量較小，且對疾病的重視程度等因素在一定程度上影響了患者的性別、年齡分布，需要更大的樣本量以及更接近1∶1的性別比例來進一步驗證本研究得出的結論。第三，患者的膽紅素水平是波動的，長期禁食、發(fā)燒和劇烈運動等均可導致膽紅素水平出現(xiàn)較大變化[11]，盡管已經(jīng)標準化采血(清晨空腹10～12 h后采血，避免劇烈運動)，但仍有一些不可控因素會影響膽紅素水平。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監(jiān)護人以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：劉念晨負責收集數(shù)據(jù)，資料分析，撰寫論文；白潔、梁晨負責標本整理，收集數(shù)據(jù)，分析測序結果；白麗、劉霜負責基因檢測報告的核對及發(fā)布；段鐘平負責擬定寫作思路；鄭素軍指導撰寫文章并最后定稿。