OsESV1基因?qū)λ镜矸酆铣傻挠绊?/h1>
2022-03-17 12:08:38王永祥燕海剛徐含聰傅玉雙單壯壯胡曉晴張文偉江玲
中國水稻科學 2022年2期
王永祥 燕海剛 徐含聰 傅玉雙 單壯壯 胡曉晴 張文偉 江玲
基因?qū)λ镜矸酆铣傻挠绊?/p>
王永祥 燕海剛 徐含聰 傅玉雙 單壯壯 胡曉晴 張文偉*江玲
(南京農(nóng)業(yè)大學 作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點實驗室/江蘇省植物基因工程技術研究中心, 南京 210095;*通信聯(lián)系人, E-mail: zhangww@njau.edu.cn)
【】研究水稻()基因?qū)λ镜矸鄞x的影響?！尽客ㄟ^CRISPR-Cas9技術獲得突變體，考查的表型及胚乳淀粉的理化特性，分析的表達特性及相關功能?！尽縊sESV1蛋白在植物界中十分保守。突變體株高、穗長、每穗粒數(shù)低于野生型，分蘗數(shù)顯著多于野生型，葉片中淀粉含量顯著下降，籽粒中的直鏈淀粉含量上升，而總淀粉含量無明顯變化。呈組成型表達，并且具有晝夜節(jié)律表達的特征。OsESV1蛋白定位在葉綠體內(nèi)且呈點狀分布。酵母雙雜交和雙分子熒光互補實驗結(jié)果表明OsESV1蛋白可以與ADP-葡萄糖焦磷酸化酶小亞基(OsAGPS) 2a和OsAGPS1互作?！尽炕蛴绊懰救~片的淀粉合成途徑，而對胚乳淀粉合成的影響不明顯。
水稻；淀粉；胚乳；；互作
水稻是中國的第一大糧食作物，國內(nèi)有65%以上的人口以稻米為主食[1]。淀粉是稻米的主要成分，其含量、組成與水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)直接相關[2]。稻米淀粉在胚乳細胞中合成，已知多種酶參與合成[3-6]。水稻中還克隆了多個粉質(zhì)胚乳基因[7-22]，這些基因均能影響胚乳中淀粉合成，說明除淀粉合成酶之外，還有很多因子參與胚乳淀粉積累。因此，挖掘新的淀粉合成相關基因?qū)τ谏钊肓私獾矸酆铣傻姆肿訖C制，以及提高水稻產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要意義。
研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥中淀粉顆粒結(jié)合蛋白ESV1能調(diào)控葉片中淀粉的降解速度[23]。與野生型相比，葉片在白天的淀粉積累量下降，夜晚的淀粉降解速率增加。同時，根冠、莖、花和角果中的淀粉含量均低于野生型。與野生型相比，葉片中的淀粉顆粒邊緣呈波浪形或有裂紋，過表達ESV1則明顯提高了葉片淀粉含量，產(chǎn)生更厚、更大的淀粉顆粒。對支鏈淀粉鏈長分布的影響很小，但ESV1的缺失和過表達均提高了葉片的直鏈淀粉含量。ESV1同時存在于葉片總蛋白的可溶性和不溶性（淀粉結(jié)合）部分，白天淀粉顆粒生長時，ESV1可與之結(jié)合；晚上淀粉降解時，ESV1則被釋放至葉綠體基質(zhì)中[23]。由于ESV1不含有任何已知結(jié)構(gòu)域，推測它可能有利于淀粉的半晶體片層結(jié)構(gòu)形成，從而限制淀粉水解酶接近淀粉，葉片中淀粉結(jié)構(gòu)的有序性降低，導致淀粉易被水解酶降解，因而增加了淀粉降解的速度。已證實ESV1影響特定水解酶在淀粉顆粒表面的作用[24]。
綜上所述，擬南芥的研究主要集中于對葉片淀粉合成和降解的影響。為探究水稻同源基因?qū)ε呷榈矸酆铣傻挠绊?，本研究利用CRISPR-Cas9基因編輯技術，構(gòu)建了突變體材料，考查了其表型及胚乳淀粉的理化特性，初步分析在淀粉合成中的功能及其作用機制，為深入研究對淀粉合成的影響奠定基礎。
1 材料與方法
1.1 材料來源與種植條件
突變體源自粳稻品種W017，采用CRISPR-Cas9系統(tǒng)進行基因敲除獲得。參照汪秉琨等[25]的方法，設計靶位點為AGCACCTGGTACA GGGAGAGTGG，構(gòu)建CRISPR/Cas9載體，并轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)，利用農(nóng)桿菌介導法侵染W(wǎng)017愈傷組織，篩選培養(yǎng)獲得T0轉(zhuǎn)基因植株[26]。經(jīng)潮霉素鑒定為陽性的植株，采用CTAB法提取葉片DNA[27]，并用特異性的引物（表1）擴增獲得PCR產(chǎn)物，測序確定突變位點。突變體經(jīng)加代繁育得到純合種子。2020年正季，將野生型和突變體種植在南京農(nóng)業(yè)大學牌樓基地，冬季種植在海南陵水基地。
1.2 進化樹構(gòu)建和生物信息分析
參照水稻基因組注釋計劃數(shù)據(jù)庫(http://rice. plantbiology.msu.edu/)網(wǎng)站提供的水稻基因 ()序列信息，在NCBI (http://www.ncbi. nlm.nih.gov/)網(wǎng)站下載獲得不同物種的ESV1同源蛋白序列，利用MEGA6.0軟件中鄰位相連法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(Bootstrap=1000)，同時利用ClustalX2和Genedoc軟件進行OsESV1及其同源蛋白的氨基酸序列比對。利用 SignalP 4.1 Server (http://www.cbs.dtu.dk/ services/SignalP-4.1/)網(wǎng)站進行信號肽預測，基于PROSITE數(shù)據(jù)庫 (https://www.expasy.org/)進行OsESV1蛋白結(jié)構(gòu)的分析。
1.3 葉片的碘染和淀粉含量測定
野生型和幼苗在人工氣候箱中（28℃，光照12 h）生長至4周，分別取白天和夜晚結(jié)束時的葉片，用無水乙醇浸泡，沸水浴20 min除去葉綠素后，用Lugol solution (Sigma)染色10 min，再用水浸泡1 h后觀察。生長6周齡的葉片用液氮研磨后80℃下干燥24 h，同上脫色除去葉綠素，采用Megazyme公司的K-TSTA淀粉總量檢測試劑盒測定總淀粉含量[28]。
1.4 農(nóng)藝性狀考查及種子胚乳理化特性分析
選取野生型和(T2代) 成熟植株各10株，考查株高、穗長、分蘗數(shù)、每穗粒數(shù)、一次枝梗數(shù)和千粒重等農(nóng)藝性狀。
成熟種子去除穎殼，磨成精米粉過篩（100目），50℃下烘至恒重。使用Megazyme公司生產(chǎn)的總淀粉檢測試劑盒TSTA進行胚乳總淀粉含量的測定。參照《農(nóng)業(yè)部標準米質(zhì)測定方法：NY147?88》測定胚乳直鏈淀粉含量。精確稱量3 g精米粉，加入25 mL的蒸餾水，使用快速黏度分析儀(Rapid Visco Analyser，瑞典Perten)測定米粉的黏度特性[29]。
1.5 組織表達模式分析
水稻開花期間，下午對野生型的各個組織進行取樣，并取花后3～24 d的穎果，液氮保存，用于的組織表達分析。在夜晚結(jié)束時，選取人工氣候箱中（28℃，光照12 h）生長至4周的野生型幼苗3株，每隔4 h采集一次葉片至24 h，用于的節(jié)律表達分析。
使用天根公司的植物RNA提取試劑盒，提取野生型和突變體不同組織的RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScript RT Reagent Kit, TaKaRa)的使用說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第1鏈。用寶生物染料法熒光定量試劑盒(SYBR premix Ex TaqTM, TaKaRa)，在PCR儀(C1000 TouchTMThermal Cycler, BIO-RAD)上運行程序：95℃下30 s；95℃下5 s、60℃下30 s，39個循環(huán)；95℃下15 s、60℃下1 min，95℃下15 s。反應體系為20 μL：5 μL cDNA模板，10 μmol/L正反向引物各2.5 μL，10 μL 2×SYBR Premix ExII。每個樣品設置3個重復，以水稻作為內(nèi)參, 用2法計算相對表達水平[30]。所用引物見表1。
1.6 亞細胞定位
用野生型幼苗cDNA擴增的全長cDNA序列，并克隆到pAN580載體中，獲得pAN580-OsESV1-GFP載體（35S啟動子），轉(zhuǎn)化水稻原生質(zhì)體并觀察定位[31]。同理構(gòu)建p1305-OsESV1-GFP融合載體（35S啟動子），轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌并侵染4周齡煙草，48 h之后觀察定位[32]。使用Leica公司的SP8型激光共聚焦顯微鏡檢測熒光信號。所用引物見表1。
1.7 酵母雙雜
用野生型幼苗cDNA擴增OsESV1、OsAGPS1、OsAGPS2a、OsAGPS2b、ADP-葡萄糖焦磷酸化酶大亞基(OsAGPL) 1、可溶性淀粉合成酶(SS)Ⅰ、SSⅡa、SSⅡb、淀粉分支酶(BE)Ⅰ及BEⅡb的cDNA序列，分別克隆到pGADT7或pGBKT7載體上，并將不同的載體組合共轉(zhuǎn)到酵母AH109中，在二缺培養(yǎng)基 (SD/-Leu/-Trp)上30℃培養(yǎng)2～3 d后，挑菌在四缺培養(yǎng)基(SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade)上進行篩選。pGADT7和pGBKT7載體購自Clontech公司，按照試劑盒的方法進行酵母感受態(tài)細胞的制備和轉(zhuǎn)化。所用引物見表1。
表1 實驗所用引物
1.8 雙分子熒光互補實驗
將、和全長cDNA序列分別克隆到p2YC和p2YN載體上，參照1.6方法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌后侵染4周齡煙草，48 h后用激光共聚焦顯微鏡觀察熒光信號[32]。所用引物的信息列于表1。
2 結(jié)果與分析
2.1 OsESV1及其同源蛋白的保守性分析。
進化樹分析結(jié)果表明，ESV1蛋白在植物中普遍存在，并且水稻中的OsESV1與擬南芥AtESV1高度同源（圖1-A），氨基酸序列比結(jié)果表明，OsESV1蛋白與擬南芥、玉米和亞洲棉ESV1同源蛋白均包含一段高度保守的富含色氨酸的序列，并且在C端有一段富含脯氨酸的序列，N端的序列相似度不高（圖1-B）。這種保守性說明ESV1在植物中具有比較基礎的功能。
2.2 osesv1的基因突變
水稻基因含11個外顯子和10個內(nèi)含子（圖2-A），編碼含431個氨基酸殘基的蛋白（圖2-B）。生物信息學分析表明，OsESV1沒有信號肽及跨膜結(jié)構(gòu)域。為了研究的功能，采用CRISPR-Cas9系統(tǒng)獲得了兩種基因編輯形式的突變體（圖2-C）。測序結(jié)果表明，突變體中的第3個外顯子有11個堿基的缺失，突變體中的第3個外顯子有1個單堿基的插入（圖2-A）基因的這兩種編輯類型均導致移碼突變和翻譯的提前終止，因此均編碼缺失富含色氨酸區(qū)和富含脯氨酸區(qū)的截短蛋白（圖2-B）。qRT-PCR結(jié)果表明，突變體中的表達在白天和晚上結(jié)束時均顯著低于野生型（圖2-D）。
成熟植株的株高、穗長和每穗粒數(shù)均顯著低于野生型，而分蘗數(shù)顯著高于野生型，千粒重則無明顯差異（表2）。由于淀粉代謝缺陷，突變植株表現(xiàn)嚴重的發(fā)育異常和形態(tài)缺陷[23]，但植株未出現(xiàn)明顯的發(fā)育異常（圖2-C）。
A—OsESV1及其同源蛋白的進化樹分析，蛋白名采用相應的GenBank 序列登錄號；B—多氨基酸序列比對，星號表示20個氨基酸的間隔，淺紅色區(qū)域為富含色氨酸(W)區(qū)，保守色氨酸殘基下用“：”標注，黃色區(qū)域為富含脯氨酸(P)區(qū)。
Fig. 1. The conservation analysis of OsESV1.
2.3 osesv1對葉片中淀粉合成的影響
對野生型和突變體的葉片進行碘染色分析，發(fā)現(xiàn)在白天和夜晚結(jié)束時，突變體葉片的碘染色程度均比野生型淺，說明葉片中的淀粉含量低于野生型（圖3-A）。淀粉含量測定結(jié)果也證實葉片中的淀粉含量顯著低于野生型（圖3-B）。
2.4 osesv1對種子中淀粉合成的影響
對野生型及突變體成熟種子進行比較，發(fā)現(xiàn)突變體種子外觀無明顯變化（圖4-A）。種子的總淀粉含量無明顯變化，但直鏈淀粉含量顯著升高（圖4-B、C），這一點與突變體相似。RVA分析表明，野生型與突變體胚乳淀粉的黏度曲線呈現(xiàn)相似的趨勢（圖4-D）。
2.5 OsESV1基因的表達分析
基于的突變表型，我們首先對的組織表達譜進行了分析。結(jié)果表明，基因在水稻的根、莖、葉、葉鞘、幼穗中都有表達，且在花后12 d的胚乳中表達較高（圖5-A）。同時對晝夜節(jié)律表達的分析表明，在黎明時表達量上升達到最高峰，表達量是其他時間點的40倍以上，而其他時間點的表達量均較低（圖5-B），表明該基因的表達具有晝夜節(jié)律性。
A—OsESV1的基因結(jié)構(gòu)。深灰和淺灰方塊分別表示外顯子區(qū)域和UTR區(qū)域，方塊之間的黑色連線表示內(nèi)含子，下面為野生型和osesv1靶位點基因序列比較，連續(xù)的點表示缺失的序列，插入的堿基加粗標示，紅色標注為原間隔基序(protospacer adjacent motif , PAM) TGG；B—野生型和突變體的OsESV1蛋白結(jié)構(gòu)。箭頭標注富含色氨酸區(qū)（Trp-rich region）和富含脯氨酸區(qū)（Pro-rich region）；C—野生型和osesv1植株，標尺為10 cm；D—野生型和osesv1幼苗在白天和夜晚結(jié)束時OsESV1基因的表達水平。數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差(n=3)。*和**分別表示差異達0.05和0.01顯著水平（t檢驗）。下同。
Fig. 2. Phenotype of themutants.
表2 野生型和osesv1的農(nóng)藝性狀
數(shù)據(jù)表示為均值±標準差（=10）。
Values are means ± SD (=10).
2.6 OsESV1定位于葉綠體
通過UniProt (https://www.uniprot.org/)網(wǎng)站預測，OsESV1蛋白定位于葉綠體。為了確認OsESV1的亞細胞定位，在水稻原生質(zhì)體中瞬時表達OsESV1-GFP。結(jié)果表明，OsESV1-GFP融合蛋白定位于葉綠體內(nèi)，呈點狀分布（圖6-A）。同樣，OsESV1-GFP在煙草表皮細胞中瞬時表達，也是在葉綠體內(nèi)呈點狀分布（圖6-B）。
A—白天和夜晚結(jié)束時野生型(WT)和osesv1葉片的碘染觀察; B—白天和夜晚結(jié)束時野生型(WT)和osesv1葉片的淀粉含量測定。
Fig. 3. Starch contents in leaves of WT and
A—野生型(WT)和osesv1的成熟種子表型，標尺為5 mm；B, C—野生型(WT)和osesv1種子總淀粉含量、直鏈淀粉含量；D—野生型和osesv1胚乳淀粉的黏度曲線。
Fig. 4. Phenotype ofgrains andphysicochemical properties of endosperm starch
2.7 OsESV1與OsAGP互作
在突變體中，白天結(jié)束時葉片中的淀粉含量顯著低于野生型。為探討對淀粉合成途徑存在的可能影響，將OsESV1與一系列淀粉合成酶進行酵母雙雜。結(jié)果表明，OsESV1可以與OsAGPS2a和OsAGPS1在酵母細胞中互作（圖7）。OsAGP是淀粉合成的限速酶，為淀粉合成提供前體物質(zhì)ADP葡萄糖[4, 6]。水稻中OsAGP的小亞基包括OsAGPS1和OsAGPS2兩種亞型，OsAGPS1主要存在于胚乳的造粉體中，OsAGPS2a主要存在于葉片的葉綠體中[33-34]。
2.8 OsESV1與OsAGP互作的驗證
我們利用雙分子熒光互補實驗(BiFC)來進一步驗證OsESV1與OsAGPS2a和OsAGPS1的互作。結(jié)果表明，在煙草表皮細胞中的葉綠體中，OsESV1可以分別與OsAGPS2a和OsAGPS1互作，并且熒光在葉綠體內(nèi)呈點狀分布（圖8）。
A—OsESV1在野生型不同組織及胚乳發(fā)育不同時期的表達水平；B—OsESV1的晝夜節(jié)律表達。黑框和白框分別表示黑夜和白天的時間軸。
Fig. 5. Expression pattern of
A—OsESV1-GFP融合蛋白在水稻原生質(zhì)體中的表達，pAN580-GFP空載體作為對照，標尺為20 μm；B—OsESV1-GFP融合蛋白在煙草表皮細胞中的表達，p1305-GFP空載體作為對照，標尺為20 μm。
Fig. 6. Subcellular localization of OsESV1.
二缺：SD-Leu/-Trp；四缺：SD-Leu/-Trp/-His/-Ade。
Fig. 7. Yeast two-hybrid assays show that OsESV1 can interact with OsAGPS2a and OsAGPS1.
3 討論
本研究采用CRISPR-Cas9基因編輯技術獲得了突變體，并對基因的功能進行了初步的研究。與野生型相比，和葉片中的淀粉含量在白天結(jié)束時分別減少了22%和52%（圖3-B），但成熟種子的淀粉含量并沒有明顯變化（圖4-B），因而與不同(突變對種子中的淀粉合成沒有明顯影響)。類似的報道還有擬南芥)在水稻中的同源基因()[28]。研究發(fā)現(xiàn)，PTST1作為腳手架蛋白，能介導顆粒結(jié)合淀粉合酶（granule bound starch synthase, GBSS）靶定到淀粉顆粒上，后者直接負責直鏈淀粉的合成。在擬南芥突變體葉片中，靶定到淀粉顆粒上的GBSS變少，葉片中幾乎檢測不到直鏈淀粉[35]。水稻突變體葉片中也幾乎不含直鏈淀粉，但是胚乳中直鏈淀粉的含量沒有明顯變化，且多數(shù)GBSS蛋白仍能與胚乳中的淀粉結(jié)合[36]。突變導致葉片與籽粒表型的差異，與本研究報道的相似。
Bars = 10 μm.
Fig. 8. BiFC assays show that OsESV1 can interact with OsAGPS2a and OsAGPS1 in tobacco epidermal cells.
突變導致白天葉片中淀粉含量下降，作者認為葉片淀粉合成的同時發(fā)生降解，所以淀粉含量下降[23]。本研究中的酵母雙雜和BiFC實驗表明，OsESV1可與OsAGPS2a互作（圖7和圖8）。研究表明，OsAGPS2a在水稻葉片的淀粉合成中起到主要作用[33]。因此OsESV1與OsAGPS2a的互作，可能是OsESV1影響葉片淀粉合成的另一種方式。
本實驗結(jié)果表明，OsESV1還與OsAGPS1互作（圖7和圖8）。OsAGPS1與OsAGPL1形成異源四聚體，定位于胚乳造粉體內(nèi)，在胚乳發(fā)育早期的淀粉合成中起作用[34]。而水稻造粉體內(nèi)OsAGP活性只占胚乳OsAGP總活性的10%，主要由細胞質(zhì)中的OsAGP負責提供ADP-葡萄糖合成淀粉[37]，比如突變體籽粒的淀粉合成幾乎未受影響[38]，因此，造粉體中的AGP對于胚乳淀粉合成應該是非必需的。我們推測，由于OsESV1與OsAGPS1在質(zhì)體上互作，而種子造粉體中的OsAGP對種子淀粉合成幾乎沒有影響，所以的突變對種子中的淀粉合成沒有明顯影響。
AtESV1可以結(jié)合淀粉顆粒，OsESV1與其高度同源，且兩者均在葉綠體內(nèi)呈點狀分布（圖6），推測OsESV1可能也具有結(jié)合淀粉顆粒的特性。OsESV1與OsAGPS2a和OsAGPS1互作的熒光在葉綠體內(nèi)也呈現(xiàn)點狀分布，可能是結(jié)合淀粉顆粒的形式（圖8）。我們通過分析發(fā)現(xiàn)OsAGP本身并沒有結(jié)合淀粉的典型結(jié)構(gòu)域或結(jié)合位點，是否OsAGPS2a與OsAGPS1借助OsESV1靶定到淀粉顆粒上，需要進一步的實驗證據(jù)。目前已有報道，一些淀粉綁定蛋白作為腳手架蛋白，介導淀粉代謝酶靶定到淀粉顆粒上，如FLOURY ENDOSPERM 6可能作為腳手架蛋白，與異淀粉酶（Isoamylase 1，ISA1）互作，調(diào)控ISA1與淀粉的結(jié)合[12]；PTST1介導GBSS靶向到淀粉顆粒[35]；LIKE SEX4 1介導β-淀粉酶定位于淀粉顆粒表面[39]。
綜上所述，可能與OsAGP互作，影響水稻的淀粉合成。我們下一步計劃獲得過表達基因的材料，進一步探討在水稻淀粉合成中的作用。
謝 辭：農(nóng)業(yè)部長江中下游粳稻生物學與遺傳育種重點實驗室、長江流域雜交水稻協(xié)同創(chuàng)新中心、現(xiàn)代作物生產(chǎn)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心給予大力支持，謹致謝意。
[1] 侯立剛, 周廣春, 嚴永峰, 全成哲, 馬巍. 吉林省水稻產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀與未來發(fā)展對策[J]. 北方水稻, 2015, 45(2): 73-75.
Hou L G, Zhou G C, Yan Y F, Quan C Z, Ma W. Analysis on the development status and the counter- measures of rice industry in Jilin[J]., 2015, 45(2): 73-75. (in Chinese with English abstract)
[2] 方鵬飛, 李三峰, 焦桂愛, 謝黎虹, 胡培松, 魏祥進, 唐紹清.水稻粉質(zhì)胚乳突變體的理化性質(zhì)及基因定位[J]. 中國水稻科學, 2014, 28(5): 447-457.
Fang P F, Li S F, Jiao G A, Xie L H, Hu P S, Wei X J, Tang S Q. Physicochemical property analysis and gene mapping of a floury endosperm mutantin rice[J].2014, 28(5): 447-457. (in Chinese with English abstract)
[3] 蔡躍. 水稻心白胚乳突變體的基因克隆及功能分析[D]. 南京: 南京農(nóng)業(yè)大學, 2018.
Cai Y. Gene cloning and functional analysis of rice white-core endosperm mutant[D]. Nanjing: Nanjing Agricultural University, 2018. (in Chinese with English abstract)
[4] Tetlow I J, Emes M J. Starch biosynthesis in the developing endosperms of grasses and cereals[J]., 2017, 7(4): 81.
[5] Okita T W, Nakata P A, Anderson J M, Sowokinos J, Morell M, Preiss J. The subunit structure of potato tuber ADPglucose pyrophosphorylase[J]., 1990, 93(2): 785-790.
[6] Geigenberger P. Regulation of starch biosynthesis in response to a fluctuating environment[J]., 2011, 155(4): 1566-1577.
[7] Kaushik R P, Khush G S. Genetic analysis of endosperm mutants in riceL. [J], 1991, 83(2): 146-152.
[8] Wu Y, Pu C, Lin H, Huang H, Huang Y, Hong C, Chang M, Lin Y. Three novel alleles of() confer dull grains with low amylose content in rice[J]., 2015, 233: 44-52.
[9] Nishio T, Iida S. Mutants having a low content of 16-kDa allergenic protein in rice (L)[J]., 1993, 86(2-3): 317-321.
[10] Kang H G, Park S, Matsuoka M, An G. White-core endosperm floury endosperm-4 in rice is generated by knockout mutations in the C-type pyruvate ortho- phosphate dikinase gene ()[J]., 2010, 42(6): 901-911.
[11] Ryoo N, Yu C, Park C S, Baik M Y, Baik M Y, Park I M, Cho M H, Bhoo S H, An G, Hahn T R, Jeon J S. Knockout of a starch synthase genecauses white-core floury endosperm in rice (L.)[J]., 2007, 26(7): 1083-1095.
[12] Peng C, Wang Y, Liu F, Ren Y, Zhou K, Lü J, Zheng M, Zhao S, Zhang L, Wang C, Jiang L, Zhang X, Guo X, Bao Y, Wan J.encodes a CBM 48 domain-containing protein involved in compound granule formation and starch synthesis in rice endosperm[J]., 2014, 77(6): 917-930.
[13] Zhang L, Ren Y, Lu B, Yang C, Feng Z, Liu Z, Chen J, Ma W, Wang Y, Yu X, Wang Y, Zhang W, Wang Y, Liu S, Wu F, Zhang X, Guo X, Bao Y, Jiang L, Wan J.encodes a regulator of starch synthesis and amyloplast development essential for peripheral endosperm development in rice[J]., 2016(3): 633-647.
[14] Long W, Dong B, Wang Y, Pan P, Wang Y, Liu L, Chen X, Liu X, Liu S, Tian Y, Chen L, Wan J., encoding the UDP-glucose pyrophos- phorylase 1, affects the synthesis and structure of starch in rice endosperm[J]., 2017, 60(5): 513-522.
[15] 劉藝, 朱小品, 劉喜, 田云錄, 劉世家, 王云龍, 張文偉, 江玲, 王益華, 萬建民. 水稻胚乳粉質(zhì)突變體 flo9 的表型分析和基因定位[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學學報, 2018, 41(4): 616-624.
Liu Y, Zhu X P, Liu X, Tian Y L, Liu S J, Wang Y L, Zhang W W, Jiang L, Wang Y H, Wan J M.Phenotyping and gene-mapping of a floury endosperm mutantin rice[J]., 2018, 41(4): 616-624. (in Chinese with English abstract)
[16] Wu M, Ren Y, Cai M,Wang Y, Zhu S, Zhu J, Hao Y, Teng X, Zhu X, Jing R, Zhang H, Zhong M, Wang Y, Lei C, Zhang X, Guo X, Cheng Z,Lin Q, Wang J, Jiang L, Bao Y, Wang Y, Wan J. Riceencodes a pentatricopeptide repeat protein that is essential for the trans-splicing of mitochondrial nad1 intron 1 and endosperm development[J]., 2019, 223(2): 736-750.
[17] Zhu X, Teng X, Wang Y, Hao Y, Jing R, Wang Y, Liu Y, Zhu J, Wu M, Zhong M, Chen X, Zhang Y, Zhang W, Wang C, Wang Y, Wan J.encoding a plastid heat shock protein 70 is essential for amyloplast development in rice[J]., 2018, 277: 89-99.
[18] Zhong M, Liu X, Liu F,Ren Y, Wang Y, Zhu J, Teng X, Duan E, Wang F, Zhang H, Wu M, Hao Y, Zhu X, Jing R, Guo X, Jiang L, Wang Y, Wan J.encoding alanine aminotransferase 1 regulates carbon and nitrogen metabolism in rice[J]., 2019, 62(1): 61-73.
[19] Hu T, Tian Y, Zhu J, Wang Y, Jing R, Lei J, Sun Y, Yu Y, Li J, Chen X, Zhu X, Hao Y, Liu L, Wang Y, Wan J.encoding a mitochondrial complex I subunit is essential for embryo development and starch synthesis in rice[J]., 2018, 37(12): 1667-1679.
[20] Xue M, Liu L, Yu Y, Zhu J, Gao H, Wang Y, Wan J. Lose-of-function of a rice nucleolus-localized pentatrico- peptide repeat protein is responsible for the flourymutant phenotypes[J]., 2019, 12(1): 1-15.
[21] You X, Zhang W, Hu J, Jing R, Cai Y, Feng Z, Kong F, Zhang J, Yan H, Chen W, Chen X, Ma J, Tang X, Wang P, Zhu S, Liu L, Jiang L, Wan J.encodes a glyoxalase I involved in compound granule formation and starch synthesis in rice endosperm[J]., 2019, 38(3): 345-359.
[22] Teng X, Zhong M, Zhu X,Wang C, Ren Y, Wang Y, Zhang H, Jiang L, Wang D, Hao Y, Wu M, Zhu J, Zhang X, Guo X, Wang Y, Wan J.encoding a NAD-dependent cytosolic malate dehydrogenase plays an important role in starch synthesis and seed development in rice[J]., 2019, 17(10): 1914-1927.
[23] Feike D, Seung D，Graf A, Bischof S, Ellick T, Coiro M, Soyk S, Eicke S, Mettler-Altmann T, Lu K J, Trick M, Zeeman S C, Smith A M. The starch granule-associated protein EARLY STARVATION1 is required for the control of starch degradation inleaves[J]., 2016, 28(6): 1472-1489.
[24] Malinova I, Mahto H, Brandt F,AL-Rawi S, Qasim H, Brust H, Hejazi M, Fettk J. EARLY STARVATION 1 specifically affects the phosphorylation action of starch- related dikinases[J]., 2018, 95(1): 126-137.
[25] 汪秉琨, 張慧, 洪汝科, 張錦, 楊睿, 羅瓊, 曾千春. CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯水稻基因[J]. 中國水稻科學, 2018, 32(1): 35-42.
Wang B K, Zhang H, Hong R K, Zhang J W, Yang R, Luo Q, Zeng Q C.gene editing via CRISPR/Cas9 system in rice[J].2018, 32(1): 35-42. (in Chinese with English abstract)
[26] 曾千春, 李旭剛, 馬炳田, 陳松彪, 徐鴻林, 孟昆, 魏曉麗, 朱禎. 有效去除農(nóng)桿菌和秈稻轉(zhuǎn)化系統(tǒng)優(yōu)化[J]. 分子植物育種, 2003, 1(5): 783-790.
Zeng Q C, Li X G, Ma B T, Chen S B, Xu H L, Meng K, Wei X L, Zhu Z. Efficient elimination ofand optimization of-mediated transformation of indica rice[J]., 2003, 1(5): 783-790. (in Chinese with English abstract)
[27] 王慧娜, 初志戰(zhàn), 馬興亮, 李日清, 劉耀光. 高通量的 PCR 模板植物基因組 DNA 制備方法[J]. 作物學報, 2013, 39(7): 1200-1205.
Wang H N, Chu Z Z, Ma X L, Li R Q, Liu Y G. A high through-put protocol of plant genomic DNA preparation for PCR[J]., 2013, 39(7): 1200-1205. (in Chinese with English abstract)
[28] Wang W, Wei X, Jiao G, Chen W, Wu Y, Sheng Z, Hu S, Xie L, Wang J, Tang S, Hu P.-, encoding a CBM48 domain-containing protein, affects rice quality and yield[J]., 2020, 62(7): 948-966.
[29] Tong C, Chen Y, Tang F, Xu F, Huang Y, Chen H, Bao J. Genetic diversity of amylose content and RVA pasting parameters in 20 rice accessions grown in Hainan, China[J]., 2014, 161: 239-245.
[30] Livak K J, Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2[-Delta Delta C(T)] method[J]., 2001, 25(4): 402-408.
[31] Chen S, Tao L, Zeng L, Vega-Sanchez M E, Umemura K, Wang G. A highly efficient transient protoplast system for analyzing defence gene expression and protein- protein interactions in rice[J]., 2010, 7(5): 417-427.
[32] Waadt R, Kudla J. In planta visualization of protein interactions using bimolecular fluorescence comple- mentation (BiFC)[J]., 2008(4): pdb, prot4995.
[33] Ohdan T, Francisco P B, Sawada T, Hirose T, Terao T, Satoh H, Nakamura Y. Expression profiling of genes involved in starch synthesis in sink and source organs of rice[J]., 2005, 56(422): 3229-3244.
[34] Lee S K, Hwang S K, Han M, Eom J S, Kang H G, Han Y, Choi S B, Cho M H, Bhoo S H, An G, Hahn T R, Okita T W, Jeon J S. Identification of the ADP-glucose pyrophosphorylase isoforms essential for starch synthesis in the leaf and seed endosperm of rice (L.)[J]., 2007, 65(4): 531-546.
[35] Seung D, Soyk S, Coiro M, Maier B A, Eicke S, Zeeman S C.is required for localizing GRANULE-BOUND STARCH SYNTHASE to starch granules and for normal amylose synthesis in[J]., 2015, 13(2): e1002080.
[36] Abt M R, Zeeman S C. Evolutionary innovations in starch metabolism[J]., 2020, 55: 109-117.
[37] Sakulsingharoj C, Choi S B, Hwang S K, Edwards G E, Bork J, Meyer C R, Preiss J, Okita T W. Engineering starch biosynthesis for increasing rice seed weight: the role of the cytoplasmic ADP-glucose pyropho- sphorylase[J]., 2004, 167(6): 1323-1333.
[38] Cook F R, Fahy B, Trafford K. A rice mutant lacking a large subunit of ADP-glucose pyrophosphorylase has drastically reduced starch content in the culm but normal plant morphology and yield[J]., 2012, 39: 1068-1078.
[39] Comparot-Moss S, K?tting O, Stettler M, Edner C, Graf A, Weise S E, Streb S, Lue W L, MacLean D, Mahlow S, Ritte G, Steup M, Chen J, Zeeman S C, Smith A M. A putative phosphatase, LSF1, is required for normal starch turnover inleaves[J]., 2010, 152(2): 685-697.
Effects ofon Starch Synthesis in Rice
WANG Yongxiang, YAN Hangang, XU Hancong, FU Yushuang, SHAN Zhuangzhuang, HU Xiaoqing, ZHANG Wenwei*, JIANG Ling
(State Key Laboratory for Crop Genetics and Germplasm Enhancement, Jiangsu Plant Gene Engineering Research Center, Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095, China;*Corresponding author, E-mail: zhangww@njau.edu.cn)
【】It is important to reveal the role of() in starch metabolism of rice.【】Themutants were obtained by using the CRISPR-Cas9 system. The phenotype and the physicochemical properties of endosperm starch ofwere investigated. The expression pattern and function ofwere analyzed. 【】The OsESV1 protein was conserved inplants. Compared with the wildtype, themutants exhibited lower plant height, panicle length, and grain number per panicle, but higher tiller number. Though the starch contents inleavessignificantly decreased, the total starch contents ofgrains did not obviously altered and the amylose contents increased. The expression ofwas constitutive and rhythmic. OsESV1 was located in chloroplasts with a dot-like distribution. Yeast two-hybrid and bimolecular fluorescence complementation(BiFC) assays showed thatOsESV1 could interact with ADP glucose pyrophosphorylase small subunit (OsAGPS) 2a and OsAGPS1.【】significantly affects the starch synthesis pathway in rice leaves, while not in endosperm.
rice; starch; endosperm;; interaction
10.16819/j.1001-7216.2022.210308
2021-03-19；
2021-05-12。
國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(2016ZX08001006)；國家重點研發(fā)計劃資助項目（2016YFD0100101-08）。
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王永祥 燕海剛 徐含聰 傅玉雙 單壯壯 胡曉晴 張文偉 江玲
基因?qū)λ镜矸酆铣傻挠绊?/p>
王永祥 燕海剛 徐含聰 傅玉雙 單壯壯 胡曉晴 張文偉*江玲
(南京農(nóng)業(yè)大學 作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點實驗室/江蘇省植物基因工程技術研究中心, 南京 210095;*通信聯(lián)系人, E-mail: zhangww@njau.edu.cn)
【】研究水稻()基因?qū)λ镜矸鄞x的影響?！尽客ㄟ^CRISPR-Cas9技術獲得突變體，考查的表型及胚乳淀粉的理化特性，分析的表達特性及相關功能?！尽縊sESV1蛋白在植物界中十分保守。突變體株高、穗長、每穗粒數(shù)低于野生型，分蘗數(shù)顯著多于野生型，葉片中淀粉含量顯著下降，籽粒中的直鏈淀粉含量上升，而總淀粉含量無明顯變化。呈組成型表達，并且具有晝夜節(jié)律表達的特征。OsESV1蛋白定位在葉綠體內(nèi)且呈點狀分布。酵母雙雜交和雙分子熒光互補實驗結(jié)果表明OsESV1蛋白可以與ADP-葡萄糖焦磷酸化酶小亞基(OsAGPS) 2a和OsAGPS1互作?！尽炕蛴绊懰救~片的淀粉合成途徑，而對胚乳淀粉合成的影響不明顯。
水稻；淀粉；胚乳；；互作
水稻是中國的第一大糧食作物，國內(nèi)有65%以上的人口以稻米為主食[1]。淀粉是稻米的主要成分，其含量、組成與水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)直接相關[2]。稻米淀粉在胚乳細胞中合成，已知多種酶參與合成[3-6]。水稻中還克隆了多個粉質(zhì)胚乳基因[7-22]，這些基因均能影響胚乳中淀粉合成，說明除淀粉合成酶之外，還有很多因子參與胚乳淀粉積累。因此，挖掘新的淀粉合成相關基因?qū)τ谏钊肓私獾矸酆铣傻姆肿訖C制，以及提高水稻產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要意義。
研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥中淀粉顆粒結(jié)合蛋白ESV1能調(diào)控葉片中淀粉的降解速度[23]。與野生型相比，葉片在白天的淀粉積累量下降，夜晚的淀粉降解速率增加。同時，根冠、莖、花和角果中的淀粉含量均低于野生型。與野生型相比，葉片中的淀粉顆粒邊緣呈波浪形或有裂紋，過表達ESV1則明顯提高了葉片淀粉含量，產(chǎn)生更厚、更大的淀粉顆粒。對支鏈淀粉鏈長分布的影響很小，但ESV1的缺失和過表達均提高了葉片的直鏈淀粉含量。ESV1同時存在于葉片總蛋白的可溶性和不溶性（淀粉結(jié)合）部分，白天淀粉顆粒生長時，ESV1可與之結(jié)合；晚上淀粉降解時，ESV1則被釋放至葉綠體基質(zhì)中[23]。由于ESV1不含有任何已知結(jié)構(gòu)域，推測它可能有利于淀粉的半晶體片層結(jié)構(gòu)形成，從而限制淀粉水解酶接近淀粉，葉片中淀粉結(jié)構(gòu)的有序性降低，導致淀粉易被水解酶降解，因而增加了淀粉降解的速度。已證實ESV1影響特定水解酶在淀粉顆粒表面的作用[24]。
綜上所述，擬南芥的研究主要集中于對葉片淀粉合成和降解的影響。為探究水稻同源基因?qū)ε呷榈矸酆铣傻挠绊?，本研究利用CRISPR-Cas9基因編輯技術，構(gòu)建了突變體材料，考查了其表型及胚乳淀粉的理化特性，初步分析在淀粉合成中的功能及其作用機制，為深入研究對淀粉合成的影響奠定基礎。
1 材料與方法
1.1 材料來源與種植條件
突變體源自粳稻品種W017，采用CRISPR-Cas9系統(tǒng)進行基因敲除獲得。參照汪秉琨等[25]的方法，設計靶位點為AGCACCTGGTACA GGGAGAGTGG，構(gòu)建CRISPR/Cas9載體，并轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)，利用農(nóng)桿菌介導法侵染W(wǎng)017愈傷組織，篩選培養(yǎng)獲得T0轉(zhuǎn)基因植株[26]。經(jīng)潮霉素鑒定為陽性的植株，采用CTAB法提取葉片DNA[27]，并用特異性的引物（表1）擴增獲得PCR產(chǎn)物，測序確定突變位點。突變體經(jīng)加代繁育得到純合種子。2020年正季，將野生型和突變體種植在南京農(nóng)業(yè)大學牌樓基地，冬季種植在海南陵水基地。
1.2 進化樹構(gòu)建和生物信息分析
參照水稻基因組注釋計劃數(shù)據(jù)庫(http://rice. plantbiology.msu.edu/)網(wǎng)站提供的水稻基因 ()序列信息，在NCBI (http://www.ncbi. nlm.nih.gov/)網(wǎng)站下載獲得不同物種的ESV1同源蛋白序列，利用MEGA6.0軟件中鄰位相連法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(Bootstrap=1000)，同時利用ClustalX2和Genedoc軟件進行OsESV1及其同源蛋白的氨基酸序列比對。利用 SignalP 4.1 Server (http://www.cbs.dtu.dk/ services/SignalP-4.1/)網(wǎng)站進行信號肽預測，基于PROSITE數(shù)據(jù)庫 (https://www.expasy.org/)進行OsESV1蛋白結(jié)構(gòu)的分析。
1.3 葉片的碘染和淀粉含量測定
野生型和幼苗在人工氣候箱中（28℃，光照12 h）生長至4周，分別取白天和夜晚結(jié)束時的葉片，用無水乙醇浸泡，沸水浴20 min除去葉綠素后，用Lugol solution (Sigma)染色10 min，再用水浸泡1 h后觀察。生長6周齡的葉片用液氮研磨后80℃下干燥24 h，同上脫色除去葉綠素，采用Megazyme公司的K-TSTA淀粉總量檢測試劑盒測定總淀粉含量[28]。
1.4 農(nóng)藝性狀考查及種子胚乳理化特性分析
選取野生型和(T2代) 成熟植株各10株，考查株高、穗長、分蘗數(shù)、每穗粒數(shù)、一次枝梗數(shù)和千粒重等農(nóng)藝性狀。
成熟種子去除穎殼，磨成精米粉過篩（100目），50℃下烘至恒重。使用Megazyme公司生產(chǎn)的總淀粉檢測試劑盒TSTA進行胚乳總淀粉含量的測定。參照《農(nóng)業(yè)部標準米質(zhì)測定方法：NY147?88》測定胚乳直鏈淀粉含量。精確稱量3 g精米粉，加入25 mL的蒸餾水，使用快速黏度分析儀(Rapid Visco Analyser，瑞典Perten)測定米粉的黏度特性[29]。
1.5 組織表達模式分析
水稻開花期間，下午對野生型的各個組織進行取樣，并取花后3～24 d的穎果，液氮保存，用于的組織表達分析。在夜晚結(jié)束時，選取人工氣候箱中（28℃，光照12 h）生長至4周的野生型幼苗3株，每隔4 h采集一次葉片至24 h，用于的節(jié)律表達分析。
使用天根公司的植物RNA提取試劑盒，提取野生型和突變體不同組織的RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScript RT Reagent Kit, TaKaRa)的使用說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第1鏈。用寶生物染料法熒光定量試劑盒(SYBR premix Ex TaqTM, TaKaRa)，在PCR儀(C1000 TouchTMThermal Cycler, BIO-RAD)上運行程序：95℃下30 s；95℃下5 s、60℃下30 s，39個循環(huán)；95℃下15 s、60℃下1 min，95℃下15 s。反應體系為20 μL：5 μL cDNA模板，10 μmol/L正反向引物各2.5 μL，10 μL 2×SYBR Premix ExII。每個樣品設置3個重復，以水稻作為內(nèi)參, 用2法計算相對表達水平[30]。所用引物見表1。
1.6 亞細胞定位
用野生型幼苗cDNA擴增的全長cDNA序列，并克隆到pAN580載體中，獲得pAN580-OsESV1-GFP載體（35S啟動子），轉(zhuǎn)化水稻原生質(zhì)體并觀察定位[31]。同理構(gòu)建p1305-OsESV1-GFP融合載體（35S啟動子），轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌并侵染4周齡煙草，48 h之后觀察定位[32]。使用Leica公司的SP8型激光共聚焦顯微鏡檢測熒光信號。所用引物見表1。
1.7 酵母雙雜
用野生型幼苗cDNA擴增OsESV1、OsAGPS1、OsAGPS2a、OsAGPS2b、ADP-葡萄糖焦磷酸化酶大亞基(OsAGPL) 1、可溶性淀粉合成酶(SS)Ⅰ、SSⅡa、SSⅡb、淀粉分支酶(BE)Ⅰ及BEⅡb的cDNA序列，分別克隆到pGADT7或pGBKT7載體上，并將不同的載體組合共轉(zhuǎn)到酵母AH109中，在二缺培養(yǎng)基 (SD/-Leu/-Trp)上30℃培養(yǎng)2～3 d后，挑菌在四缺培養(yǎng)基(SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade)上進行篩選。pGADT7和pGBKT7載體購自Clontech公司，按照試劑盒的方法進行酵母感受態(tài)細胞的制備和轉(zhuǎn)化。所用引物見表1。
表1 實驗所用引物
1.8 雙分子熒光互補實驗
將、和全長cDNA序列分別克隆到p2YC和p2YN載體上，參照1.6方法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌后侵染4周齡煙草，48 h后用激光共聚焦顯微鏡觀察熒光信號[32]。所用引物的信息列于表1。
2 結(jié)果與分析
2.1 OsESV1及其同源蛋白的保守性分析。
進化樹分析結(jié)果表明，ESV1蛋白在植物中普遍存在，并且水稻中的OsESV1與擬南芥AtESV1高度同源（圖1-A），氨基酸序列比結(jié)果表明，OsESV1蛋白與擬南芥、玉米和亞洲棉ESV1同源蛋白均包含一段高度保守的富含色氨酸的序列，并且在C端有一段富含脯氨酸的序列，N端的序列相似度不高（圖1-B）。這種保守性說明ESV1在植物中具有比較基礎的功能。
2.2 osesv1的基因突變
水稻基因含11個外顯子和10個內(nèi)含子（圖2-A），編碼含431個氨基酸殘基的蛋白（圖2-B）。生物信息學分析表明，OsESV1沒有信號肽及跨膜結(jié)構(gòu)域。為了研究的功能，采用CRISPR-Cas9系統(tǒng)獲得了兩種基因編輯形式的突變體（圖2-C）。測序結(jié)果表明，突變體中的第3個外顯子有11個堿基的缺失，突變體中的第3個外顯子有1個單堿基的插入（圖2-A）基因的這兩種編輯類型均導致移碼突變和翻譯的提前終止，因此均編碼缺失富含色氨酸區(qū)和富含脯氨酸區(qū)的截短蛋白（圖2-B）。qRT-PCR結(jié)果表明，突變體中的表達在白天和晚上結(jié)束時均顯著低于野生型（圖2-D）。
成熟植株的株高、穗長和每穗粒數(shù)均顯著低于野生型，而分蘗數(shù)顯著高于野生型，千粒重則無明顯差異（表2）。由于淀粉代謝缺陷，突變植株表現(xiàn)嚴重的發(fā)育異常和形態(tài)缺陷[23]，但植株未出現(xiàn)明顯的發(fā)育異常（圖2-C）。
A—OsESV1及其同源蛋白的進化樹分析，蛋白名采用相應的GenBank 序列登錄號；B—多氨基酸序列比對，星號表示20個氨基酸的間隔，淺紅色區(qū)域為富含色氨酸(W)區(qū)，保守色氨酸殘基下用“：”標注，黃色區(qū)域為富含脯氨酸(P)區(qū)。
Fig. 1. The conservation analysis of OsESV1.
2.3 osesv1對葉片中淀粉合成的影響
對野生型和突變體的葉片進行碘染色分析，發(fā)現(xiàn)在白天和夜晚結(jié)束時，突變體葉片的碘染色程度均比野生型淺，說明葉片中的淀粉含量低于野生型（圖3-A）。淀粉含量測定結(jié)果也證實葉片中的淀粉含量顯著低于野生型（圖3-B）。
2.4 osesv1對種子中淀粉合成的影響
對野生型及突變體成熟種子進行比較，發(fā)現(xiàn)突變體種子外觀無明顯變化（圖4-A）。種子的總淀粉含量無明顯變化，但直鏈淀粉含量顯著升高（圖4-B、C），這一點與突變體相似。RVA分析表明，野生型與突變體胚乳淀粉的黏度曲線呈現(xiàn)相似的趨勢（圖4-D）。
2.5 OsESV1基因的表達分析
基于的突變表型，我們首先對的組織表達譜進行了分析。結(jié)果表明，基因在水稻的根、莖、葉、葉鞘、幼穗中都有表達，且在花后12 d的胚乳中表達較高（圖5-A）。同時對晝夜節(jié)律表達的分析表明，在黎明時表達量上升達到最高峰，表達量是其他時間點的40倍以上，而其他時間點的表達量均較低（圖5-B），表明該基因的表達具有晝夜節(jié)律性。
A—OsESV1的基因結(jié)構(gòu)。深灰和淺灰方塊分別表示外顯子區(qū)域和UTR區(qū)域，方塊之間的黑色連線表示內(nèi)含子，下面為野生型和osesv1靶位點基因序列比較，連續(xù)的點表示缺失的序列，插入的堿基加粗標示，紅色標注為原間隔基序(protospacer adjacent motif , PAM) TGG；B—野生型和突變體的OsESV1蛋白結(jié)構(gòu)。箭頭標注富含色氨酸區(qū)（Trp-rich region）和富含脯氨酸區(qū)（Pro-rich region）；C—野生型和osesv1植株，標尺為10 cm；D—野生型和osesv1幼苗在白天和夜晚結(jié)束時OsESV1基因的表達水平。數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差(n=3)。*和**分別表示差異達0.05和0.01顯著水平（t檢驗）。下同。
Fig. 2. Phenotype of themutants.
表2 野生型和osesv1的農(nóng)藝性狀
數(shù)據(jù)表示為均值±標準差（=10）。
Values are means ± SD (=10).
2.6 OsESV1定位于葉綠體
通過UniProt (https://www.uniprot.org/)網(wǎng)站預測，OsESV1蛋白定位于葉綠體。為了確認OsESV1的亞細胞定位，在水稻原生質(zhì)體中瞬時表達OsESV1-GFP。結(jié)果表明，OsESV1-GFP融合蛋白定位于葉綠體內(nèi)，呈點狀分布（圖6-A）。同樣，OsESV1-GFP在煙草表皮細胞中瞬時表達，也是在葉綠體內(nèi)呈點狀分布（圖6-B）。
A—白天和夜晚結(jié)束時野生型(WT)和osesv1葉片的碘染觀察; B—白天和夜晚結(jié)束時野生型(WT)和osesv1葉片的淀粉含量測定。
Fig. 3. Starch contents in leaves of WT and
A—野生型(WT)和osesv1的成熟種子表型，標尺為5 mm；B, C—野生型(WT)和osesv1種子總淀粉含量、直鏈淀粉含量；D—野生型和osesv1胚乳淀粉的黏度曲線。
Fig. 4. Phenotype ofgrains andphysicochemical properties of endosperm starch
2.7 OsESV1與OsAGP互作
在突變體中，白天結(jié)束時葉片中的淀粉含量顯著低于野生型。為探討對淀粉合成途徑存在的可能影響，將OsESV1與一系列淀粉合成酶進行酵母雙雜。結(jié)果表明，OsESV1可以與OsAGPS2a和OsAGPS1在酵母細胞中互作（圖7）。OsAGP是淀粉合成的限速酶，為淀粉合成提供前體物質(zhì)ADP葡萄糖[4, 6]。水稻中OsAGP的小亞基包括OsAGPS1和OsAGPS2兩種亞型，OsAGPS1主要存在于胚乳的造粉體中，OsAGPS2a主要存在于葉片的葉綠體中[33-34]。
2.8 OsESV1與OsAGP互作的驗證
我們利用雙分子熒光互補實驗(BiFC)來進一步驗證OsESV1與OsAGPS2a和OsAGPS1的互作。結(jié)果表明，在煙草表皮細胞中的葉綠體中，OsESV1可以分別與OsAGPS2a和OsAGPS1互作，并且熒光在葉綠體內(nèi)呈點狀分布（圖8）。
A—OsESV1在野生型不同組織及胚乳發(fā)育不同時期的表達水平；B—OsESV1的晝夜節(jié)律表達。黑框和白框分別表示黑夜和白天的時間軸。
Fig. 5. Expression pattern of
A—OsESV1-GFP融合蛋白在水稻原生質(zhì)體中的表達，pAN580-GFP空載體作為對照，標尺為20 μm；B—OsESV1-GFP融合蛋白在煙草表皮細胞中的表達，p1305-GFP空載體作為對照，標尺為20 μm。
Fig. 6. Subcellular localization of OsESV1.
二缺：SD-Leu/-Trp；四缺：SD-Leu/-Trp/-His/-Ade。
Fig. 7. Yeast two-hybrid assays show that OsESV1 can interact with OsAGPS2a and OsAGPS1.
3 討論
本研究采用CRISPR-Cas9基因編輯技術獲得了突變體，并對基因的功能進行了初步的研究。與野生型相比，和葉片中的淀粉含量在白天結(jié)束時分別減少了22%和52%（圖3-B），但成熟種子的淀粉含量并沒有明顯變化（圖4-B），因而與不同(突變對種子中的淀粉合成沒有明顯影響)。類似的報道還有擬南芥)在水稻中的同源基因()[28]。研究發(fā)現(xiàn)，PTST1作為腳手架蛋白，能介導顆粒結(jié)合淀粉合酶（granule bound starch synthase, GBSS）靶定到淀粉顆粒上，后者直接負責直鏈淀粉的合成。在擬南芥突變體葉片中，靶定到淀粉顆粒上的GBSS變少，葉片中幾乎檢測不到直鏈淀粉[35]。水稻突變體葉片中也幾乎不含直鏈淀粉，但是胚乳中直鏈淀粉的含量沒有明顯變化，且多數(shù)GBSS蛋白仍能與胚乳中的淀粉結(jié)合[36]。突變導致葉片與籽粒表型的差異，與本研究報道的相似。
Bars = 10 μm.
Fig. 8. BiFC assays show that OsESV1 can interact with OsAGPS2a and OsAGPS1 in tobacco epidermal cells.
突變導致白天葉片中淀粉含量下降，作者認為葉片淀粉合成的同時發(fā)生降解，所以淀粉含量下降[23]。本研究中的酵母雙雜和BiFC實驗表明，OsESV1可與OsAGPS2a互作（圖7和圖8）。研究表明，OsAGPS2a在水稻葉片的淀粉合成中起到主要作用[33]。因此OsESV1與OsAGPS2a的互作，可能是OsESV1影響葉片淀粉合成的另一種方式。
本實驗結(jié)果表明，OsESV1還與OsAGPS1互作（圖7和圖8）。OsAGPS1與OsAGPL1形成異源四聚體，定位于胚乳造粉體內(nèi)，在胚乳發(fā)育早期的淀粉合成中起作用[34]。而水稻造粉體內(nèi)OsAGP活性只占胚乳OsAGP總活性的10%，主要由細胞質(zhì)中的OsAGP負責提供ADP-葡萄糖合成淀粉[37]，比如突變體籽粒的淀粉合成幾乎未受影響[38]，因此，造粉體中的AGP對于胚乳淀粉合成應該是非必需的。我們推測，由于OsESV1與OsAGPS1在質(zhì)體上互作，而種子造粉體中的OsAGP對種子淀粉合成幾乎沒有影響，所以的突變對種子中的淀粉合成沒有明顯影響。
AtESV1可以結(jié)合淀粉顆粒，OsESV1與其高度同源，且兩者均在葉綠體內(nèi)呈點狀分布（圖6），推測OsESV1可能也具有結(jié)合淀粉顆粒的特性。OsESV1與OsAGPS2a和OsAGPS1互作的熒光在葉綠體內(nèi)也呈現(xiàn)點狀分布，可能是結(jié)合淀粉顆粒的形式（圖8）。我們通過分析發(fā)現(xiàn)OsAGP本身并沒有結(jié)合淀粉的典型結(jié)構(gòu)域或結(jié)合位點，是否OsAGPS2a與OsAGPS1借助OsESV1靶定到淀粉顆粒上，需要進一步的實驗證據(jù)。目前已有報道，一些淀粉綁定蛋白作為腳手架蛋白，介導淀粉代謝酶靶定到淀粉顆粒上，如FLOURY ENDOSPERM 6可能作為腳手架蛋白，與異淀粉酶（Isoamylase 1，ISA1）互作，調(diào)控ISA1與淀粉的結(jié)合[12]；PTST1介導GBSS靶向到淀粉顆粒[35]；LIKE SEX4 1介導β-淀粉酶定位于淀粉顆粒表面[39]。
綜上所述，可能與OsAGP互作，影響水稻的淀粉合成。我們下一步計劃獲得過表達基因的材料，進一步探討在水稻淀粉合成中的作用。
謝 辭：農(nóng)業(yè)部長江中下游粳稻生物學與遺傳育種重點實驗室、長江流域雜交水稻協(xié)同創(chuàng)新中心、現(xiàn)代作物生產(chǎn)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心給予大力支持，謹致謝意。
[1] 侯立剛, 周廣春, 嚴永峰, 全成哲, 馬巍. 吉林省水稻產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀與未來發(fā)展對策[J]. 北方水稻, 2015, 45(2): 73-75.
Hou L G, Zhou G C, Yan Y F, Quan C Z, Ma W. Analysis on the development status and the counter- measures of rice industry in Jilin[J]., 2015, 45(2): 73-75. (in Chinese with English abstract)
[2] 方鵬飛, 李三峰, 焦桂愛, 謝黎虹, 胡培松, 魏祥進, 唐紹清.水稻粉質(zhì)胚乳突變體的理化性質(zhì)及基因定位[J]. 中國水稻科學, 2014, 28(5): 447-457.
Fang P F, Li S F, Jiao G A, Xie L H, Hu P S, Wei X J, Tang S Q. Physicochemical property analysis and gene mapping of a floury endosperm mutantin rice[J].2014, 28(5): 447-457. (in Chinese with English abstract)
[3] 蔡躍. 水稻心白胚乳突變體的基因克隆及功能分析[D]. 南京: 南京農(nóng)業(yè)大學, 2018.
Cai Y. Gene cloning and functional analysis of rice white-core endosperm mutant[D]. Nanjing: Nanjing Agricultural University, 2018. (in Chinese with English abstract)
[4] Tetlow I J, Emes M J. Starch biosynthesis in the developing endosperms of grasses and cereals[J]., 2017, 7(4): 81.
[5] Okita T W, Nakata P A, Anderson J M, Sowokinos J, Morell M, Preiss J. The subunit structure of potato tuber ADPglucose pyrophosphorylase[J]., 1990, 93(2): 785-790.
[6] Geigenberger P. Regulation of starch biosynthesis in response to a fluctuating environment[J]., 2011, 155(4): 1566-1577.
[7] Kaushik R P, Khush G S. Genetic analysis of endosperm mutants in riceL. [J], 1991, 83(2): 146-152.
[8] Wu Y, Pu C, Lin H, Huang H, Huang Y, Hong C, Chang M, Lin Y. Three novel alleles of() confer dull grains with low amylose content in rice[J]., 2015, 233: 44-52.
[9] Nishio T, Iida S. Mutants having a low content of 16-kDa allergenic protein in rice (L)[J]., 1993, 86(2-3): 317-321.
[10] Kang H G, Park S, Matsuoka M, An G. White-core endosperm floury endosperm-4 in rice is generated by knockout mutations in the C-type pyruvate ortho- phosphate dikinase gene ()[J]., 2010, 42(6): 901-911.
[11] Ryoo N, Yu C, Park C S, Baik M Y, Baik M Y, Park I M, Cho M H, Bhoo S H, An G, Hahn T R, Jeon J S. Knockout of a starch synthase genecauses white-core floury endosperm in rice (L.)[J]., 2007, 26(7): 1083-1095.
[12] Peng C, Wang Y, Liu F, Ren Y, Zhou K, Lü J, Zheng M, Zhao S, Zhang L, Wang C, Jiang L, Zhang X, Guo X, Bao Y, Wan J.encodes a CBM 48 domain-containing protein involved in compound granule formation and starch synthesis in rice endosperm[J]., 2014, 77(6): 917-930.
[13] Zhang L, Ren Y, Lu B, Yang C, Feng Z, Liu Z, Chen J, Ma W, Wang Y, Yu X, Wang Y, Zhang W, Wang Y, Liu S, Wu F, Zhang X, Guo X, Bao Y, Jiang L, Wan J.encodes a regulator of starch synthesis and amyloplast development essential for peripheral endosperm development in rice[J]., 2016(3): 633-647.
[14] Long W, Dong B, Wang Y, Pan P, Wang Y, Liu L, Chen X, Liu X, Liu S, Tian Y, Chen L, Wan J., encoding the UDP-glucose pyrophos- phorylase 1, affects the synthesis and structure of starch in rice endosperm[J]., 2017, 60(5): 513-522.
[15] 劉藝, 朱小品, 劉喜, 田云錄, 劉世家, 王云龍, 張文偉, 江玲, 王益華, 萬建民. 水稻胚乳粉質(zhì)突變體 flo9 的表型分析和基因定位[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學學報, 2018, 41(4): 616-624.
Liu Y, Zhu X P, Liu X, Tian Y L, Liu S J, Wang Y L, Zhang W W, Jiang L, Wang Y H, Wan J M.Phenotyping and gene-mapping of a floury endosperm mutantin rice[J]., 2018, 41(4): 616-624. (in Chinese with English abstract)
[16] Wu M, Ren Y, Cai M,Wang Y, Zhu S, Zhu J, Hao Y, Teng X, Zhu X, Jing R, Zhang H, Zhong M, Wang Y, Lei C, Zhang X, Guo X, Cheng Z,Lin Q, Wang J, Jiang L, Bao Y, Wang Y, Wan J. Riceencodes a pentatricopeptide repeat protein that is essential for the trans-splicing of mitochondrial nad1 intron 1 and endosperm development[J]., 2019, 223(2): 736-750.
[17] Zhu X, Teng X, Wang Y, Hao Y, Jing R, Wang Y, Liu Y, Zhu J, Wu M, Zhong M, Chen X, Zhang Y, Zhang W, Wang C, Wang Y, Wan J.encoding a plastid heat shock protein 70 is essential for amyloplast development in rice[J]., 2018, 277: 89-99.
[18] Zhong M, Liu X, Liu F,Ren Y, Wang Y, Zhu J, Teng X, Duan E, Wang F, Zhang H, Wu M, Hao Y, Zhu X, Jing R, Guo X, Jiang L, Wang Y, Wan J.encoding alanine aminotransferase 1 regulates carbon and nitrogen metabolism in rice[J]., 2019, 62(1): 61-73.
[19] Hu T, Tian Y, Zhu J, Wang Y, Jing R, Lei J, Sun Y, Yu Y, Li J, Chen X, Zhu X, Hao Y, Liu L, Wang Y, Wan J.encoding a mitochondrial complex I subunit is essential for embryo development and starch synthesis in rice[J]., 2018, 37(12): 1667-1679.
[20] Xue M, Liu L, Yu Y, Zhu J, Gao H, Wang Y, Wan J. Lose-of-function of a rice nucleolus-localized pentatrico- peptide repeat protein is responsible for the flourymutant phenotypes[J]., 2019, 12(1): 1-15.
[21] You X, Zhang W, Hu J, Jing R, Cai Y, Feng Z, Kong F, Zhang J, Yan H, Chen W, Chen X, Ma J, Tang X, Wang P, Zhu S, Liu L, Jiang L, Wan J.encodes a glyoxalase I involved in compound granule formation and starch synthesis in rice endosperm[J]., 2019, 38(3): 345-359.
[22] Teng X, Zhong M, Zhu X,Wang C, Ren Y, Wang Y, Zhang H, Jiang L, Wang D, Hao Y, Wu M, Zhu J, Zhang X, Guo X, Wang Y, Wan J.encoding a NAD-dependent cytosolic malate dehydrogenase plays an important role in starch synthesis and seed development in rice[J]., 2019, 17(10): 1914-1927.
[23] Feike D, Seung D，Graf A, Bischof S, Ellick T, Coiro M, Soyk S, Eicke S, Mettler-Altmann T, Lu K J, Trick M, Zeeman S C, Smith A M. The starch granule-associated protein EARLY STARVATION1 is required for the control of starch degradation inleaves[J]., 2016, 28(6): 1472-1489.
[24] Malinova I, Mahto H, Brandt F,AL-Rawi S, Qasim H, Brust H, Hejazi M, Fettk J. EARLY STARVATION 1 specifically affects the phosphorylation action of starch- related dikinases[J]., 2018, 95(1): 126-137.
[25] 汪秉琨, 張慧, 洪汝科, 張錦, 楊睿, 羅瓊, 曾千春. CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯水稻基因[J]. 中國水稻科學, 2018, 32(1): 35-42.
Wang B K, Zhang H, Hong R K, Zhang J W, Yang R, Luo Q, Zeng Q C.gene editing via CRISPR/Cas9 system in rice[J].2018, 32(1): 35-42. (in Chinese with English abstract)
[26] 曾千春, 李旭剛, 馬炳田, 陳松彪, 徐鴻林, 孟昆, 魏曉麗, 朱禎. 有效去除農(nóng)桿菌和秈稻轉(zhuǎn)化系統(tǒng)優(yōu)化[J]. 分子植物育種, 2003, 1(5): 783-790.
Zeng Q C, Li X G, Ma B T, Chen S B, Xu H L, Meng K, Wei X L, Zhu Z. Efficient elimination ofand optimization of-mediated transformation of indica rice[J]., 2003, 1(5): 783-790. (in Chinese with English abstract)
[27] 王慧娜, 初志戰(zhàn), 馬興亮, 李日清, 劉耀光. 高通量的 PCR 模板植物基因組 DNA 制備方法[J]. 作物學報, 2013, 39(7): 1200-1205.
Wang H N, Chu Z Z, Ma X L, Li R Q, Liu Y G. A high through-put protocol of plant genomic DNA preparation for PCR[J]., 2013, 39(7): 1200-1205. (in Chinese with English abstract)
[28] Wang W, Wei X, Jiao G, Chen W, Wu Y, Sheng Z, Hu S, Xie L, Wang J, Tang S, Hu P.-, encoding a CBM48 domain-containing protein, affects rice quality and yield[J]., 2020, 62(7): 948-966.
[29] Tong C, Chen Y, Tang F, Xu F, Huang Y, Chen H, Bao J. Genetic diversity of amylose content and RVA pasting parameters in 20 rice accessions grown in Hainan, China[J]., 2014, 161: 239-245.
[30] Livak K J, Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2[-Delta Delta C(T)] method[J]., 2001, 25(4): 402-408.
[31] Chen S, Tao L, Zeng L, Vega-Sanchez M E, Umemura K, Wang G. A highly efficient transient protoplast system for analyzing defence gene expression and protein- protein interactions in rice[J]., 2010, 7(5): 417-427.
[32] Waadt R, Kudla J. In planta visualization of protein interactions using bimolecular fluorescence comple- mentation (BiFC)[J]., 2008(4): pdb, prot4995.
[33] Ohdan T, Francisco P B, Sawada T, Hirose T, Terao T, Satoh H, Nakamura Y. Expression profiling of genes involved in starch synthesis in sink and source organs of rice[J]., 2005, 56(422): 3229-3244.
[34] Lee S K, Hwang S K, Han M, Eom J S, Kang H G, Han Y, Choi S B, Cho M H, Bhoo S H, An G, Hahn T R, Okita T W, Jeon J S. Identification of the ADP-glucose pyrophosphorylase isoforms essential for starch synthesis in the leaf and seed endosperm of rice (L.)[J]., 2007, 65(4): 531-546.
[35] Seung D, Soyk S, Coiro M, Maier B A, Eicke S, Zeeman S C.is required for localizing GRANULE-BOUND STARCH SYNTHASE to starch granules and for normal amylose synthesis in[J]., 2015, 13(2): e1002080.
[36] Abt M R, Zeeman S C. Evolutionary innovations in starch metabolism[J]., 2020, 55: 109-117.
[37] Sakulsingharoj C, Choi S B, Hwang S K, Edwards G E, Bork J, Meyer C R, Preiss J, Okita T W. Engineering starch biosynthesis for increasing rice seed weight: the role of the cytoplasmic ADP-glucose pyropho- sphorylase[J]., 2004, 167(6): 1323-1333.
[38] Cook F R, Fahy B, Trafford K. A rice mutant lacking a large subunit of ADP-glucose pyrophosphorylase has drastically reduced starch content in the culm but normal plant morphology and yield[J]., 2012, 39: 1068-1078.
[39] Comparot-Moss S, K?tting O, Stettler M, Edner C, Graf A, Weise S E, Streb S, Lue W L, MacLean D, Mahlow S, Ritte G, Steup M, Chen J, Zeeman S C, Smith A M. A putative phosphatase, LSF1, is required for normal starch turnover inleaves[J]., 2010, 152(2): 685-697.
Effects ofon Starch Synthesis in Rice
WANG Yongxiang, YAN Hangang, XU Hancong, FU Yushuang, SHAN Zhuangzhuang, HU Xiaoqing, ZHANG Wenwei*, JIANG Ling
(State Key Laboratory for Crop Genetics and Germplasm Enhancement, Jiangsu Plant Gene Engineering Research Center, Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095, China;*Corresponding author, E-mail: zhangww@njau.edu.cn)
【】It is important to reveal the role of() in starch metabolism of rice.【】Themutants were obtained by using the CRISPR-Cas9 system. The phenotype and the physicochemical properties of endosperm starch ofwere investigated. The expression pattern and function ofwere analyzed. 【】The OsESV1 protein was conserved inplants. Compared with the wildtype, themutants exhibited lower plant height, panicle length, and grain number per panicle, but higher tiller number. Though the starch contents inleavessignificantly decreased, the total starch contents ofgrains did not obviously altered and the amylose contents increased. The expression ofwas constitutive and rhythmic. OsESV1 was located in chloroplasts with a dot-like distribution. Yeast two-hybrid and bimolecular fluorescence complementation(BiFC) assays showed thatOsESV1 could interact with ADP glucose pyrophosphorylase small subunit (OsAGPS) 2a and OsAGPS1.【】significantly affects the starch synthesis pathway in rice leaves, while not in endosperm.
rice; starch; endosperm;; interaction
10.16819/j.1001-7216.2022.210308
2021-03-19；
2021-05-12。
國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(2016ZX08001006)；國家重點研發(fā)計劃資助項目（2016YFD0100101-08）。
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