帕金森病患者血清miR-132、miR-150表達水平與認知功能及炎性因子的關(guān)系研究

關(guān)小明 陳鍇 梁艷桂

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是中老年人群中的常見病，主要病理改變?yōu)槎喟桶纺苌窠?jīng)元缺失或性質(zhì)改變，臨床癥狀為震顫、肌張力亢進、動作不協(xié)調(diào)等，此外，部分患者還會出現(xiàn)非運動癥狀，如情緒障礙、認知障礙等，對其生活質(zhì)量影響非常大[1]。研究表明，PD發(fā)病機制比較復(fù)雜，主要與細胞凋亡、免疫紊亂、炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激、衰老等因素有關(guān)[2]，因PD病因復(fù)雜，不同患者在病情進展早期，可能存在不同表現(xiàn)，且同例患者在病情不同進展階段也會有不同特點，導(dǎo)致PD判定難度增加，臨床診斷困難?；诖耍瑢で笥行?、客觀的PD診斷指標已成為臨床研究的重點課題。近年來，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，微小核糖核酸(miRNA，miR)與神經(jīng)退行性疾病發(fā)展存在關(guān)聯(lián)，其在不同腦區(qū)中均可檢測到，對應(yīng)激反應(yīng)具有調(diào)節(jié)作用[3]。有研究認為，miR-132在神經(jīng)中樞組織及周圍組織均存在表達[4]，miR-150則在神經(jīng)退行性病變患者的血清中表達異常，但具體機制尚未明確[5]。本研究則納入80例PD患者，分析其血清miR-132、miR-150變化及與認知功能、炎癥的相關(guān)性，為PD治療提供新思路，報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取我院2018年8月至2020年8月收治的PD患者80例作為PD組，選取同期于我院體檢的健康體檢者63例作為對照組。2組性別比、年齡、飲酒史、文化程比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，研究方案獲倫理委員會批準。

1.2 診斷標準 PD診斷：參考《中國帕金森病的診斷標準(2016版)》[6]診斷：至少滿足下述3個癥狀：(1)運動緩慢，動作重復(fù)時的幅度、速度下降；(2)下列癥狀中至少滿足1個：姿勢平衡障礙、震顫(靜止狀態(tài)下)、肌強直；(3)癥狀不具有對稱性，起病側(cè)更嚴重；(4)病情有進展性特征；(5)入院后經(jīng)左旋多巴干預(yù)后癥狀好轉(zhuǎn)。見表1。

表1 2組基線資料比較

1.3 納入與排除標準

1.3.1 納入標準:PD組：①滿足上述關(guān)于PD的診斷標準；②入院前3個月內(nèi)未使用抗PD藥物；③病例資料完整；④患者或家屬自愿簽署知情同意書。對照組：①性別、年齡、受教育程度等基線資料與PD組匹配；②神經(jīng)系統(tǒng)功能正常；③精神狀態(tài)正常；④知情同意。

1.3.2 排除標準:①先天性神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常者；②繼發(fā)性PD者；③患中毒性、感染性腦病者；④近期有外傷史、手術(shù)史者；⑤近期有非甾體類抗炎藥應(yīng)用史者；⑥肝、腎、心等臟器嚴重受損者；⑦既往有精神病史者；⑧患其他對顱腦功能有影響的疾病者，如反復(fù)腦損傷史、腦炎病史、反復(fù)卒中病史、顱內(nèi)腫瘤等。

1.4 方法

1.4.1 血清指標檢測:采集所有受試者的空腹靜脈血4 ml，其中對照組于體檢當日采血，PD組于就診當日采血，行離心處理，時間為10 min，轉(zhuǎn)速為3 000 r/min，離心半徑為8 cm，分離血清，存放低溫冰箱待測。①炎性因子檢測：利用速率散射比濁法檢測血清C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)，試劑盒源于石家莊禾柏生物技術(shù)股份有限公司，線性范圍8～160 mg/L，按照說明書完成操作。經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附法測定血清白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)水平，試劑盒由上海篤瑪生物科技有限公司提供。②經(jīng)實時熒光定量PCR法測定血清miR-132、miR-150水平。參照說明書提取miRNA，經(jīng)紫外分光光度計(ZG-EU-2600R，上海卓光儀器)對RNA純度、濃度予以檢測。以10 μl反應(yīng)體系將RNA通過逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并經(jīng)PCR試劑盒(源于上海一研生物科技有限公司)行擴增。miR-132：上、下游引物序列分別為5’-CCCTGTGGGTTGGGGTGGGCGCAG-3’、5’-CATCGAATGTTGCGTCGCCG-3’，miR-150：上、下游引物序列分別為5’-GCCGAGTCTCCCAACCCTT-3’、5’-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3’，內(nèi)參為U6，上、下游引物序列分別為5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’、5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。反應(yīng)條件：95℃ 15 min；94℃ 20 s，59℃ 30 s，72℃ 34 s，共40個循環(huán)。經(jīng)2-△△CT表示血清miR-132、miR-150相對表達量。

1.4.2 量表評估標準:利用蒙特利爾認知評估量表(Montreal cognitive assessment，MoCA)、簡易智力狀態(tài)量表(Mini-Mental State Examination，MMSE)評價2組受檢者的認知功能，經(jīng)統(tǒng)一PD評定量表(Unified parkinson’s disease rating scale，UPDRS)評估PD患者病情。①MoCA[7]：內(nèi)容包括命名、注意力、記憶力、視空間與執(zhí)行能力、抽象思維、定向思維、計算力、語言能力，分別計3分、3分、5分、5分、2分、6分、3分、3分，共計30分，總分≥26分，提示認知正常，否則提示有認知障礙。②MMSE[8]：內(nèi)容包括回憶能力、記憶力、計算力與注意力、定向力、語言，分別計3分、3分、5分、10分、9分，共計30分，總分≥27分表明認知正常，否則提示認知障礙。(3)UPDRS[9]：內(nèi)容包括日?；顒?、治療的并發(fā)癥、情感障礙、運動體征4項，共計199分，0～50分、51～100分、101～199分分別代表輕度、中度、重度，分值越高，病情越重。

2 結(jié)果

2.1 2組血清miR-132、miR-150和炎性因子比較 PD組血清miR-132相對表達量、IL-1β、IL-6、CRP、TNF-α水平高于對照組，而血清miR-150相對表達量顯著低于對照組(P<0.05)。見表2。

表2 2組血清miR-132、miR-150和炎性因子比較

2.2 2組MoCA評分比較 PD組注意力、記憶力、視空間與執(zhí)行能力、抽象思維、定向思維、計算力、語言能力評分及總分均低于對照組(P<0.05)，而2組命名評分比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 2組MoCA評分比較 分,

2.3 2組MMSE評分比較 PD組回憶能力、記憶力、計算力與注意力、定向力、語言評分及總分均低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 2組MMSE評分比較 分,

2.4 不同病情PD患者的血清miR-132、miR-150表達及UPDRS評分比較 在本次納入的80例PD患者中，輕度組43例，中度組37例。結(jié)果提示，輕度組血清miR-132相對表達量和UPDRS評分低于中度組，而血清miR-150相對表達量高于中度組(P<0.05)。見表5。

2.5 PD患者血清miR-132、miR-150與炎性因子、認知功能、UPDRS評分的相關(guān)性分析 經(jīng)Pearson線性相關(guān)分析，PD患者血清miR-132與MoCA、MMSE總分呈負相關(guān)，與UPDRS評分呈正相關(guān)(P<0.05)，與血清IL-1β、IL-6、CRP、TNF-α無相關(guān)性(P>0.05)。血清miR-150與IL-1β、IL-6、CRP、TNF-α、UPDRS評分呈負相關(guān)，與MoCA、MMSE總分呈正相關(guān)(P<0.05)。見表6。

表5 不同病情PD患者的血清miR-132、miR-150表達及UPDRS評分比較

表6 PD患者血清miR-132、miR-150與炎性因子、認知功能、UPDRS評分的相關(guān)性分析

3 討論

PD以老年患者居多，首發(fā)癥狀通常為靜止性震顫，在隨意運動狀態(tài)下，癥狀可停止或緩解，情緒緊張時癥狀加重，睡眠時則停止，部分患者還會出現(xiàn)認知障礙、便秘、嗅覺障礙等非運動癥狀，其中認知障礙較為常見[10]。目前，研究發(fā)現(xiàn)，miRNA可能參與了神經(jīng)系統(tǒng)疾病的進展，例如miR-132的異常表達可減少神經(jīng)元細胞數(shù)量，削弱個體的行為能力[11]。miR-150則參與了神經(jīng)元細胞調(diào)控，其表達異常會影響神經(jīng)血管功能[12]。由此可見，血清miR-132、miR-150可能與PD進展存在關(guān)聯(lián)，了解二者在PD中的作用機制，可為臨床治療提供相關(guān)依據(jù)。

本結(jié)果顯示，與體檢者相比，PD患者的血清miR-132相對表達量升高，但血清miR-150相對表達量下降。miR-132在腦內(nèi)顆粒細胞、椎體神經(jīng)元中均存在表達，且伴隨神經(jīng)元越來越成熟，其表達也呈升高趨勢，然而，神經(jīng)元在外界刺激作用下，可導(dǎo)致miR-132進一步上調(diào)[13]。研究指出，miR-132持續(xù)過表達可增加棘突密度，而在去除miR-132的情況下，可以減少樹突及分支長度，提示miR-132對神經(jīng)發(fā)育影響較大[14]。miR-132在受到腦源性神經(jīng)生長因子刺激后會出現(xiàn)明顯升高，其對MecP2有負性調(diào)控作用，適量表達對提高神經(jīng)突觸可塑性有益，但過表達則會造成神經(jīng)功能損害[15]，這可能是miR-132參與了PD進展的機制。miR-150在造血、免疫系統(tǒng)中均有一定的調(diào)節(jié)作用，其表達下調(diào)能影響神經(jīng)元細胞調(diào)控，繼而影響神經(jīng)元功能，導(dǎo)致記憶力減退[16]，但有研究認為，miR-150表達上調(diào)可能引起腦損害[17]，與本次結(jié)論相悖，這表明miR-150可能在不同疾病以及病情不同進展階段中的表達存在差異，日后還需進一步對此予以論證。

本研究發(fā)現(xiàn)，與體檢者相比，PD患者的血清IL-1β、IL-6、CRP、TNF-α明顯增高，而MoCA、MMSE總分下降，表明PD患者存在機體炎癥與認知障礙。致炎介質(zhì)大量釋放對PD患者病情影響較大，炎癥毒性作用可通過促神經(jīng)元系統(tǒng)凋亡途徑，加重PD病情，此外，其還能促進氧自由基釋放，誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，對腦源性生長因子造成干擾，致神經(jīng)元變性[18]。研究指出，PD患者因腦內(nèi)小膠質(zhì)細胞處于激活狀態(tài)，從而致炎性因子釋放，引起IL-1β、IL-6、TNF-α升高，繼而致CRP上調(diào)，IL-1β、IL-6、CRP、TNF-α均對炎癥有促進作用，可促進神經(jīng)元丟失或性質(zhì)改變[19]。認知障礙在PD患者中常見，且與炎性反應(yīng)有關(guān)，炎性因子大量釋放，可將caspases凋亡路徑激活，促進神經(jīng)元凋亡，此外，炎癥還可引起神經(jīng)毒性反應(yīng)，引起神經(jīng)元死亡[20]。

本研究結(jié)果顯示，PD患者輕度組血清miR-132相對表達量低于中度組，而血清miR-150相對表達量高于中度組，進一步提示二者異常表達可能與PD嚴重程度有關(guān)。血清miR-132過表達可能因損害神經(jīng)功能，促進PD進展，而miR-150的作用與血清miR-132及促炎因子相反，其表達下調(diào)會引起神經(jīng)元功能異常，加重PD嚴重程度。本研究最終證實，PD患者血清miR-132與MoCA、MMSE總分呈負相關(guān)，與UPDRS評分呈正相關(guān)，提示miR-132表達水平變化與認知功能有關(guān)。miR-132過表達主要經(jīng)BDNF進行誘導(dǎo)所致，對大腦短期以及長期記憶力均有影響，從而影響認知功能[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，血清miR-132與各炎性因子無相關(guān)性，提示其表達水平可能對炎性因子無影響，而血清miR-150則與IL-1β、IL-6、CRP、TNF-α、UPDRS評分呈負相關(guān)，與MoCA、MMSE總分呈正相關(guān)。目前，血清miR-150與炎癥的關(guān)系仍處于初步探索階段，研究認為，miR-150過表達可能利用靶向AKT3對炎癥進行抑制，有利于緩解炎癥[22]，PD患者炎癥的減輕則有利于緩解神經(jīng)元受損程度，改善患者認知障礙，因此，臨床可考慮將血清miR-150表達上調(diào)作為PD治療的新靶點。

綜上，PD患者的血清miR-132明顯升高，但血清miR-150下降，且二者表達與認知功能評分密切相關(guān)，其中血清miR-150還與患者炎性因子相關(guān)，而血清miR-132與各炎性因子未見相關(guān)性。