E-Nose結(jié)合GC-MS分析兩種花椒精油成分及其抑菌活性研究

杜云霄，袁小鈞，蔡雪梅，易宇文，鄧靜，喬明鋒*

(1.四川旅游學(xué)院 烹飪科學(xué)四川省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610100；2.四川輕化工大學(xué) 生物工程學(xué)院，四川 宜賓 644000)

花椒(Chinese prickly ash)又名山椒、蜀椒等，屬蕓香科落葉灌木或小喬木，產(chǎn)地廣泛，品種繁多[1]。其成熟果皮富含揮發(fā)油和脂肪，通常通過水蒸氣蒸餾、微波萃取等方法將花椒中的揮發(fā)油提取出來?；ń肪鸵蚱湎阄稘庥舳志?，可賦予食品特殊風(fēng)味，所以常用作家庭調(diào)味料[2-4]。近幾年，食品添加劑的安全問題層出不窮，很多研究者們將目光轉(zhuǎn)移到安全、環(huán)保的天然抑菌劑上，尤其是對(duì)花椒精油的抗氧化、抑菌、殺蟲、抗腫瘤、揮發(fā)性特征風(fēng)味物質(zhì)的研究，但基于同時(shí)使用電子鼻和氣質(zhì)聯(lián)用分析花椒精油風(fēng)味及對(duì)不同種類花椒精油的抗菌活性和復(fù)配使用少有研究[5-10]。

電子鼻(E-nose)是通過模擬人類的嗅覺來實(shí)現(xiàn)對(duì)檢測對(duì)象氣味的總體評(píng)價(jià)，相較于其他智能感官儀器及人體感官，其優(yōu)點(diǎn)在于在響應(yīng)時(shí)間短、線檢測分析、檢測速度快、重復(fù)性好并且能有效避免人為誤差[11-12]；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)是通過對(duì)混合物的分離、定性和定量檢測，實(shí)現(xiàn)對(duì)氣味物質(zhì)進(jìn)行差異性分析，廣泛應(yīng)用于肉制品、調(diào)味品等領(lǐng)域[13-16]。電子鼻結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用分析食品揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)是現(xiàn)代食品風(fēng)味分析的主要手段之一。

本研究通過電子鼻整體性辨別青花椒精油和紅花椒精油的香味差異，利用GC-MS對(duì)兩種花椒精油中的揮發(fā)性化合物進(jìn)行測定，并作出分析和比較；再通過比較兩種抑菌方法對(duì)不同花椒精油抑菌效果的影響和采用相同實(shí)驗(yàn)方法比較分析不同花椒精油對(duì)3種供試菌的抑菌作用，為花椒精油在食品行業(yè)的加工安全、保鮮復(fù)配應(yīng)用提供了理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青花椒精油和紅花椒精油：均采購于昆山晟安生物科技有限公司，源于四川金陽的優(yōu)質(zhì)花椒，采用超臨界CO2萃取法，無任何添加劑、防腐劑；供試菌種及培養(yǎng)基：金黃色葡萄球菌(S.aureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、大腸桿菌(Escherichiacoli)，收藏于四川旅游學(xué)院烹飪科學(xué)四川省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；細(xì)菌液體培養(yǎng)基：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、蒸餾水1000 mL、pH 7.2～7.4；細(xì)菌固體培養(yǎng)基：營養(yǎng)瓊脂33 g、蒸餾水1000 mL、pH 7.2～7.4。

1.2 儀器與設(shè)備

FOX4000電子鼻-氣味分析儀 法國Alpha MOS公司；Clarus 680+SQ8氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國PerkinElmer公司；75 μm CAR/PDMS固相微萃取頭 美國Supelco公司；LDZX-50FB型立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅醫(yī)療器械廠；AUW220電子分析天平 日本島津公司；DL-1可調(diào)節(jié)式電爐；PYX-DHS-600-BS隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱；金凈雙人超凈工作臺(tái)；其他為實(shí)驗(yàn)常用儀器設(shè)備。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 電子鼻分析方法

電子鼻是由18根金屬氧化傳感器組成，可用于檢測花椒風(fēng)味，每一類或幾類敏感性物質(zhì)可被同一根金屬氧化傳感器檢測到。樣品前處理：分別準(zhǔn)確稱量2.00 g樣品A和B，每種共6個(gè)樣，共計(jì)12個(gè)樣。將樣品裝于頂空瓶(10 mL)內(nèi)，然后密封、編號(hào)。參數(shù)的設(shè)置(手動(dòng)進(jìn)樣)：300 s的加熱時(shí)間(采集時(shí)間為120 s，延遲時(shí)間為180 s)，70 ℃的頂空溫度，2000 μL的進(jìn)樣量，150 mL/s的載氣流量，2000 μL/s的進(jìn)樣速度。結(jié)果分析：每個(gè)樣品平行檢測6次，取最后3次傳感器在第120 s時(shí)獲得的穩(wěn)定信號(hào)進(jìn)行分析。

1.3.2 氣質(zhì)聯(lián)用分析方法

頂空條件：取制好的樣品，準(zhǔn)確稱量2.00 g置于15 mL樣品瓶中；平衡時(shí)間10 min，平衡溫度100 ℃；在250 ℃，10 min條件下將萃取頭(已老化)插入樣品瓶中，萃取50 min，隨后進(jìn)樣，解吸10 min。

氣相色譜條件：美國PE Elite-5MS氣相色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；載氣(高純He)，流速1.0 mL/min，不分流進(jìn)樣。升溫程序：40 ℃的初始溫度，保持2 min；再升溫至125 ℃保持2 min，速度為5 ℃/min；最后升溫至250 ℃保持4 min，速度為25 ℃/min。

質(zhì)譜條件：采用全掃描，掃描范圍：35～500 m/z；離子源(EI)，250 ℃的溫度，70 eV的電子轟擊能量。

利用NIST譜庫和人工解譜對(duì)化合物進(jìn)行檢索和確定，再采用峰面積歸一化法計(jì)算化合物的相對(duì)含量。

1.3.3 抑菌活性分析方法

1.3.3.1 菌懸液及含菌平板制備

菌懸液：活化供試菌種，挑取菌苔；含菌平板：將菌懸液與培養(yǎng)基以體積比1∶10充分混合。

1.3.3.2 抑菌圈的測定(濾紙片法和打孔法)

兩個(gè)樣品分別設(shè)置3組平行。濾紙片法：將直徑為6，15 mm的濾紙圓片用10 μL的花椒精油完全浸透，放置于含菌平板上后，用無菌鑷子輕輕按壓。在溫度37 ℃的恒溫箱中培養(yǎng)24 h后，測得數(shù)據(jù)，最后取平均值。打孔法：在含菌平板上均勻打上直徑為10，20 mm的小孔，每孔均用移液槍添加10 μL的花椒精油，37 ℃培養(yǎng)24 h后，測得數(shù)據(jù)，最后取平均值。

1.3.3.3 MIC及MBC的測定(二倍稀釋法)

以50%甲醇做對(duì)照實(shí)驗(yàn)，每個(gè)樣重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。用50%甲醇作為溶劑，制得20，10，5，2.5，1.25，0.63，0.31，0.16 mg/mL濃度的肉湯液體，再向每個(gè)肉湯液體中添加50 μL的菌懸液，在溫度37 ℃的恒溫箱中培養(yǎng)24 h，最后通過肉湯液體的渾濁度判斷花椒精油的MIC值(不渾濁的肉湯對(duì)應(yīng)的最小濃度即為MIC值)。用平板劃線法將測得的MIC值下的肉湯接種至瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h后，無菌生長的精油溶液濃度則為 MBC值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理及作圖均采用Origin 2019、Excel 2010軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 花椒精油風(fēng)味電子鼻分析

采用電子鼻對(duì)編號(hào)為A、B兩種花椒精油樣品(A為紅花椒精油，B為青花椒精油)進(jìn)行檢測。兩種花椒精油電子鼻傳感器響應(yīng)平均值制作的雷達(dá)圖見圖1。

由圖1可知，所有傳感器對(duì)兩個(gè)樣品均有響應(yīng)且有差異，但風(fēng)味指紋圖譜相似，即總體香味類似。比較發(fā)現(xiàn)，LY2型傳感器的響應(yīng)值較低，大部分低于0，說明A、B兩樣品中不含有毒有害氣體或含量極低；兩樣品在 P30/1及P10/1上的響應(yīng)值差異較小但響應(yīng)值較高，說明A、B兩樣品香味物質(zhì)種類和相對(duì)含量接近且烴類物質(zhì)含量可能較高；PA/2對(duì)A的相應(yīng)值高于B，說明可能A中醇類及有機(jī)胺類物質(zhì)總含量高于B。

圖1 兩種花椒精油電子鼻傳感器響應(yīng)值雷達(dá)圖Fig.1 The electronic nose sensor response value radar map of two kinds of Zanthoxylum bungeanum essential oils

2.2 花椒精油風(fēng)味GC-MS分析

2.2.1 揮發(fā)性成分總離子流圖分析

采用HS-SPME收集，通過氣質(zhì)聯(lián)用儀對(duì)兩種花椒精油揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行測定，兩種花椒精油揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)總離子流圖見圖2。通過在質(zhì)譜檢索標(biāo)準(zhǔn)庫 NIST 14中進(jìn)行匹配解析，達(dá)85%以上匹配度的紅花椒有74個(gè)成分，占總組分的99.564%，青花椒有65個(gè)成分，占總組分的98.944%。為進(jìn)一步分析各成分的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)，按峰面積歸一化法計(jì)算結(jié)果，見表1。

A

B

2.2.2 揮發(fā)性物質(zhì)GC-MS檢測結(jié)果分析

兩種花椒精油揮發(fā)性物質(zhì)GC-MS檢測結(jié)果見表1。

表1 兩種花椒精油揮發(fā)性物質(zhì)GC-MS檢測結(jié)果

續(xù) 表

由表1可知，A、B樣品中相同的有28種，其中β-蒎烯、樅油烯、羅勒烯、乙酸、鄰異丙基甲苯等為共有物質(zhì)。芳樟醇和2-氨基苯甲酸-3,7-二甲基-1,6-辛二烯-3-醇酯分別是A、B樣品的主要特征性風(fēng)味物質(zhì)(A為35.987%，B為33.226%)。樅油烯(26.249%)、β-蒎烯(15.125%)、β-水芹烯(5.762%)是A的次要特征性風(fēng)味物質(zhì)，樅油烯(28.945%)、β-蒎烯(14.908%)、萜品烯(7.474%)是B的次要特征性風(fēng)味物質(zhì)。β-水芹烯(5.762%)、γ-松油烯(1.439%)、L-紫蘇醇(3.328%)、芳樟醇(35.987%)是A中特有的成分物質(zhì)，2-氨基苯甲酸-3,7-二甲基-1,6-辛二烯-3-醇酯(33.226%)、萜品烯(7.474%)是B中特有的成分物質(zhì)。

另外，由表1可知，B中的樅油烯和羅勒烯的含量略高于A。據(jù)悉，羅勒烯有草香、花香并伴有橙花油氣息，常用于多種日化香精配方中，并且羅勒烯具有良好的抑菌作用[17-18]，這也可能是使用B作為抑菌劑效果略好于A的原因[19]。其中β-蒎烯和樅油烯是兩種精油共有含量較高的物質(zhì)。β-蒎烯具有抗炎、抑菌、抗氧化的作用，樅油烯具有抗壞血、抗菌、化痰、利肺、鎮(zhèn)靜的作用[20-22]，因此推測花椒精油在食品保鮮的開發(fā)利用中有巨大的潛力[23]。

2.2.3 揮發(fā)性成分種類及含量差異分析

為了更好比較兩種花椒精油揮發(fā)性成分的差異，依據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)分類統(tǒng)計(jì)出兩種花椒精油揮發(fā)性成分?jǐn)?shù)目和相對(duì)百分含量，見表2。萜烯類和醇類物質(zhì)是A樣品的主要揮發(fā)性成分，萜烯類和烴類是A樣品種類較多的成分；B樣品中揮發(fā)性物質(zhì)主要有萜烯類，其次還有其他類(主要是2-氨基苯甲酸-3,7-二甲基-1,6-辛二烯-3-醇酯)，醇類、烴類和醛類是B樣品種類較多的成分。

表2 兩種樣品揮發(fā)性成分種類與含量Table 2 The types and content of volatile components in the two samples

2.2.4 花椒精油對(duì)各供試菌株的抑制活性分析

抑菌圈實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 不同實(shí)驗(yàn)方法的花椒精油抑菌圈實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 The results of inhibition zone of Zanthoxylum bungeanum essential oils by different experimental methods

由表3可知，打孔法測得的抑菌效果均強(qiáng)于濾紙片法，在兩種方法下，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用均為紅花椒精油強(qiáng)于青花椒精油，對(duì)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的抑制作用均為紅花椒精油弱于青花椒精油，其中，兩樣品均對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用最顯著，對(duì)大腸桿菌的抑制作用最弱。

花椒精油具有較強(qiáng)揮發(fā)性，采用濾紙片法會(huì)使花椒精油更易揮發(fā)且不易滲透至培養(yǎng)基，而采用打孔法會(huì)使花椒精油充分注入小孔，較易滲透進(jìn)入培養(yǎng)基作用于供試菌種[24-25]。因此，在實(shí)驗(yàn)條件相同時(shí)，采用打孔法更能準(zhǔn)確、明顯地體現(xiàn)花椒精油的抑菌作用。

MIC值及MBC值的測定結(jié)果見表4。

表4 二倍稀釋法花椒精油抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 The results of inhibition experiment of Zanthoxylum bungeanum essential oils by double dilution method

由表4可知，對(duì)大腸桿菌的抑制作用(對(duì)比MIC值)：紅花椒精油弱于青花椒精油，對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制作用(對(duì)比MBC值)：紅花椒精油弱于青花椒精油，兩樣品均對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC值及MBC值最小，表明在較低濃度下對(duì)供試菌有良好的抑制作用，具有較強(qiáng)的抑菌活性。

3 結(jié)論

研究表明，通過電子鼻、頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用分析，青花椒精油與紅花椒精油在香味上不存在明顯差異，香氣基本一致，揮發(fā)性化合物在數(shù)量和含量上均以萜烯類為主；兩種花椒精油揮發(fā)性物質(zhì)存在不同物質(zhì)上的差異，大部分相同成分含量差異較小，所以推測在某些方面紅花椒精油和青花椒精油可以替代使用或者可以通過復(fù)配使其抑菌作用達(dá)到較優(yōu)效果。打孔法和濾紙片法對(duì)兩種不同花椒精油的抑菌效果差異明顯，且采用打孔法更準(zhǔn)確；在相同實(shí)驗(yàn)條件下，兩樣品均對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用最好，對(duì)大腸桿菌的抑制作用最弱。