miRNA在乙型肝炎病毒及相關(guān)疾病中作用機(jī)制的研究進(jìn)展

王 蔚，張麗麗，趙 川，王欣茹，張 會(huì)，尹有美

（泰州市人民醫(yī)院 肝病科，江蘇 泰州 225300）

乙型肝炎病毒（HBV）可以引起急性或慢性肝臟疾病，盡管目前有有效的疫苗，它仍是一個(gè)主要的全球健康問(wèn)題。HBV發(fā)現(xiàn)于1966年，它是一種小的、有包膜的病毒，具有肝病毒科的部分雙鏈DNA基因組。HBV已經(jīng)影響了世界人口的三分之一，其中超過(guò)3.5 億人患有慢性乙肝[2]。慢性乙型肝炎（CHB）患者肝小葉的結(jié)構(gòu)被破壞，肝細(xì)胞再生結(jié)節(jié)增多，最終可發(fā)展為肝纖維化。肝臟的纖維化經(jīng)常在不知不覺(jué)中進(jìn)展，特別是在那些HBV攜帶者中發(fā)生，激活的免疫系統(tǒng)加速了肝纖維化的進(jìn)展。HBV 感染是慢性肝炎、肝硬化和肝細(xì)胞癌（HCC）的關(guān)鍵風(fēng)險(xiǎn)因素。HBV 并不會(huì)直接損害肝細(xì)胞，HBV 感染造成的肝損害主要是由于宿主的免疫反應(yīng)引起的。乙型肝炎的免疫發(fā)病機(jī)理取決于宿主因素（如年齡、性別、免疫狀態(tài)），病毒和環(huán)境因素的錯(cuò)綜復(fù)雜的相互作用。

微小RNA（miRNA）發(fā)現(xiàn)于1993年，是由19～23個(gè)核苷酸組成的非編碼小RNA，主要通過(guò)配對(duì)靶轉(zhuǎn)錄物的3' 非編碼區(qū)調(diào)控真核生物的基因表達(dá)。到目前為止，已發(fā)現(xiàn)超過(guò)2000 個(gè)人的miRNAs，大約60%的人mRNA 可成為miRNA 的靶標(biāo)。miRNA 參與多種生理和病理功能，其中包括免疫應(yīng)答和腫瘤發(fā)生。除此之外，miRNA是許多病毒-宿主相互作用的重要調(diào)節(jié)劑。越來(lái)越多的研究證實(shí)了多種病毒的復(fù)制可能受到不同的miRNA 的影響，包括皰疹、多瘤病毒、腺病毒、乳頭瘤病毒等。成熟的miRNA 是一種在進(jìn)化中高度保守的非編碼小分子RNA。目前，在人類基因組中發(fā)現(xiàn)的成熟miRNA 分子已達(dá)2000 多種，調(diào)控著人類大約超過(guò)30%的蛋白質(zhì)編碼基因。盡管部分miRNA可以促進(jìn)病毒復(fù)制，但某些miRNA 可以用作潛在的抗病毒劑。在這方面，艾滋病毒、HCV（丙型肝炎病毒）和HBV（乙型肝炎病毒）已進(jìn)行了廣泛的研究。由于復(fù)雜的生命周期和復(fù)雜的宿主反應(yīng)，miRNA 在HBV 生物學(xué)中的作用是多方面的。HBV調(diào)節(jié)細(xì)胞miRNA的表達(dá)以增加其自身復(fù)制并從免疫應(yīng)答中逃逸，并在感染的肝細(xì)胞中建立病毒的持續(xù)性增殖。通過(guò)HBV相關(guān)的信號(hào)調(diào)節(jié)途徑如免疫應(yīng)答、凋亡、增殖和遷移可以導(dǎo)致miRNA的失調(diào)表達(dá)。最近的研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞外miRNA 能夠在血清中循環(huán)，并且這些miRNA 是高度穩(wěn)定的，這被認(rèn)為可以在HBV的診斷與治療中起到積極的作用。研究表明，一些宿主miRNA 可以通過(guò)多種方式調(diào)節(jié)HBV復(fù)制，某些miRNA直接靶向病毒RNA阻止其復(fù)制，也有miRNA靶向特異性宿主基因阻礙病毒繁殖，甚至某些miRNA 能夠激活特異性免疫應(yīng)答以抑制病毒。Dai 等[1]的研究表明miRNA-15b 通過(guò)人肝細(xì)胞核因子1α 激活HBV 增強(qiáng)子I 促進(jìn)HBV 的復(fù)制，而HBx 的表達(dá)抑制了miRNA-15b 的表達(dá)。HBx 蛋白可調(diào)控抑癌基因miRNA-145、miRNA-21 和miRNA-222 的 表 達(dá)。也 有 研 究 表 明miR-98， miR-375， miR-335，miR-199a-5p 和miR-22 參與HBV 的復(fù)制與表達(dá)，并促進(jìn)HCC 的發(fā)生與發(fā)展[2]。Sarkar[3]發(fā)現(xiàn)在乙型肝炎感染期間，miRNA-155的表達(dá)與Toll樣受體7的表達(dá)正相關(guān)。此外，miRNA-34a 靶向CCL22 并通過(guò)調(diào)節(jié)T 細(xì)胞抑制HBV 感染。而miRNA-146a和miRNA-548 分別靶向STAT1 和IFN-λ1 以促進(jìn)HBV感染。

1 miRNA的生物功能

1.1 miRNA 的生物發(fā)生細(xì)胞核中由RNA 聚合酶II 和III 轉(zhuǎn)錄的初級(jí)miRNA 被核糖核酸酶Drosha-DGCR8 復(fù)合物切除，并產(chǎn)生前體miRNA。這些前體miRNA通過(guò)Ran-GTP及蛋白-5轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)，并被稱為Dicer 的RNAse III 酶切除，產(chǎn)生miRNA 雙鏈體。這種雙鏈體繼而分裂產(chǎn)生單鏈成熟miRNA 最終形成RNA 誘導(dǎo)的復(fù)合物（RISC）。RISC 和Argonaute/ EIF2C（AGO）蛋白共同作用促進(jìn)靶mRNA 識(shí)別。miRNA 識(shí)別靶mRNA 是通過(guò)miRNA 的5' 端（種子序列）和編碼區(qū)和非翻譯區(qū)（UTR），特別是mRNA 的3’-UTR 中位點(diǎn)之間的特異性堿基配對(duì)的相互作用。成熟的miRNA 通過(guò)靶基因序列抑制轉(zhuǎn)錄機(jī)制或誘導(dǎo)mRNA降解。

1.2 miRNA 的特征miRNA 基因在核內(nèi)由RNA聚合酶II 轉(zhuǎn)錄成大約7000nt的初級(jí)微小RNA(primiRNA)，pri-miRNA 再經(jīng)由核內(nèi)的Drosha 酶及蛋白DGCR8識(shí)別，切割成長(zhǎng)約70～80nt的miRNA前體（pre-miRNA），然后，其被轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（expor?tin5） 轉(zhuǎn)運(yùn)至胞質(zhì)，在Dicer 酶（核酸內(nèi)切酶Rnase Ⅲ）的作用下，進(jìn)一步將pre-miRNA 切割成了22 個(gè)nt 的雙鏈miRNA，其被解旋酶解旋以后，其中的一條鏈成為成熟miRNA。近來(lái)研究表明，miRNA 的表達(dá)具有時(shí)間特異性及組織特異性，其對(duì)基因的調(diào)控非常復(fù)雜，往往不是一對(duì)一的關(guān)系，一個(gè)miRNA 可能調(diào)控了數(shù)百個(gè)靶基因的表達(dá)，而一個(gè)靶基因也有可能由多個(gè)miRNA 共同調(diào)控，數(shù)量眾多的miRNA與其不同的靶基因之間形成了一個(gè)錯(cuò)綜復(fù)雜的基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。換句話說(shuō)，如果miRNA 和靶mRNA 之間存在部分互補(bǔ)，其將導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄的阻遏，而如果存在完全互補(bǔ)性，將導(dǎo)致靶mRNA 的降解。由miRNA 促進(jìn)的mRNA 降解是通過(guò)誘導(dǎo)去腺苷酸化或抑制蛋白質(zhì)合成、抑制帽識(shí)別時(shí)的翻譯起始或誘導(dǎo)核糖體過(guò)早下降完成的。即使在細(xì)胞中生長(zhǎng)停滯的情況下，成熟miRNA也可以增加靶基因的表達(dá)。

2 病毒miRNA與乙肝病毒研究的進(jìn)展

2.1 miRNA和乙型肝炎X蛋白對(duì)宿主基因表達(dá)的調(diào)節(jié)雖然有許多病毒產(chǎn)生特定的miRNA 以操縱宿主的基因編碼，到目前為止還沒(méi)有證據(jù)證實(shí)HBV合成miRNA。有大量的研究認(rèn)識(shí)到HBV調(diào)節(jié)不同的宿主miRNA，但只有少數(shù)確認(rèn)了單個(gè)病毒蛋白在所述調(diào)節(jié)中的作用。有研究證實(shí)在所有病毒蛋白中，乙型肝炎X 蛋白（HBxAg）在調(diào)節(jié)宿主miRNA 中起到了特定功能，在HBx 表達(dá)細(xì)胞中上調(diào)7 個(gè)miRNA 并下調(diào)了11 個(gè)宿主miRNA。HBx靶向miRNA 的反向調(diào)節(jié)Ras，HMGA2，MYC 和STAT3的let-7家族（let-7a，let-7b和let-7c），可調(diào)節(jié)宿主腫瘤形成和免疫應(yīng)答[4]。HBx蛋白也被發(fā)現(xiàn)具有上調(diào)miR-29a的作用，而miR-29a可反向增強(qiáng)肝癌細(xì)胞遷移。此外，HBx 可以下調(diào)miR-101，導(dǎo)致異常DNA 通過(guò)靶向DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶3 甲基化[5]。此外，已經(jīng)證實(shí)通過(guò)HBx蛋白上調(diào)的miRNA-146a可下調(diào)補(bǔ)體因子H并促進(jìn)肝炎的進(jìn)展[6]。

2.2 miRNA調(diào)節(jié)乙肝病毒復(fù)制宿主與病毒的相互作用是目前研究的熱點(diǎn)問(wèn)題，而miRNA 在這種相互作用中起重要作用。到目前為止的多項(xiàng)研究證實(shí)，有大量的宿主miRNA 可以通過(guò)多種方式調(diào)節(jié)HBV復(fù)制，主要是抑制病毒復(fù)制。其中，某些miRNA 直接靶向病毒RNA 阻止其復(fù)制，也有miRNA 靶向特異性宿主基因阻礙病毒繁殖。甚至某些miRNA能夠激活特異性免疫應(yīng)答以抑制病毒。

2.2.1 miRNA 直接抑制乙肝病毒復(fù)制 在病毒基因組中具有靶序列的miRNA 可以直接靶向并抑制HBV。在一項(xiàng)研究中，Wu 等人[7]應(yīng)用計(jì)算分析以確定在HBV基因組中具有靶位點(diǎn)的miRNA，篩選出了靶向聚合酶和表面基因let-7，miR-196b，miR-433，miR-511等。也有其他研究證實(shí)了某些miRNA可直接抑制HBV復(fù)制，包括miR122（靶向mRNA 的編碼區(qū)、病毒聚合酶和HBV 基因組核心蛋白的3' -UTR 區(qū)）[8]，miR199a-3p（靶向HBsAg 編碼區(qū)），miR210（靶向HBV 前S1 區(qū)），miR125a-5p（與HBV 表面抗原相互作用并抑制其表達(dá)）[9]，miR15a（靶向HBx 轉(zhuǎn)錄物，miR20a，miR-92a-1，miR-16-1（HBV 轉(zhuǎn) 錄物）[10]和miR205（靶 向X 基因）[11]。

2.2.2 miRNA 間接抑制乙肝病毒復(fù)制 某些miRNA在HBV基因組中沒(méi)有直接結(jié)合位點(diǎn)但可以通過(guò)與其相關(guān)的其它宿主因子間接調(diào)節(jié)病毒復(fù)制、轉(zhuǎn)錄。在這方面，miR122已經(jīng)被廣泛研究。它是肝特異性的miRNA，通過(guò)復(fù)雜信號(hào)網(wǎng)絡(luò)參與影響HBV感染。目前有些研究表明miR122增強(qiáng)病毒復(fù)制，而某些研究則發(fā)現(xiàn)其抑制病毒復(fù)制。例如，miR122通過(guò)靶向抑制血紅素加氧酶-1促進(jìn)病毒復(fù)制。而miR122 亦通過(guò)靶向CyclinG1 和NDRG3 抑制病毒復(fù)制。miR-141 和miR155 可以通過(guò)直接靶向PPARα（過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α）和C/ EBP-β（CAAT 增強(qiáng)子結(jié)合蛋白β）有效抑制HBV 復(fù)制。miRNA-130a 通 過(guò) 靶 向 作為HBV 轉(zhuǎn) 錄增強(qiáng)子的PGC1α和PPAR抑制HBV的復(fù)制[12]。

2.2.3 miRNA促進(jìn)乙肝病毒復(fù)制 值得注意的是，沒(méi)有確實(shí)的證據(jù)顯示宿主miRNA 可直接促進(jìn)病毒。然而，有些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明某些miRNA 可以增強(qiáng)病毒復(fù)制。例如，Dai 等人[1]的研究表明miR-15b 通過(guò)人肝細(xì)胞核因子1α 激活HBV 增強(qiáng)子I 促進(jìn)HBV 的復(fù)制，而HBx 抑制miR-15b 的表達(dá)。也有研究結(jié)果顯示miR-146a和miR-548通過(guò)抑制特異性宿主免疫因子促進(jìn)HBV復(fù)制[13]。

2.3 miRNA 與HBV 治療許多miRNA 可以抵抗HBV，但是沒(méi)有相關(guān)的臨床試驗(yàn)。在這方面，最重要的是miRNA 的輸入，這是可能引起高度細(xì)胞毒性的。miR122，miR30和miR31已有相關(guān)研究。用于輸入miR122 和miR31 的體miR 樣序列的設(shè)計(jì)已經(jīng)成功地實(shí)現(xiàn)了減少＞80%的病毒復(fù)制。需要關(guān)注的另一個(gè)重點(diǎn)是基于HBV感染的臨床階段的治療管理。miR-29b 模擬物預(yù)防肝纖維化，而miR-99a模擬物顯著抑制HCC期間的腫瘤生長(zhǎng)。

3 miRNA與HBV感染的不同階段

HBV是具有復(fù)雜生命周期的非細(xì)胞病變病毒。有研究已經(jīng)開(kāi)始著眼于與HBV感染的不同階段相關(guān)的miRNA 的特異性作用。然而，這些研究的結(jié)果有時(shí)是矛盾的。值得注意的是肝臟疾?。愿尾?，肝硬化和肝細(xì)胞癌）也可能由于多種其他感染如丙型肝炎病毒（HCV），丁型肝炎病毒（HDV），甲型肝炎病毒（HAV），戊型肝炎病毒（HEV）和環(huán)境因素（例如，酒精性肝病等）引起，并且存在特異性的miRNA作用其中。

3.1 慢性肝炎越來(lái)越多的研究揭示了肝臟特異性miR122 與慢性肝病相關(guān)。研究表明miR122 在HBeAg 陽(yáng)性慢性肝炎患者血液樣品中顯著上升。也有實(shí)驗(yàn)顯示miR372/373 隨著HBV DNA 滴度的升高而上升，因此其可作為慢性肝炎的標(biāo)志物。Chen 等 人 實(shí) 驗(yàn) 表 明let-7c，miR23b，miR122 和miR150可以用于診斷隱匿性HBV感染。

3.2 肝硬化miR29 在所有與肝硬化相關(guān)的miRNA中廣為人知[8-12]。miR29與進(jìn)展性肝硬化/纖維化及其程度呈負(fù)相關(guān)。肝硬化主要由于肝星狀細(xì)胞（HSC）分泌的膠原沉積在肝細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)。有研究顯示miR29 通過(guò)TGF-β 和NF-κB 通路抑制HSC中的膠原分泌基因來(lái)抑制肝硬化/纖維化。miR133a 和miR199 在肝硬化/纖維化過(guò)程中下調(diào)，而miR181b，miR214-5p，miR221 和miR222 在肝硬化過(guò)程中上調(diào)并且因此可以充當(dāng)標(biāo)記物。

3.3 肝細(xì)胞癌HBV，特別是HBx 蛋白，可調(diào)節(jié)不同細(xì)胞miRNA 的表達(dá)并促進(jìn)肝癌的發(fā)生。HBX蛋白促進(jìn)miR-17-92 簇（mir-17-5p，miR-18a，miR-19a，miR-19b，miR-20a 和miR-92a-1）在HBV 相關(guān)的HCC 中升高。同樣的研究也發(fā)現(xiàn)miR21 在HBV 相 關(guān) 的HCC 升 高。Laderio 等 強(qiáng) 調(diào)HBV 相關(guān)HCC 與非HBV 相關(guān)的HCC 相比，miR-96 過(guò)表達(dá)。有研究表明miR155 在HBV 相關(guān)的HCC 中上調(diào)。HBx 蛋白可使miR-122 表達(dá)失調(diào)。HBx 可通過(guò)啟動(dòng)子高甲基化誘導(dǎo)調(diào)節(jié)miR-205 和miR-132 的表達(dá)[14]。HBx 還通過(guò)抑制腫瘤抑制因子p53，減少miR-34，miR-23a，miR-148a，miR-192，miR-125b和miR-200的表達(dá)促進(jìn)肝癌發(fā)生[15]。

4 miRNA多態(tài)性與HBV感染

miRNA 是基因功能的復(fù)雜調(diào)節(jié)物，miRNA 編碼基因中的單核苷酸多態(tài)性（SNP）可能與HBV持久的易感性相關(guān)，并因此與HCC 發(fā)展相關(guān)。在韓國(guó)病例對(duì)照研究中，Cheong 等[16]發(fā)現(xiàn)miR-604基因上的T 等位基因是HBV 相關(guān)慢性肝病患者HCC 發(fā)生的保護(hù)因素。他們也發(fā)現(xiàn)miR-219-1 啟動(dòng)子中的T 等位基因與HBV 清除有強(qiáng)烈相關(guān)性。Yu 等人[17]發(fā)現(xiàn)microRNA-323b 多態(tài)性與乙型肝炎病毒的持續(xù)性相關(guān)，這種多態(tài)性促進(jìn)病毒復(fù)制增強(qiáng)。Xiang 等[18]表明miR-499 多態(tài)性與HBV 相關(guān)HCC的易感性相關(guān)。Xu等人[19]的一項(xiàng)meta分析揭示了miRNA編碼基因中存在三個(gè)常見(jiàn)的功能性SNP，即miR-146a G→C （rs2910164），miR-196a-2C（rs11614913）和miR-499 T→C（rs3746444）。他們發(fā)現(xiàn)編碼miR-146a 和miR-196a-2 的基因中所含的SNP 可能在HCC 的遺傳易感性中起主要作用，miR-146a C 變異與HCC 風(fēng)險(xiǎn)降低有關(guān)。miR-196a-2T變體與高加索人群中HCC的易感性相關(guān)。Su等人[20]的研究也支持miR-146a多態(tài)性在亞洲人HBV相關(guān)HCC的遺傳易感性中可能發(fā)揮作用。

5 miRNA和宿主免疫應(yīng)答

機(jī)體的免疫應(yīng)答包括先天性固有免疫反應(yīng)和后天性適應(yīng)性免疫反應(yīng)，兩者之間相輔相成，共同維護(hù)機(jī)體的免疫穩(wěn)態(tài)。近年來(lái)研究表明，miRNA 不僅參與了免疫細(xì)胞的發(fā)育和分化，也在機(jī)體免疫應(yīng)答調(diào)控機(jī)制中發(fā)揮了重要的作用，是一類新型的免疫調(diào)控分子。但是，有關(guān)miRNA在宿主對(duì)HBV免疫應(yīng)答中的作用的研究很有限。Su等人[21]研究發(fā)現(xiàn)miR155 靶向SOCS1，通過(guò)JAK-STAT 通路增強(qiáng)針對(duì)HBV的抗病毒反應(yīng)。也有研究發(fā)現(xiàn)在乙型肝炎感染期間，miR155的表達(dá)與Toll樣受體7的表達(dá)正相關(guān)。此外，miR-34a靶向CCL22并通過(guò)調(diào)節(jié)T細(xì)胞抑制HBV感染。而miR-146a和miR-548分別靶向STAT1和IFN-λ1以促進(jìn)HBV感染。

6 結(jié)語(yǔ)

近年來(lái)，miRNA 對(duì)免疫反應(yīng)的調(diào)控作用越來(lái)越受到關(guān)注，miRNA 被發(fā)現(xiàn)可作為基因功能的整體調(diào)節(jié)物。使用核苷類似物作為治療策略的限制性和沒(méi)有可用于反映HBV誘導(dǎo)的肝病階段的合適生物標(biāo)志物已受到研究人員的長(zhǎng)期關(guān)注。大規(guī)模研究揭示，有些miRNA 可以被病毒調(diào)節(jié)以促進(jìn)病毒復(fù)制，而有些miRNA 可以抑制病毒的復(fù)制。miR-155參與針對(duì)HBV的免疫應(yīng)答介導(dǎo)病毒抑制，并可以觸發(fā)細(xì)胞凋亡。也有研究[22]稱miR155 參與腫瘤形成，這需要在未來(lái)研究中進(jìn)一步證實(shí)。此外，血液循環(huán)中的miRNA 可作為生物標(biāo)志物，并用于確定HBV臨床階段?？偠灾?，有關(guān)miRNA的研究對(duì)HBV及其相關(guān)肝臟疾病的診斷與治療具有重要作用，具體機(jī)制有待進(jìn)一步探索。