牛胚胎冷凍技術(shù)及冷凍保護(hù)劑研究進(jìn)展

翟亞瑩 張子敬 呂世杰 朱肖亭 張格陽(yáng) 朱進(jìn)華 李崢 于翔 王紅利 施巧婷 閆祥洲 王二耀*

（1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，河南鄭州 450002；2.河南省畜禽繁育與營(yíng)養(yǎng)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州 450002；3.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河南鄭州 450008；4.河南省動(dòng)物檢疫總站，河南鄭州 450000；5.河南省郟縣紅牛產(chǎn)業(yè)發(fā)展中心，河南平頂山 467100）

胚胎冷凍保存是胚胎移植過(guò)程中重要的步驟之一，在地方牛品種遺傳資源保護(hù)方面具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值，最早可以追溯到20 世紀(jì)50 年代初期，Smith用甘油作為冷凍劑冷凍了600 枚兔的胚胎，解凍培養(yǎng)只有6 枚發(fā)育。1972 年，Whittingham[1]首次將小鼠胚胎置于超低溫（-196℃）的液氮中，液氮中的細(xì)胞代謝速率下降，胚胎能長(zhǎng)期穩(wěn)定保存，復(fù)蘇后小鼠胚胎仍能夠存活，開(kāi)啟了胚胎冷凍技術(shù)的先河。胚胎冷凍技術(shù)將胚胎穩(wěn)定地存于液氮中，將體外胚胎進(jìn)行跨時(shí)間、區(qū)域運(yùn)輸，克服了地區(qū)和時(shí)間的限制，使這些胚胎廣泛用于胚胎移植行業(yè)。近年來(lái)，最廣泛應(yīng)用的是快速冷凍法和玻璃化冷凍法，該文將從胚胎冷凍技術(shù)發(fā)展歷程、冷凍保護(hù)劑等方面展開(kāi)綜述。

1 胚胎冷凍技術(shù)

胚胎冷凍技術(shù)就是將動(dòng)物的早期胚胎置于冷凍保護(hù)液中，通過(guò)降溫措施，將胚胎穩(wěn)定存放在液氮中，使胚胎的生命活動(dòng)減弱或暫時(shí)中止，但復(fù)溫后可以迅速恢復(fù)生長(zhǎng)的能力，以達(dá)到長(zhǎng)期體外保存胚胎的目的。胚胎的冷凍液可以用杜氏磷酸鹽緩沖液（DPBS）配制，pH 保持7.2～7.4，也可用TCM-199 或生理鹽水來(lái)配制[2]。冷凍胚胎過(guò)程中溫度降至-15～-50℃時(shí)，大的冰晶易在細(xì)胞內(nèi)形成，冰晶的形成對(duì)于細(xì)胞來(lái)說(shuō)是致命的，很可能導(dǎo)致細(xì)胞的死亡[3]。隨著人們對(duì)胚胎冷凍技術(shù)的探索，人們不斷克服常規(guī)冷凍方法存在的缺點(diǎn)，嘗試通過(guò)改變冷凍方法、添加冷凍保護(hù)劑等方式提高胚胎冷凍的效率。胚胎冷凍的方式主要有三種：慢速冷凍法，快速冷凍法，玻璃化冷凍法，目前玻璃化冷凍法廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐。胚胎冷凍技術(shù)對(duì)于保護(hù)良種牛，發(fā)展優(yōu)秀種質(zhì)資源有著重大意義。

1.1 慢速冷凍法

乙二醇（EG）、甘油（GLY）、二甲基亞砜（DMSO）等常被作為慢速冷凍法的冷凍保護(hù)劑。胚胎被浸泡在濃度由低到高的冷凍保護(hù)劑中，分三步或四步使其完全進(jìn)入胚胎，然后用冷凍裝置緩慢冷卻，降溫速度低于1℃/min，當(dāng)溫度達(dá)到-30～-80℃時(shí)，將胚胎放置于在液氮中[4]。1973 年慢速冷凍法首次用于冷凍牛胚胎，解凍后經(jīng)胚胎移植成功生出小牛[5]。

慢速冷凍法的缺陷體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：第一，胞內(nèi)水過(guò)冷狀態(tài)不穩(wěn)定，會(huì)形成胞內(nèi)冰晶，使胚胎的存活率和著床率較低。第二，慢速冷凍需要控制冷凍速率，以減少冰晶形成對(duì)胚胎造成的傷害，因此，冷凍過(guò)程需要較長(zhǎng)的時(shí)間。第三，慢速冷凍法會(huì)使胚胎過(guò)度脫水，必須采用慢速解凍法，緩慢復(fù)蘇胚胎，提高胚胎成活率。慢速冷凍法對(duì)胚胎傷害較大，冷凍過(guò)程煩瑣，解凍過(guò)程復(fù)雜，這些因素限制了慢速冷凍技術(shù)的廣泛應(yīng)用。

1.2 快速冷凍法

快速冷凍法由慢速冷凍法改進(jìn)而來(lái)，不需要使用梯度冷凍，而是直接將胚胎投入液氮中?？焖倮鋬龇▋?yōu)點(diǎn)是耗時(shí)短，冷凍液作用時(shí)間短，對(duì)胚胎毒性小，缺點(diǎn)是降溫速度快，冰晶形成多[6]。

快速冷凍法經(jīng)常使用兩種或兩種以上物質(zhì)作為冷凍保護(hù)劑。甘油和蔗糖（sucrose）首次作為胚胎冷凍劑冷凍小鼠胚胎，解凍復(fù)蘇后囊胚率達(dá)到61%～65%[7]。Chupin 將2.8mol/L 甘油和0.25mol/L 蔗糖作保護(hù)劑冷凍牛胚胎，將牛胚胎直接投入液氮冷凍，解凍復(fù)蘇后胚胎囊胚率為50%?？蒲腥藛T對(duì)該方法進(jìn)一步改進(jìn)，將牛胚胎置于液氮瓶頸處預(yù)冷5min，再將胚胎投入液氮，解凍后胚胎的囊胚率可達(dá)67.6%。為了進(jìn)一步簡(jiǎn)化胚胎解凍過(guò)程，國(guó)內(nèi)研究人員將1 份保護(hù)劑和3 份稀釋劑直接裝入冷凍胚胎的細(xì)管中。解凍后，輕敲管子，使溶液在管內(nèi)混合，冷凍保護(hù)劑被高度稀釋，可以實(shí)現(xiàn)將胚胎直接移植，簡(jiǎn)化了胚胎解凍的煩瑣過(guò)程[8,9]。

1.3 玻璃化冷凍

玻璃化冷凍是1985 年興起的一種胚胎冷凍方法。該方法通過(guò)添加高濃度的冷凍劑使胚胎快速脫水，在0℃以下投入液氮中對(duì)胚胎進(jìn)行冷凍保存，操作簡(jiǎn)單，不需要昂貴的儀器設(shè)備。玻璃化法高濃度的冷凍劑在低溫下呈現(xiàn)黏稠態(tài)，達(dá)到臨界值時(shí)液體發(fā)生固化，形成了沒(méi)有結(jié)構(gòu)的玻璃態(tài)，從而避免冰晶的形成，減少冰晶對(duì)于細(xì)胞的損害[10]。另外，牛胚胎在慢速冷凍法中具有冷敏感性，該方法可以避免這種冷敏感，使得存活率比慢速冷凍法的存活率更高[11]。玻璃化冷凍的缺點(diǎn)主要體現(xiàn)在高濃度冷凍劑的毒性作用，因此需要嚴(yán)格控制冷凍劑的作用時(shí)間。雖然玻璃化冷凍還存在缺陷，但科研工作者們?cè)诓粩嗵剿鞲倪M(jìn)，相信該方法將有很大提升和廣闊的應(yīng)用前景。

1.3.1 兩步法

最初Kasai 進(jìn)行玻璃化冷凍的探索，以25%甘油和25%丙二醇（PG）為冷凍液，將小鼠8 細(xì)胞進(jìn)行玻璃化冷凍，取得了不錯(cuò)的效果。但此配方應(yīng)用于牛胚胎體外培養(yǎng)時(shí)，牛胚胎到桑椹胚便停止發(fā)育。隨著科技的進(jìn)步，科研人員改進(jìn)了冷凍液配方，兩步法中的冷凍液由40%乙二醇、18%聚蔗糖（ficoll）以及0.26%蔗糖（sucrose）在TCM-199 中組成。冷凍步驟分兩步進(jìn)行：凍存前，胚胎在0.8mL 的20%乙二醇液中存放3min，繼而轉(zhuǎn)移至0..8mL 的玻璃化冷凍液中短暫停留，隨后裝入0.25mL 凍精細(xì)管，在30～45s內(nèi)投入液氮罐中保存[12]。通過(guò)兩步法凍存的牛胚胎可以更好地發(fā)育，凍存液對(duì)于胚胎的各個(gè)發(fā)育時(shí)期均具有保護(hù)作用。丁家桐通過(guò)該方法凍存山羊胚胎，解凍移植后的妊娠率達(dá)到61.5%，產(chǎn)羔率達(dá)到40%[13]。朱世恩通過(guò)兩步法凍存兔囊胚胚胎，解凍后發(fā)育率達(dá)到90%，妊娠率達(dá)到29.2%[14]。

1.3.2 開(kāi)放式細(xì)管法（OPS 法）

OPS 冷凍法是使用OPS 薄壁吸管，加熱后將其拉至管的一半直徑和厚度，利用毛細(xì)管現(xiàn)象將極少量的冷凍液與胚胎一起吸至OPS 管的末端，最后將OPS管直接放入液氮中進(jìn)行冷凍保存[14]。OPS 法操作便捷，不要冷凍儀器，極少的冷凍液可達(dá)到迅速冷凍、快速解凍以及快速去除保護(hù)劑的目的。由于管中冷凍液量很少，還減少了對(duì)胚胎的毒害作用。此方法近年來(lái)已經(jīng)廣泛用于牛胚胎的冷凍保存。

1.3.3 Cryotop 冷凍法

Cryotop 法與OPS 法有類似之處，將含有胚胎的玻璃化液滴（約0.1μL）放置在細(xì)聚丙烯條內(nèi)，然后立即垂直放入液氮中完成冷凍，冷凍后用塑料帽蓋住Cryotop 板，存放在液氮中[15]。該方法使用的冷凍液體積更小，冷凍和解凍速率更高。用Cryotop 法冷凍保存牛胚胎可以使囊胚孵化率達(dá)到90%，Cryotop 法簡(jiǎn)單便捷，是一種實(shí)用的玻璃化冷凍技術(shù)[16]。

2 冷凍保護(hù)劑

冷凍保護(hù)劑是為了減少或防止細(xì)胞在冷凍過(guò)程中受到損傷的試劑，目前常分為細(xì)胞內(nèi)液冷凍保護(hù)劑、細(xì)胞外液冷凍保護(hù)劑和抗凍蛋白等。在慢速冷凍法中，只有一種物質(zhì)被用作冷凍保護(hù)劑，如甘油、乙二醇、DMSO，而在快速冷凍法和玻璃化冷凍法中，通常是幾種冷凍保護(hù)劑同時(shí)使用。

2.1 細(xì)胞內(nèi)液冷凍保護(hù)劑

細(xì)胞內(nèi)液冷凍保護(hù)劑通常是分子量小且具有穿透細(xì)胞膜能力的物質(zhì)，如乙二醇，甲醇（MT），丙二醇、甘油、二甲基亞砜等。Rall 和Fahy 用20.5%DMSO、15.5%乙酰胺、10%丙二醇、6%聚乙二醇作為玻璃化冷凍液，冷凍小鼠胚胎，獲得了87.7%的冷凍成活率[17]。許文兵的研究指出，以EG 為冷凍保護(hù)劑，固體表面載桿為冷凍載體，冷凍轉(zhuǎn)基因牛的早期囊胚可以獲得最佳效果[18]。

2.2 細(xì)胞外液冷凍保護(hù)劑

細(xì)胞外液冷凍保護(hù)劑常為大分子、非滲透性細(xì)胞膜物質(zhì)，例如蔗糖、海藻糖（trehalose）、半乳糖（galactose）、聚蔗糖、海藻糖（trehalose）等。蔗糖因其在低溫下對(duì)細(xì)胞沒(méi)有毒害作用，而被作為玻璃化冷凍保護(hù)液的主要成分廣泛應(yīng)用[19]。2004 年，Gong 等采用OPS 法玻璃化，以40%乙二醇+30%聚蔗糖+0.5mol/L 蔗糖為冷凍保護(hù)劑，冷凍牛的SCNT 囊胚，第60d 妊娠率和產(chǎn)犢率均為33.3%[20]。Zhao 等用15%乙二醇+15%DMSO+0.3mol/L 蔗糖為冷凍保護(hù)劑，使用OPS 冷凍法玻璃化冷凍牛ICSI 胚胎，解凍后存活率為82.4%[21]。近年來(lái)的研究表明，乙二醇、蔗糖、聚蔗糖作為冷凍保護(hù)劑配置成的EFS40 是比較理想的冷凍保護(hù)液。

2.3 抗凍蛋白

抗凍蛋白（AFPs）是一類能附著在冰晶表面，與冰晶結(jié)合后可以遏制其生長(zhǎng)的蛋白質(zhì)，由Devriesde等在海冰地區(qū)魚(yú)類血液中鑒定出來(lái)[22]。后來(lái)科研人員不但在多種魚(yú)類中鑒定出該物質(zhì)，在植物和昆蟲(chóng)體內(nèi)也有發(fā)現(xiàn)。AFPs 具有穩(wěn)定細(xì)胞膜的作用，與冰晶結(jié)合后可以阻止冰晶生長(zhǎng)，在冷凍液中再結(jié)晶，減少細(xì)胞損傷。該物質(zhì)應(yīng)用于牛胚胎冷凍可以減少冰晶對(duì)胚胎的傷害，對(duì)保持胚胎完整性具有重要意義。

3 展望

胚胎冷凍技術(shù)對(duì)我國(guó)保護(hù)地方肉牛種質(zhì)資源發(fā)揮著重要作用。隨著該技術(shù)的不斷成熟，牛胚胎冷凍效率會(huì)進(jìn)一步提高，特別是玻璃化冷凍法，其操作方便，對(duì)胚胎損傷較小，一定會(huì)有巨大的應(yīng)用前景。