干旱脅迫下花生苗期耐旱生理應(yīng)答特性分析

任婧瑤，王婧，艾鑫，趙姝麗，李仍媛，蔣春姬，趙新華，殷冬梅，于海秋*

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)，遼寧 沈陽，110161；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，河南 鄭州，450046）

花生（Arachis hypogaeaL.）是重要的經(jīng)濟作物和油料作物[1]，近年來在我國逐漸形成以花生和油菜為主的油料作物種植結(jié)構(gòu)[2]，花生在發(fā)展農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和增加農(nóng)業(yè)供給中的地位日益凸顯。近5 年來，我國花生年種植面積均在4365 khm2以上[3]，2018 年花生總產(chǎn)量和花生油產(chǎn)量分別為1733 萬噸和294萬噸，創(chuàng)歷史新高[4]。繼北方產(chǎn)區(qū)、華南產(chǎn)區(qū)和長江流域產(chǎn)區(qū)三大花生產(chǎn)區(qū)之后，東北地區(qū)已成為我國第四大花生產(chǎn)區(qū)[4]，種植面積和產(chǎn)量均有較大程度發(fā)展，而黃曲霉毒素污染風(fēng)險顯著低于其他產(chǎn)區(qū)，成為公認(rèn)的優(yōu)質(zhì)花生生產(chǎn)基地[5]。然而，東北地區(qū)春季干旱少雨[6,7]，且地表裸露加速水分流失，因而干旱對花生的產(chǎn)量和品質(zhì)均可造成嚴(yán)重影響。

通常情況下，植株生長代謝過程中會產(chǎn)生活性氧（ROS），如羥基自由基、過氧化氫、單線態(tài)氧和超氧陰離子自由基[8]。維持在正常濃度的ROS 可作為第二信使，調(diào)控植株體內(nèi)的多種應(yīng)答，如種子萌發(fā)、氣孔開閉、細(xì)胞程序性死亡等[9,10]，但當(dāng)植株遭受脅迫時，活性氧的產(chǎn)生與清除平衡被打破，過量積累的活性氧可破壞核酸、氧化蛋白質(zhì)并引起脂質(zhì)過氧化[11]。與此同時，植物中還可產(chǎn)生其他復(fù)雜的生理應(yīng)答，以減輕干旱脅迫造成的傷害[12]。Arash[13]研究指出，干旱脅迫對植株的主要傷害是破壞細(xì)胞的膜系統(tǒng)，而植株內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、抗壞血酸超氧化物酶（APX）、過氧化物酶（POD）等保護(hù)酶和抗壞血酸、谷胱甘肽、甘氨酸、甜菜堿、脯氨酸等非酶類抗氧化劑能有效清除過量的活性氧從而維持膜的穩(wěn)定，共同保證植株正常的生長與代謝活動[14,15]。

在前人的研究中，先后有學(xué)者調(diào)查了多種作物，如小麥[16,17]、大豆[18]、苜蓿[19]和老芒麥[20]等在應(yīng)對干旱脅迫時的生理響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)不同的作物對干旱脅迫的響應(yīng)存在差異，不同品種間的調(diào)節(jié)機制也不盡相同。已有研究表明，干旱脅迫顯著降低花生的主莖高與分枝數(shù)，并影響花生生物量積累。此外，干旱脅迫會增加花生的根冠比、比葉面積，甚至影響光合色素的含量[21]。在經(jīng)受中度干旱脅迫后，花生的經(jīng)濟產(chǎn)量和收獲指數(shù)均顯著降低[22]。因此，為調(diào)查花生應(yīng)對干旱脅迫的生理應(yīng)答特性，本研究以4份耐旱性差異的花生品種為試材，測定分析其干旱脅迫下的ROS 積累與清除系統(tǒng)的變化特征，以期為花生的抗旱育種和耐旱栽培提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試驗設(shè)計

耐旱花生品種農(nóng)花5 號（NH5）和花育22（HY22）、干旱敏感品種阜花18（FH18）和農(nóng)花16（NH16）均為前期篩選所得耐旱性差異品種[23]。將4個花生品種種子以0.5%的次氯酸鈉溶液浸泡20 min 進(jìn)行表面消毒，隨后用蒸餾水洗凈并在室溫下（25～28℃）浸泡8 h，將浸泡后的種子置于培養(yǎng)皿中，在25℃培養(yǎng)箱中催芽24 h，期間用紗布覆蓋并始終保持種子濕潤，隨后挑選發(fā)芽均勻一致的種子（芽長約為種子長度的二分之一）種植于裝有潔凈沙土的塑料方盆中，方盆規(guī)格為50 cm×35 cm×20 cm，底部留孔，每盆播種30株。在光溫培養(yǎng)室中進(jìn)行培養(yǎng)，并隔天補充1/2 的Hoagland 培養(yǎng)液保證水分充足，培養(yǎng)室的光/暗周期為16 h/8 h，溫度為28℃/25℃，相對濕度60%，光照強度為500 μmol·m-2·s-1。當(dāng)幼苗生長至4 葉期后，在盆中注入適量蒸餾水以使沙土松動，隨后立即取花生植株并用尖嘴瓶沖洗根部，后置于吸水紙上蘸干表面水分。將處理好的植株根部浸沒于20%的PEG6000 溶液模擬干旱脅迫處理，分別于干旱脅迫0 h（CK）、2 h、6 h、12 h、24 h 后取花生倒三葉置于-80℃冰箱中保存用于生理指標(biāo)測定，取根部鮮樣用于根系形態(tài)觀測和根系活力測定。

1.2 生理指標(biāo)測定

CAT 活性利用紫外吸收法[24]、POD 活性和SOD活性參照Xing[25]的方法，分別利用氮藍(lán)四唑光化還原法和愈創(chuàng)木酚氧化比色法測定，APX 測定參照Anwar[26]的方法，游離脯氨酸含量測定參照J(rèn)ahantigh[27]的方法，可溶性蛋白含量利用考馬斯亮藍(lán)G250進(jìn)行測定，根系活力的測定參照鄭炳松TTC 還原量衡量[28]。葉片中H2O2含量及超氧陰離子清除能力分別使用南京建成生物工程研究所的過氧化氫測定試劑盒和抑制與產(chǎn)生超氧陰離子自由基測定試劑盒。各試驗均進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

作圖使用軟件Excel（2010），用SPSS18.0 進(jìn)行單因素方差分析、變異系數(shù)分析和相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫下花生葉片中活性氧的積累與清除

如圖1A 所示，在對照處理中，4 個花生品種葉片中H2O2含量在0.13～0.17 mmol/g 之間，其中NH16中顯著低于其余3個品種，但隨著干旱脅迫時間的延長，耐旱品種中，NH5 在脅迫至2 h 時H2O2含量有較小幅度的上升，為0.20 mmol/g，隨后緩慢下降至接近對照處理，而HY22 中H2O2的含量相對穩(wěn)定，在脅迫過程中維持在0.15～0.18 mmol/g 之間。在2個干旱敏感品種中，H2O2含量在干旱脅迫至12h處均迅速上升，其中NH16 中顯著高于其余品種，達(dá)到0.32 mmol/g，為CK 的2.4 倍，F(xiàn)H18 次之，含量為0.22 mmol/g。

隨后，測定了4 個品種葉片中超氧陰離子清除能力的變化（圖1B）。在對照處理中，耐旱品種NH5和干旱敏感品種NH16 的超氧陰離子清除能力較高，而耐旱品種HY22 和干旱敏感品種FH18 的超氧陰離子清除能力較低，但隨著脅迫時間的延長，耐旱品種中的抗氧化活力呈逐漸上升后緩慢下降的趨勢，并始終處于相對較高的水平（2.3～3.9 U/g）；而干旱敏感品種中，NH16 的超氧陰離子清除能力初始值較高，但在受到干旱脅迫后迅速下降，在脅迫6 h～8 h 后顯著低于耐旱品種；FH18 在整個干旱脅迫過程中的超氧陰離子清除能力始終較低（2.0～2.8 U/g），并呈現(xiàn)持續(xù)下降的趨勢。

圖1 不同花生品種ROS積累與清除能力的差異Fig.1 Difference of ROS accumulation and scavenging ability of peanut varieties

2.2 干旱脅迫對花生根系的影響

如圖2A所示，在未受干旱脅迫之前的花生根系舒展，須根較多，水分狀態(tài)良好，以20%的PEG6000溶液處理24 h 后，HY22 的根系有輕微萎蔫，NH5 的根系輕微變黃脫水。與耐旱品種相比，干旱敏感的品種NH16 和FH18 根系變黃、脫水萎縮嚴(yán)重，根尖處有局部干枯壞死現(xiàn)象。

同時，花生的根系活力受到了干旱脅迫影響，如圖2B 所示，在干旱處理2 h～6 h 之內(nèi)，NH5 和HY22 的根系活力較高，隨后HY22 較為穩(wěn)定，始終在140～170 mg/（g·h）之間，而NH5 緩慢下降，在干旱脅迫24 h 后下降至103 mg/（g·h），但二者的根系活力始終顯著高于干旱敏感品種。FH18在CK中根系活力較高，在受到干旱脅迫后迅速下降，NH16 的根系活力在CK 中較低，在脅迫至12 h 后有小幅度的上升，但隨后下降并顯著低于耐旱品種。

圖2 干旱脅迫下花生根系特性的變化Fig.2 Changes of root characteristics of peanut under drought stress

2.3 花生葉片中酶類抗氧化系統(tǒng)對干旱脅迫的響應(yīng)

在受到干旱脅迫后，不同花生品種葉片中的SOD 活性存在較大差異（圖3A），其中HY22 的SOD活性較穩(wěn)定，且始終顯著高于其余品種，其次為NH5，在干旱脅迫12 h內(nèi)活性較穩(wěn)定，在24 h處理中有所升高。NH16 和FH18 的SOD 活性始終較低，NH16 在脅迫至24 h 后有較大的幅度上升，但仍顯著低于耐旱品種，而FH18 中SOD 活性較低且變化不顯著。

NH5、HY22 和NH16 的POD 活性在對照處理中較低，隨著干旱脅迫時間延長而逐漸上升，其中NH5 活性最高，維持在3473～5156 U/g 之間，HY22的活性上升幅度最大（2448～4560 U/g），NH16 的活性最低，在1248～2801 U/g 之間。FH18 的POD 活性在對照處理下顯著高于其余品種，但在處理至12 h時快速下降，在24 h后顯著低于耐旱品種（圖3B）。

如圖3C 所示，NH5、FH18、HY22 的CAT 活性均顯著高于NH16，其中6～24 h NH5的CAT 活性最高，在845～958 U·g-1·min-1之間，顯著高于其余品種，而FH18 與HY22 的CAT 活性差異不顯著。NH16 活性始終低于其余3 個品種，但其CAT 活性持續(xù)上升且幅度最大，在處理24 h后為CK的5.0倍。

圖3 干旱脅迫下不同花生葉片保護(hù)酶活性的變化Fig.3 Changes of protective enzyme activity in peanut leaves under drought stress

HY22 與NH5 中APX 活性在干旱處理6 h 時差異不顯著，并整體上在0～24 h 處理過程中變化范圍較小。兩個干旱敏感品種中，F(xiàn)H18 的APX 活性變化較小，而NH16 中APX 活性隨干旱脅迫時間的延長逐漸上升，但FH18和NH16的APX 活性始終顯著低于耐旱品種。

2.4 花生葉片中滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的變化

滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)在干旱脅迫過程中具有重要作用，本研究測定了干旱脅迫下4 個花生品種葉片中可溶性蛋白含量的變化，如圖4A所示，HY22中可溶性蛋白含量持續(xù)上升且始終顯著高于其余品種，在24 h 處理時含量最高，為66 mg/g，其次是FH18，可溶性蛋白含量為對照處理的2.0倍。

在受干旱脅迫后，各花生品種中的脯氨酸含量均有上升趨勢（圖4B），其中NH5 的脯氨酸含量最高，在24 h 處達(dá)到峰值，為456 μg/g，F(xiàn)H18 在干旱脅迫過程中呈先下降后上升的趨勢，同樣在24 h 處含量最高，為444 μg/g，與NH5 差異不顯著。HY22 在CK中的游離脯氨酸含量較低，但在24 h干旱處理內(nèi)持續(xù)上升，24 h 后含量為CK 的4.2 倍。而在NH16中，脯氨酸含量在12 h 處達(dá)到最高值242 μg/g，隨后下降至143 μg/g。

圖4 干旱脅迫下花生葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的變化Fig.4 Changes of osmotic regulation substance content in peanut leaves under drought stress

2.5 花生中各生理指標(biāo)的變異系數(shù)

為了明確不同花生品種遭遇干旱脅迫后調(diào)控機制的差異，對各個生理指標(biāo)的變異系數(shù)進(jìn)行了分析。如表1 所示，花生耐旱品種NH5 和HY22 的各個生理指標(biāo)中均以脯氨酸含量變異系數(shù)最高，分別為31.74%和72.04%，兩個干旱敏感品種FH18 和NH16 中，變異系數(shù)最高分別為脯氨酸含量（37.89%）和CAT活性（53.36%）。并且，在NH16中SOD 活性、POD 活性和CAT 活性、APX 活性變異系數(shù)均遠(yuǎn)高于耐旱品種，但其平均值較低，表明NH16葉片中保護(hù)酶類的活性調(diào)節(jié)能力較強，但自身活性較低。此外，NH16 和FH18 中H2O2含量的變異系數(shù)遠(yuǎn)大于耐旱品種且平均值更高，表明干旱敏感品種葉片中的H2O2含量升高更多，細(xì)胞受到活性氧毒害更為嚴(yán)重。

表1 不同花生品種各生理指標(biāo)的變異系數(shù)Table 1 Coefficient of variation of physiological indexes in different peanut varieties

2.6 花生葉片中各生理指標(biāo)相關(guān)性分析

本研究針對干旱脅迫下花生中的H2O2含量、超氧陰離子清除能力與各種酶類、非酶類抗氧化劑及根系活力等各指標(biāo)之間進(jìn)行了相關(guān)性分析。根據(jù)皮爾森相關(guān)系數(shù)顯示（圖5），花生葉片中H2O2含量與其余所有指標(biāo)均無正相關(guān)性，其中與SOD 活性的負(fù)相關(guān)性最大，相關(guān)系數(shù)為-0.24，但在0.01水平和0.05 水平未呈顯著相關(guān)。而超氧陰離子清除能力與其他指標(biāo)間的相關(guān)性分析顯示，與之相關(guān)性最大的為APX 活性，相關(guān)系數(shù)為0.6，在0.01 水平上顯著相關(guān)。此外，SOD 活性與APX 活性、可溶性蛋白、根系活力，POD 活性與CAT 活性、可溶性蛋白，CAT活性與APX 活性、可溶性蛋白、脯氨酸，APX 活性與根系活力之間在0.01水平上均呈極顯著的正相關(guān)，表明各指標(biāo)間存在信息重疊。

圖5 花生葉片中各生理指標(biāo)間相關(guān)系數(shù)矩陣Fig.5 Correlation matrix of physiological indexes in peanut leaves

3 討論

長期以來，干旱是制約農(nóng)作物生長的主要因素之一，因此對作物響應(yīng)干旱脅迫的研究受到廣泛關(guān)注[29,30]?；ㄉ鳛橐环N耐旱、耐瘠薄的重要作物，具有明顯的比較效益，種植面積逐年上升，但由于花生多種植于干旱、半干旱地區(qū)，季節(jié)性缺水常會造成產(chǎn)量和品質(zhì)下降[31]。在眾多解決方案中，提高花生品種的耐旱性是最為經(jīng)濟有效的方式之一，因此明確花生品種對干旱脅迫的生理應(yīng)答特性，對于促進(jìn)花生生產(chǎn)具有重要意義。

在遭遇干旱脅迫時，植株體內(nèi)ROS 系統(tǒng)的平衡首先被打破，ROS 積累會對大分子造成氧化損傷，改變膜的流動性，影響離子轉(zhuǎn)運，并造成蛋白質(zhì)和DNA 損傷等[32,33]。本研究測定了花生植株活性氧清除的能力，試驗結(jié)果顯示，在受到干旱脅迫之后，4個花生品種的H2O2含量均有所升高，但耐旱品種中上升幅度較小并且恢復(fù)較快，而干旱敏感品種中的含量變化較大，同樣花生中超氧陰離子清除能力測定顯示，耐旱品種具有較強的抗氧化能力，甚至在干旱脅迫下有所增強，而敏感品種的抗氧化活力本身較低，并且在遭遇干旱時逐漸下降，顯示出品種間應(yīng)答機制存在的巨大差異。此外，通過皮爾森相關(guān)系數(shù)分析顯示，超氧陰離子清除能力與APX 活性的相關(guān)性最大。APX 是一種重要的抗氧化酶，研究表明APX 基因沉默的水稻植株H2O2積累過度并且膜脂受損嚴(yán)重[34]。在本研究中，NH5 中APX 活性最高，其次是HY22，在所有測定節(jié)點均顯著高于干旱敏感品種，因此推測APX 在提高花生耐旱能力上具有重要作用，是調(diào)節(jié)花生體內(nèi)活性氧平衡的重要保護(hù)酶。而APX 作為一種清除H2O2的抗氧化酶，在本研究中與H2O2含量的負(fù)相關(guān)性不顯著，相關(guān)系數(shù)僅-0.11，并且其他測定指標(biāo)與H2O2間均無顯著相關(guān)性。Kar[14]的研究認(rèn)為植株體內(nèi)的CAT 和POD 等多種酶均參與到H2O2的清除過程，協(xié)同合作共同維持H2O2穩(wěn)定，解釋了本研究中無單一生理指標(biāo)與H2O2顯著相關(guān)的原因。

通過變異系數(shù)分析，發(fā)現(xiàn)在NH5、HY22和FH18中，變異系數(shù)最大的生理指標(biāo)均為游離脯氨酸含量（表1）。游離脯氨酸是一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，不僅能降低細(xì)胞水勢，維持細(xì)胞膨壓，還能有效清除活性氧[35]。在牽?；ǖ脑囼炛斜砻鞲珊得{迫誘導(dǎo)牽?；ㄖ蟹e累大量的脯氨酸，并且脯氨酸積累更多的轉(zhuǎn)基因植株存活率顯著高于野生型[36]。干旱脅迫下，游離脯氨酸、可溶性糖等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)包圍在蛋白質(zhì)周圍，使其免受細(xì)胞中不穩(wěn)定分子的干擾，從而維持蛋白質(zhì)的穩(wěn)定[37]。在花生中，耐旱與干旱敏感品種中脯氨酸含量均顯著上升，是對照處理的1.3～4.2 倍，但耐旱品種中脯氨酸含量上調(diào)更高，表明脯氨酸在花生耐旱進(jìn)程中起到重要作用，因此耐旱品種在干旱脅迫下更能維持蛋白質(zhì)穩(wěn)定，保證各生物進(jìn)程正常進(jìn)行?？扇苄缘鞍鬃鳛闈B透調(diào)節(jié)物質(zhì)之一，在干旱脅迫過程中同樣有所上升，而不同的是，在敏感品種FH18 中可溶性蛋白含量高于耐旱品種NH5，意味著干旱敏感品種的個別性狀甚至優(yōu)于耐旱品種。在關(guān)于木薯干旱脅迫下的生理響應(yīng)的研究中，發(fā)現(xiàn)其脯氨酸含量和可溶性蛋白含量均顯著上升[38]，表明植物在遭受干旱脅迫時脯氨酸和可溶性蛋白含量上升已在多物種中得到證實。此外，研究發(fā)現(xiàn)干旱敏感品種NH16 的CAT 活性、SOD 活性、APX 活性和POD 活性等變異系數(shù)均遠(yuǎn)高于耐旱品種，但平均值很低，而耐旱品種中酶活性很高，但受干旱脅迫的影響相對較小。表明敏感品種在干旱脅迫下保護(hù)酶的調(diào)控能力較強，但整體活性較低，而耐旱品種則相反。保護(hù)酶在品種間存在響應(yīng)趨勢和活性大小上的差異。

4 結(jié)論

干旱脅迫對花生體內(nèi)的生理應(yīng)答具有明顯影響，并且品種間存在較大差異。耐旱性花生品種的根系活力和形態(tài)特征優(yōu)于敏感品種。保護(hù)酶活性在耐旱花生品種中始終保持較高水平且相對穩(wěn)定，受干旱脅迫影響較小，而在干旱敏感品種中易受到干旱脅迫影響。游離脯氨酸作為重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)積極響應(yīng)干旱脅迫，在不同花生品種中均有明顯積累，但品種間存在較大差異。本研究較為系統(tǒng)地探究了不同花生品種在干旱脅迫下的生理應(yīng)答機制，為花生耐旱性的理論研究提供重要參考，并有利于花生耐旱性品種選育進(jìn)程的推進(jìn)。