廣西蟲茶毒理學安全性評價研究

溫立香，張 芬，袁冬寅，陳家獻，彭靖茹，黃壽輝

廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所，廣西 南寧 530001

蟲茶又叫“茶精”，是我國湘桂黔山區(qū)特有的一種林業(yè)資源昆蟲產(chǎn)品，素有茶界“貓屎咖啡”之稱，早在宋代醫(yī)學巨著《太平圣惠方》就多處提到蟲茶的藥用保健性[1-2]。蟲茶是由特定昆蟲取食特定植物，在昆蟲體內(nèi)經(jīng)過特殊的生理生化反應產(chǎn)生的消化發(fā)酵物，經(jīng)篩分、滅菌、干燥等工序加工而成[3]，其營養(yǎng)物質(zhì)豐富，具清熱解毒、祛濕健胃、降血糖血脂[4-5]、抗氧化[6]、抑菌抗炎[7-9]和抗腫瘤[10]等功效。蟲茶因兼具茶葉與中草藥的保健與藥用功效，成為熱帶、亞熱帶地區(qū)一種重要的清涼飲料。鱗翅目許多昆蟲都可以用來生產(chǎn)蟲茶，目前已知的產(chǎn)茶昆蟲有米縞螟、紫斑谷螟、灰直紋螟、化香夜蛾、白條谷螟及弓須夜蛾等[11-12]，產(chǎn)茶昆蟲和寄食植物不同產(chǎn)生的蟲茶不同，按寄食植物主要有三葉蟲茶、化香蟲茶、老鷹茶蟲茶、柳葉蟲茶、桑葉蟲茶[2,13]及酸棗葉蟲茶等，按地域分主要有湖南蟲茶、貴州蟲茶和廣西蟲茶等。

廣西因地理環(huán)境條件特殊且本地有飲涼茶習慣，多地產(chǎn)蟲茶，主要分布在三江、龍勝、融安和梧州等地，三江、龍勝一帶主要為化香蟲茶，融安地區(qū)主要為酸棗葉蟲茶，梧州一帶主要為六堡蟲茶。近年來蟲茶市場走俏，逐漸成為廣西山區(qū)群眾尤其是少數(shù)民族同胞脫貧致富的特色產(chǎn)業(yè)之一。然而，蟲茶雖已有悠久的飲用歷史，但關(guān)于其用作食品的安全性問題一直是消費者關(guān)注的焦點，因此開展科學的毒理安全性評價對蟲茶進一步開發(fā)及促進產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展有重要的意義。王芳[14]、楊立昌[15]等對貴州的豹皮樟蟲茶、白蟲茶，文禮章[16]、易定宏[17]等對湖南的三葉蟲茶開展安全性毒理學評價，認為貴州豹皮樟蟲茶、白蟲茶及湖南三葉蟲茶安全無毒，可作為新資源食品進行開發(fā)。不同昆蟲與寄食植物產(chǎn)生的蟲茶不同，目前未見有關(guān)于廣西蟲茶生物安全性的相關(guān)研究。本文參照食品安全性毒理學評價程序，以廣西融安地區(qū)的蟲茶為試驗材料，分別從急性毒性、致癌、致畸及遺傳毒性等方面進行毒理安全性研究，以期為促進特色蟲茶進一步開發(fā)與產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

蟲茶樣品（產(chǎn)自廣西融安）；SPF級健康昆明種小鼠（實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2019-0014，由長沙市天勤生物技術(shù)有限公司繁殖，實驗動物質(zhì)量合格證號：1107261911001645、430726201100244242；動物飼料（由長沙市天勤生物技術(shù)有限公司和北京科澳協(xié)力飼料有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)許可證號和合格證編號分別為：SCXK（湘）2019-0014、1107372000000704，SCXK（ 京 ）2014-0010、1112621900007994）；5種鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型菌株TA97a、TA98、TA100、TA102、TA1535（美國 MOLTOX 公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 蟲茶的制備

收集寄食植物原料（南酸棗樹葉為主）→堆放發(fā)酵→引化產(chǎn)茶昆蟲蠶食→收集、去雜→高溫滅菌、去雜氣→干燥→成品。

1.2.2 動物試驗

動物試驗于廣西壯族自治區(qū)疾病預防控制中心毒理實驗室完成，使用許可證號：SYXK（桂）2016-0002，動物實驗室為屏障系統(tǒng)，實驗室溫度：22 ℃ ～ 25 ℃，相對濕度：55% ～ 70%。

前處理：參照食品安全性毒理學評價程序[18]，稱取蟲茶 50 g，加入 85℃純水 500 mL浸泡提取30 min，紗布過濾，收集浸泡液；再重復浸泡、提取一次。兩次濾液合并，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至50 mL，即得1.0 g/mL（以干品計，下同）的樣品提取液，置冰箱保存待用。

急性經(jīng)口毒性試驗：按照GB 15193.3—2014[19]進行；細菌回復突變試驗：按照GB 15193.4—2014[20]進行；哺乳動物紅細胞微核試驗：按照 GB 15193.5—2014[21]進行；小鼠精原細胞染色體畸變試驗：按照GB 15193.8—2014[22]進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 急性經(jīng)口毒性試驗結(jié)果

結(jié)果如表1。采用最大耐受劑量（MTD）試驗法，以 20 000 mg/kg BW 劑量的廣西蟲茶給予實驗動物灌胃后，雌、雄動物均生長良好，體重未受到影響；受試雌、雄小鼠均未出現(xiàn)中毒癥狀，連續(xù)觀察14 d無動物死亡現(xiàn)象。試驗結(jié)束后解剖受試動物，結(jié)果顯示受試動物主要臟器均未見有明顯的異常改變，對照GB 15193.3—2014[19]的急性毒性分級標準，廣西蟲茶對小鼠的急性經(jīng)口毒性耐受劑量大于20 g/kg BW，急性經(jīng)口毒性屬無毒級。

表1 小鼠急性毒性試驗結(jié)果（ ±S）Table 1 Results of acute toxicity test in mice（±S）

表1 小鼠急性毒性試驗結(jié)果（ ±S）Table 1 Results of acute toxicity test in mice（±S）

性別 動物數(shù)（只）途徑 劑量（mg/kg BW） 初始體重（g） 第7天體重（g）第14天體重（g） 死亡數(shù)（只） MTD（g/kg BW）雄 10 經(jīng)口 20 000 20.8 ± 0.7 26.7 ± 0.8 32.1 ± 1.1 0 ＞ 20雌 10 經(jīng)口 20 000 20.4 ± 0.8 25.1 ± 0.9 29.1 ± 1.2 0 ＞ 20

2.2 細菌回復突變試驗結(jié)果

細菌回復突變試驗（Ames試驗）是通過檢測受試物對鼠傷寒沙門氏菌的組氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株的回復突變遺傳毒性效應，來推測其對人體可能的致癌性[23]。本試驗中蟲茶劑量設(shè)置從8 μg/皿依次呈5倍增加，最大增加到5000 μg/皿，最小與最大劑量之間相差625倍，結(jié)果顯示各劑量組回變菌落數(shù)均不存在顯著差異（P＞ 0.05），觀察各劑量組平板背景菌苔也未見異常。

表2、表3為兩次細菌回復突變試驗結(jié)果。由各劑量組的回變菌落數(shù)統(tǒng)計數(shù)據(jù)可知：對于選擇的5種組氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株TA97a、TA98、TA100、TA102、TA1535，無論加入或不加入體外代謝活化系統(tǒng)大鼠肝微粒體酶S-9，受試物各劑量組的回變菌落數(shù)都沒有超過自發(fā)回變菌落數(shù)的2倍，各劑量組的回變菌落數(shù)間也不存在劑量-反應關(guān)系，說明廣西蟲茶對測試菌株不會誘發(fā)基因突變；陽性對照組回變菌落數(shù)均遠超過自發(fā)回變組2倍以上，顯示出明顯的誘變性。參照GB 15193.4—2014[20]，判定廣西蟲茶誘變試驗結(jié)果為陰性，對鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型的5種菌株均無直接或間接致突變作用。

表2 第一次細菌回復突變試驗結(jié)果（±S）Table 2 Results of the first bacterial reverse mutation test（±S）

表2 第一次細菌回復突變試驗結(jié)果（±S）Table 2 Results of the first bacterial reverse mutation test（±S）

注：菌落數(shù)結(jié)果為3個平皿的均值±標準差；+S-9和-S-9分別表示加和不加代謝活化系統(tǒng)S-9；自發(fā)回變對照除不加樣品外，其余條件與樣品組相同；溶劑對照用滅菌純水替代樣品，其余條件與樣品組相同；陽性對照：TA97a+S-9、TA98+S-9、TA100+S-9 采用2-氨基芴（劑量為10 μg/皿）；TA98-S-9采用柔毛霉素（劑量為6 μg/皿）；TA97a-S-9、TA102-S-9 采用敵克松（劑量為 50 μg/皿）；TA100-S-9、TA1535-S-9 采用疊氮鈉（劑量為 1.5 μg/皿）；TA102+S-9 采用1,8 -二羥基蒽醌（劑量為50 μg/皿）；TA1535+S-9采用環(huán)磷酰胺（劑量為200 μg/皿）。表3同

T A 9 7 a T A 9 8 T A 1 0 0 T A 1 0 2 T A 1 5 3 5-S-9 +S-9 -S-9 +S-9 -S-9 +S-9 -S-9 +S-9 -S-9 +S-9 5 0 0 0 1 1 9.7±9.3 1 4 3.0±2 9.9 3 9.0±8.2 3 5.7± 8.1 1 5 2.0±2 6.1 1 7 0.0±1 1.5 2 8 2.3±3 4.8 2 8 7.0±2 8.6 2 2.3±4.9 2 2.0± 3.6 1 0 0 0 1 1 9.0±4 0.9 1 3 3.0±3 2.1 4 2.7±5.8 4 7.0± 3.6 1 5 8.7±3 0.0 1 4 1.7±1 8.0 2 9 6.3±1 3.3 2 7 8.7±1 6.8 2 1.3±2.5 1 9.7± 2.5 2 0 0 1 2 0.0±2 1.0 1 5 3.7±2 1.6 4 4.0±4.4 4 5.0± 2.0 1 4 4.3±2 3.2 1 4 3.7±2 4.0 2 7 6.7±3 0.3 2 9 4.7±1 9.0 1 9.0±3.0 2 0.0± 3.6 4 0 1 3 3.7±3 0.9 1 1 4.7±1 7.4 4 0.0±3.5 3 9.7± 6.8 1 6 5.0±1 4.7 1 6 8.0±1 9.2 2 8 6.3±3 4.3 2 5 5.7±1 5.3 2 1.0±4.0 1 8.7±3.5 8 1 3 3.7±3 7.3 1 4 2.3±2 2.1 3 6.3±4.5 3 9.3± 5.7 1 7 3.7±2 1.5 1 5 7.7±2 6.7 2 9 2.3±2 1.6 2 7 1.3±1 3.7 2 0.3±1.5 1 9.3± 3.5自發(fā)回變 1 2 9.7±4 1.0 1 4 5.0±4 2.2 4 3.0±4.6 3 5.7± 1.5 1 5 4.7±3 4.9 1 4 6.0±1 9.5 2 6 5.7±1 7.2 2 7 5.0±1 2.3 1 6.3±3.2 1 8.7±1.5溶劑對照 1 0 6.0±1 6.1 1 4 8.3±3 5.7 3 8.7±5.0 3 5.3± 3.1 1 4 0.0±1 9.0 1 6 4.3±2 8.0 2 7 3.0±2 5.2 2 7 4.0±3 3.9 2 2.3±1.5 2 1.0± 2.0陽性對照 2 7 9 4.0±1 5 4.8 1 7 9 6.3±1 6.0 2 8 3 7.3±9 7.7 4 7 7 1.0±1 7 6.7 2 8 6 0.0±4 2.5 2 9 3 7.0±8 4.2 9 1 3.7±3 3.8 9 0 1.7±2 1.9 2 8 3.0±1 2.2 1 4 4.3±6.4劑量組(μ g/皿 )

表3 第二次細菌回復突變試驗結(jié)果（±S）Table 3 Results of the second bacterial reverse mutation test（±S）

表3 第二次細菌回復突變試驗結(jié)果（±S）Table 3 Results of the second bacterial reverse mutation test（±S）

TA97a TA98 TA100 TA102 TA1535-S-9 +S-9 -S-9 +S-9 -S-9 +S-9 -S-9 +S-9 -S-9 +S-9 5000 122.3±34.2 119.3±21.8 40.0±4.6 38.7±1.5 161.3±17.8 183.7±14.6 273.0±22.9 265.7±27.3 18.0± 2.7 20.3± 1.5 1000 122.0±32.0 152.0±11.4 40.3±5.5 40.7±1.5 173.0±37.4 150.3±27.6 280.7±24.3 279.3±22.0 20.7± 1.5 18.3 ± 1.5 200 134.3±37.0 146.3±20.4 40.0±8.7 44.3±2.5 173.7±14.0 174.3±14.6 285.7±27.8 267.0±10.0 20.3± 3.1 21.0± 1.0 40 112.0±20.0 143.0±32.2 39.0±7.5 42.7±7.8 168.3±26.4 165.3±19.3 280.7±17.8 261.3±22.2 17.7± 3.2 16.7± 2.1 8 131.0±23.1 128.0±38.1 31.0±1.0 36.7±4.9 141.7±13.1 145.7±14.7 285.0±28.1 268.3±18.5 15.0± 1.0 21.3± 4.7自發(fā)回變 160.0±16.1 157.0±19.2 41.7±4.7 44.0±4.6 145.0±12.2 164.7±29.2 273.7±29.8 276.0±28.2 15.7± 1.2 17.0± 2.7溶劑對照 116.3±29.7 129.7±26.5 34.7±3.2 36.0±5.2 155.3±38.4 166.3±36.8 277.0±22.5 272.0±24.6 17.3± 3.5 17.3± 3.1陽性對照 2766.0±63.2 1786.3±41.8 2811.0±190.2 4867.0±135.3 2888.7±99.1 2983.0±124.8 954.0±37.5 930.0±41.0 302.7±19.7 132.3± 17.1劑量組(μg/皿 )

2.3 哺乳動物紅細胞微核試驗結(jié)果

微核是指在細胞有絲分裂后期染色體進入子細胞形成細胞核時，滯留在細胞質(zhì)中的染色單體或染色體的無著絲點斷片等在末期被包含在子細胞的胞質(zhì)內(nèi)而形成比主核小的次核（大約為主核的 1/5 ～ 1/20）[24]。微核試驗是通過分析哺乳動物骨髓或外周血紅細胞，用于檢測染色體或有絲分裂器是否損傷的一種遺傳毒性試驗方法，是國際公認的致突變首選方法。本試驗采用間隔24 h兩次經(jīng)口灌胃法進行，由表4受試動物外周血紅細胞微核發(fā)生率統(tǒng)計結(jié)果可知：廣西蟲茶在 10 000、5 000、2 500 mg/kg BW（即高、中、低）三個劑量下，雌、雄小鼠的微核發(fā)生率與陰性對照（純水）組比較，均無顯著性差異（P＞ 0.05），且各劑量組間的微核發(fā)生率也不存在劑量-反應關(guān)系和統(tǒng)計學意義；雌、雄試驗動物的陽性對照（環(huán)磷酰胺）組與陰性對照組比較均存在極顯著性差異（P＜ 0.01）；同時高、中、低三個劑量組的PCE/RBC值均不低于陰性對照組的20%，且與陰性對照組比較無顯著性差異（P＞ 0.05）。

表4 哺乳動物外周血紅細胞微核發(fā)生率結(jié)果（±S）Table 4 Results of micronucleus incidence in mammalian peripheral blood erythrocytes（±S）

表4 哺乳動物外周血紅細胞微核發(fā)生率結(jié)果（±S）Table 4 Results of micronucleus incidence in mammalian peripheral blood erythrocytes（±S）

注：PCE為嗜多染紅細胞，微核率以含微核的PCE千分率表示；RBC為紅細胞，PCE/RBC為嗜多染紅細胞占總紅細胞的比例；**表示與陰性對照組比較，有極顯著差異（P ＜ 0.01）；cp為環(huán)磷酰胺

性別 劑量組(m g/k g B W)動物數(shù)（只）受檢P C E數(shù)（個）含微核P C E數(shù)（個）微核率（‰）受檢R B C數(shù)（個）P C E數(shù)（個）P C E/R B C（%）雄1 0 0 0 0 5 5×2 0 0 0 3 1 3.1±0.7 5×1 0 0 0 1 3 7 2.7 4 ±0.8 4 5 0 0 0 5 5×2 0 0 0 3 3 3.3± 0.6 5×1 0 0 0 1 2 1 2.4 2 ± 0.7 2 2 5 0 0 5 5×2 0 0 0 3 2 3.2±0.6 5×1 0 0 0 1 2 5 2.5 0 ±0.8 4陰性對照（純水） 5 5×2 0 0 0 3 1 3.1±0.7 5×1 0 0 0 1 1 4 2.2 8 ±0.9 4陽性對照 4 0（c p） 5 5×2 0 0 0 2 0 6 2 0.6±2.5** 5×1 0 0 0 9 2 1.8 4± 0.3 6雌1 0 0 0 0 5 5×2 0 0 0 3 5 3.5±0.8 5×1 0 0 0 1 3 2 2.6 4 ± 0.7 6 5 0 0 0 5 5×2 0 0 0 3 4 3.4±0.7 5×1 0 0 0 1 3 6 2.7 2±0.9 0 2 5 0 0 5 5×2 0 0 0 3 5 3.5±0.8 5×1 0 0 0 1 0 5 2.1 0± 0.5 2陰性對照（純水） 5 5×2 0 0 0 3 3 3.3±0.4 5×1 0 0 0 1 3 0 2.6 0± 0.6 1陽性對照 4 0（c p） 5 5×2 0 0 0 2 2 8 2 2.8±2.5** 5×1 0 0 0 9 5 1.9 0 ± 0.3 7

參照GB 15193.5—2014[21]判定方法，本試驗結(jié)果表明在劑量范圍內(nèi)廣西蟲茶不會引起哺乳動物嗜多染紅細胞含微核細胞率增加，試驗結(jié)果為陰性，即廣西蟲茶對小鼠的外周血紅細胞沒有損傷和抑制作用，無誘導染色體損傷的能力。

2.4 小鼠精原細胞染色體畸變試驗結(jié)果

由表5小鼠精原細胞染色體畸變統(tǒng)計結(jié)果可 知： 廣 西 蟲 茶 在 10 000、5 000、2 500 mg/kg BW 3個劑量組下，高、中、低各劑量組的染色體畸變數(shù)目、結(jié)構(gòu)改變及畸變細胞率與陰性對照（純水）組比較，均無顯著性差異（P＞ 0.05），各劑量組間也不存在劑量-反應關(guān)系和統(tǒng)計學意義；此外，高、中、低3個劑量組的有絲分裂指數(shù)均不低于陰性對照的50%，與陰性對照組比較無顯著性差異（P＞ 0.05），陽性對照（環(huán)磷酰胺）組的染色體畸變細胞率與陰性對照組有極顯著性差異（P＜ 0.01）。參照GB 15193.8—2014[22]結(jié)果判定方法，本試驗中廣西蟲茶對小鼠精原細胞染色體沒有致畸變作用，小鼠精原細胞染色體畸變試驗結(jié)果為陰性。

表5 小鼠精原細胞染色體畸變結(jié)果（±S）Table 5 Results of chromosomal aberration in mouse spermatogonial cells（±S）

表5 小鼠精原細胞染色體畸變結(jié)果（±S）Table 5 Results of chromosomal aberration in mouse spermatogonial cells（±S）

注：每只動物計數(shù)100個中期分裂相細胞，觀察精原細胞染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)改變，另觀察1000個精原細胞以確定有絲分裂指數(shù)；*結(jié)構(gòu)改變的環(huán)形改變包括有著絲點環(huán)和無著絲點環(huán)，多著絲點為含有兩個以上的著絲點；裂隙不計入畸變細胞率，畸變細胞率=（畸變細胞數(shù)-裂隙數(shù)）/觀察細胞數(shù)×100；**表示與陰性對照組比較，有極顯著差異（P ＜ 0.01）

非特定形10 000（24 h） 100×5 0 30 6 3 0 0 0 0 0 0 39 6.6 ± 1.1 7.8 ± 1.3 10 000（48 h） 100×5 0 28 2 2 0 0 0 0 0 0 32 6.0 ± 1.6 6.6 ± 1.7 5 000 100×5 0 29 3 2 0 0 0 0 0 0 34 6.2 ± 1.3 6.5 ± 1.1 2 500 100×5 0 32 5 3 0 0 0 0 0 0 40 7.0 ± 1.0 7.1 ± 1.9陰性對照（純水） 100×5 0 29 5 3 0 0 0 0 0 0 37 6.4 ± 1.5 7.7 ± 1.1陽性對照 40（cp） 100×5 0 29 17 18 21 3 1 0 0 0 89 14.4±2.5**4.3 ± 1.2劑量組(mg/kg BW)觀察細胞數(shù)（個）染色體數(shù)目改變 染色體結(jié)構(gòu)改變* 畸變細胞數(shù)（個）非整倍體 多倍體 裂隙 斷裂 斷片 微小體 環(huán)形 多著絲點單體互換畸變細胞率（%）有絲分裂指數(shù)

3 結(jié)論

試驗結(jié)果表明，以融安地區(qū)為代表的廣西蟲茶對小鼠的急性經(jīng)口毒性耐受劑量＞20 g/kg BW，屬無毒級；Ames試驗中5 種組氨酸缺陷型鼠傷寒沙門氏菌菌株（TA97a、TA98、TA100、TA102、TA1535）無論加入或不加入 S-9代謝活化系統(tǒng)，結(jié)果均為陰性，廣西蟲茶對鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型的5種菌株均無直接或間接致突變作用；哺乳動物紅細胞微核試驗與小鼠精原細胞染色體畸變試驗中10 000、5 000、2 500 mg/kg BW3 個高、中、低劑量組與陰性對照組比較，均無顯著性差異（P＞ 0.05），結(jié)果為陰性，說明廣西蟲茶沒有致突變、致畸變作用，無遺傳毒性。