miR-483-3p靶向APPL1對脂多糖誘導的小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞損傷的影響

于智軒 高映春

膿毒癥是機體對感染的反應失控導致的危及生命健康的器官功能障礙，其病程發(fā)展迅速，具有較高的死亡率[1]。肺臟是膿毒癥發(fā)生發(fā)展時容易受累的器官，嚴重時可并發(fā)急性呼吸窘迫綜合征。Ⅱ型肺泡上皮細胞具有分裂增殖能力，參與受損肺泡上皮的修復，維持其完整性[2]。Ⅱ型肺泡上皮細胞損傷是膿毒癥肺損傷的細胞學基礎(chǔ)，有效降低或修復Ⅱ型肺泡上皮細胞損傷是治療膿毒癥的關(guān)鍵。微小RNA(miRNA)是一類參與細胞凋亡和炎性反應等生理或病理過程的小分子非編碼RNA，在膿毒癥的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[3,4]。研究顯示，miR-483-3p在鏈脲佐菌素誘導的糖尿病小鼠和高糖誘導的心肌細胞中表達上調(diào)，過表達miR-483-3p通過轉(zhuǎn)錄抑制胰島素生長因子1加劇心肌細胞凋亡[5]。StarBase生物信息學軟件預測顯示，磷酸酪氨酸銜接蛋白1(APPL1)可能是miR-483-3p的靶基因。APPL1是與脂聯(lián)素受體直接結(jié)合的銜接蛋白，參與細胞增殖、介導胰島素信號傳遞、胞內(nèi)運輸?shù)壬磉^程。研究顯示，過表達APPL1可降低脂多糖(LPS)誘導的心肌細胞氧化損傷和凋亡，減輕LPS誘導的心肌細胞損傷[6]。LPS是革蘭氏陰性菌細胞壁的主要成分，可誘導肺泡細胞損傷。因此，本研究觀察miR-483-3p對Ⅱ型肺泡上皮細胞損傷的影響及其能否通過調(diào)控APPL1影響Ⅱ型肺泡上皮細胞損傷，以期為膿毒癥急性肺損傷的靶向分子治療提供新的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑 小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞，北京派瑞金生物科技有限公司；胎牛血清(FBS)，美國Hycolne公司；DMEM培養(yǎng)基、LipofectamineTM 2000試劑盒、AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)和雙熒光素酶活性檢測試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；LPS，美國Sigma公司；Trizol試劑，美國Invitrogen公司；miR-483-3p抑制劑(anti-miR-483-3p)、抑制劑陰性序列(anti-miR-NC)、miR-483-3p 模擬物(mimcs)、模擬對照序列(miR-NC)、APPL1過表達載體(pcDNA-APPL1)、空載體(pcDNA)、APPL1小干擾RNA(si-APPL1)、亂序無意義陰性序列(si-NC)和PCR引物，上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒，日本TaKaRa公司；丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒，南京建成生物工程研究所；APPL1抗體，美國Cell signaling Technology公司；B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)、B淋巴細胞瘤-2相關(guān)蛋白(Bax)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)多克隆抗體，美國Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染:復蘇小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞，用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)。將對數(shù)生長期的細胞，以1×105個/孔接種于6孔板中，采用LipofectamineTM 2000脂質(zhì)體法，分別轉(zhuǎn)染anti-miR-483-3p、anti-miR-NC、miR-483-3p mimcs、miR-NC、pcDNA-APPL1、pcDNA，共轉(zhuǎn)染si-NC與anti-miR-483-3p、si-APPL1與anti-miR-483-3p。轉(zhuǎn)染6 h后，更換培養(yǎng)基。再培養(yǎng)24 h，收集細胞備用。

1.2.2 細胞分組處理:調(diào)整小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞濃度為2.5×104個/ml，以1.0 ml/孔接種于24孔板中。未轉(zhuǎn)染的細胞分為對照組(Con組)和LPS組。Con組細胞正常培養(yǎng)24 h，LPS組細胞用含10 μg/ml[7]LPS的培養(yǎng)基培養(yǎng)基24 h。轉(zhuǎn)染anti-miR-483-3p、anti-miR-NC、pcDNA-APPL1、pcDNA、si-NC與anti-miR-483-3p、si-APPL1與anti-miR-483-3p的細胞，均用含10 μg/ml LPS的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，并分別記為LPS+anti-miR-483-3p組、LPS+anti-miR-NC組、LPS+pcDNA-APPL1組、LPS+pcDNA組、LPS+anti-miR-483-3p+si-NC組、LPS+anti-miR-483-3p+si-APPL1組。培養(yǎng)結(jié)束后，收集細胞，進行相應指標檢測。

1.2.3 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測細胞中miR-483-3p和APPL1表達:Trizol試劑RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，行PCR擴增。引物序列：miR-483-3p上游5’-CCCGGGCTTGTCTTTTGTT-3’，下游5’-GAGTGGG TGGCTCACTCTTCTG-3’；APPL1上游5’-GTGCCACAGCTGAGCTGCCCG-3’，下游5’-TGCCCAGATCCTTCGCAGCC-3’；U6上游5’-TGGCCCATGCTATATGCTCC-3’，下游5’-CGGATAGGCCCTCTTGAGA-3’；GAPDH上游5’-TATGATGATATCAAGAGGG T AGT-3’，下游5’-TGTATCCAAACTCATTGTCATAC-3’。miR-483-3p以U6為內(nèi)參，APPL1以GAPDH為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計算miR-483-3p和APPL1 mRNA的相對表達水平。

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附法檢測細胞中MDA和SOD水平:裂解細胞，3 500 r/min離心10 min，上清液-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。分別參照MDA和SOD試劑盒說明書，硫代巴比妥酸法檢測上清中MDA含量，黃嘌呤氧化酶法檢測上清中SOD水平。

1.2.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡:PBS清洗細胞2次，參照Annexin V-FITC/PI試劑盒，用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.6 蛋白印跡(western blot)法檢測細胞中APPL1、Bcl-2和Bax蛋白表達:RIPA試劑提取總蛋白，BCA法對蛋白定量，然后行SDS-PAGE電泳，并將分離蛋白濕轉(zhuǎn)至PVDF膜。置于5 %脫脂奶粉溶液中封閉1 h，分別加入APPL1(1∶1 000)、Bcl-2(1∶8 000)、Bax(1∶8 000)和GAPDH(1∶1 500)一抗，4℃孵育過夜。加入山羊抗兔二抗(1∶5 000)，室溫孵育1 h。加顯影液避光顯影，曝光拍照。

1.2.7 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-483-3p與APPL1靶向關(guān)系:PCR擴增含miR-483-3p結(jié)合位點的APPL1的3’UTR序列，克隆到p-GL3.0質(zhì)粒，構(gòu)建APPL1野生型(WT-APPL1)雙熒光光素酶報告載體。同時利用基因突技術(shù)將結(jié)合位點突變，克隆到p-GL3.0質(zhì)粒，構(gòu)建突變型(MUT-APPL1)雙熒光光素酶報告載體。將載體分別與miR-483-3p mimic、miR-NC共轉(zhuǎn)染至細胞。轉(zhuǎn)染6 h后，更換培養(yǎng)基。再培養(yǎng)24 h，收集細胞，檢測熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 miR-483-3p和APPL1在LPS誘導的小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞中的表達 與Con組比較，LPS組miR-483-3p水平升高(P<0.05)，APPL1的mRNA和蛋白水平降低(P<0.05)。見圖1，表1。

圖1 LPS誘導小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞后細胞中APPL1蛋白表達

表1 miR-483-3p和APPL1在LPS誘導的小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞中的表達

2.2 干擾miR-483-3p表達對LPS誘導的小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞損傷的影響 與Con組比較，LPS組MDA含量升高(P<0.05)，SOD活性降低(P<0.05)，細胞凋亡率和Bax蛋白水平升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平降低(P<0.05)。與LPS+anti-miR-NC組比較，LPS+anti-miR-483-3p組MDA含量降低(P<0.05)，SOD活性升高(P<0.05)，細胞凋亡率和Bax蛋白水平降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平升高(P<0.05)。見圖2、3，表2。

圖2 LPS誘導干擾miR-483-3p表達的小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞后Bax和Bcl-2蛋白表達

圖3 LPS誘導干擾miR-483-3p表達的小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞后細胞凋亡流式圖

表2 干擾miR-483-3p表達對LPS誘導的小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞損傷的影響

2.3 APPL1過表達對LPS誘導的小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞損傷的影響 與LPS+pcDNA組比較，LPS+pcDNA-APPL1組MDA含量降低(P<0.05)，SOD活性升高(P<0.05)，細胞凋亡率和Bax蛋白水平降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平升高(P<0.05)。見表3，圖4。

2.4 miR-483-3p靶向調(diào)控APPL1的表達 與共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-APPL1的miR-NC組比較，共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-APPL1的miR-483-3p組熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)。與共轉(zhuǎn)染MUT-APPL1的miR-NC組比較，共轉(zhuǎn)染MUT-PPL1的miR-483-3p組熒光素酶活性變化差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。miR-483-3p組APPL1蛋白水平低于miR-NC組(P<0.05)，anti-miR-483-3p組APPL1蛋白水平高于anti-miR-NC組(P<0.05)。見圖5、6，表4、5。

表3 APPL1過表達對LPS誘導的小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞損傷的影響

圖4 APPL1過表達對LPS誘導的小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞凋亡的影響;A LPS誘導過表達APPL1的小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞后APPL1、Bax和Bcl-2蛋白表達；B LPS誘導過表達APPL1的小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞后細胞凋亡流式圖

圖5 APPL1的3’UTR中含有與miR-483-3p互補的核苷酸序列

表4 雙熒光素酶報告實驗

2.5 抑制APPL1表達逆轉(zhuǎn)了干擾miR-483-3p表達對LPS誘導的小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞損傷的作用 與LPS+anti-miR-483-3p+si-NC組比較，LPS+anti-miR-483-3p+si-APPL1組MDA含量升高(P<0.05)，SOD活性降低(P<0.05)，細胞凋亡率和Bax蛋白水平升高(P<0.05)，APPL1和Bcl-2的蛋白水平降低(P<0.05)。見圖7，表6。

圖6 APPL1蛋白表達

表5 miR-483-3p調(diào)控APPL1蛋白表達

圖7 抑制APPL1表達逆轉(zhuǎn)了干擾miR-483-3p表達對LPS誘導的小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞凋亡的影響;A LPS誘導的干擾miR-483-3p和APPL1表達的小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞后APPL1、Bcl-2和Bax蛋白表達；B LPS誘導的干擾miR-483-3p和APPL1表達的小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞凋亡流式圖

表6 抑制APPL1表達逆轉(zhuǎn)了干擾miR-483-3p表達對LPS誘導的小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞損傷的影響

3 討論

miRNA在真核生物體中廣泛存在，研究已表明，多種miRNA參與膿毒癥的發(fā)展進程。miR-19b-3p在膿毒癥患者血清中表達降低，是敗血癥患者28 d生存的獨立預后因素，過表達miR-19b-3p減輕了膿毒癥誘導的炎性反應，其可能是膿毒癥患者早期診斷和預后的潛在生物標志物[8]；靶向下調(diào)miR-34b-5p表達可減輕膿毒癥誘導的小鼠肺微血管內(nèi)皮細胞炎性反應和細胞凋亡，為膿毒癥誘導的急性肺損傷提供了新的分子靶點[9]；miR-150-5p在LPS誘導H9c2細胞建立的膿毒癥細胞中表達下調(diào)，上調(diào)其表達可減輕膿毒癥細胞模型炎性反應[10]。

作為一種miRNA，miR-483-3p在腫瘤、心血管疾病等多種疾病中發(fā)揮調(diào)控作用，是疾病治療的潛在分子靶點[11,12]。例如，miR-483-3p在急性心肌梗死(AMI)患者中表達升高，其過表達可促進心肌細胞凋亡[13]。但目前，miR-483-3p對Ⅱ型肺泡上皮細胞損傷的影響和機制還未知。本研究首先通過LPS誘導小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞后發(fā)現(xiàn)，miR-483-3p在LPS誘導的小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞中表達升高，提示其可能參與Ⅱ型肺泡上皮細胞損傷。

膿毒癥發(fā)生發(fā)展過程中，肺組織中大量中性粒細胞和巨噬細胞被激活，導致肺局部氧自由基增多，過量的自由基打破肺組織中氧化/抗氧化平衡，損傷肺組織[14]。MDA和SOD是氧化應激的重要指標[15]。MDA是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物之一，其表達水平可間接反映氧化應激水平。SOD是機體內(nèi)重要的抗氧化酶，可清除自由基，減輕自由基對細胞和組織損傷。本研究顯示，LPS誘導小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞后，細胞中MDA含量升高，SOD活性降低，與相關(guān)報道結(jié)果[16]一致，表明LPS誘導小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞產(chǎn)生氧化應激反應。而干擾miR-483-3p表達后，LPS誘導的小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞中MDA含量降低，SOD活性升高，表明干擾miR-483-3p表達可有效降低LPS誘導的小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞氧化應激反應，減輕細胞損傷。

氧化應激可進一步誘導細胞凋亡。Bcl-2和Bax是細胞凋亡過程中重要的調(diào)控蛋白，Bcl-2表達升高可抑制細胞凋亡，而Bax表達升高則促進細胞凋亡[17]。本研究顯示，LPS處理小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞后，細胞凋亡率和Bax蛋白表達升高，Bcl-2蛋白表達降低，表明LPS可加劇小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞凋亡。而干擾miR-483-3p表達可有效抑制LPS誘導的小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞凋亡，提示靶向干擾miR-483-3p表達可能降低膿毒癥患者肺損傷，miR-483-3p可能是膿毒癥治療的潛在分子靶點。

為了進一步探討干擾miR-483-3p表達保護LPS誘導的小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞損傷的分子機制，本研究利用雙熒光光素酶報告基因?qū)嶒灱癢estern Blot法檢測miR-483-3p對小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞中APPL1蛋白表達的影響，證實了miR-483-3p靶向負調(diào)控APPL1表達。研究顯示，過表達APPL1可降低高糖誘導的小鼠足細胞凋亡，降低足細胞損傷，APPL1可能成為糖尿病腎病的新治療靶點[18]；APPL1可通過調(diào)控Nrf2/HO-1途徑抑制絨毛膜滋養(yǎng)層細胞氧化應激和凋亡[19]。但是，目前還未見APPL1影響LPS誘導的Ⅱ型肺泡上皮細胞損傷的相關(guān)報道。本研究顯示，LPS可誘導小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞中APPL1的表達，過表達APPL1可降低LPS誘導的小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞氧化應激和凋亡，表明APPL1是Ⅱ型肺泡上皮細胞的因子。本研究還顯示，抑制APPL1表達逆轉(zhuǎn)了干擾miR-483-3p表達對LPS誘導的小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞氧化應激和凋亡的抑制作用，提示干擾miR-483-3p表達通過靶向上調(diào)APPL1表達來抑制LPS誘導的小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞氧化應激和凋亡，減輕細胞損傷。

綜上所述，干擾miR-483-3p表達可抑制LPS誘導的小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞氧化應激和凋亡，減輕細胞損傷，其可能通過靶向負調(diào)控APPL1表達發(fā)揮作用，miR-483-3p/APPL1可能為膿毒癥急性肺損傷的治療提供了潛在分子靶點。