HPLC 法測(cè)定大黃通便片5 種有效成分的含量

王愛(ài)貴，周麗紅，謝作樺，陳琦，曾春芳，張思瓊

1.江西德上制藥股份有限公司，江西 樟樹(shù) 331208；2.江西德上醫(yī)藥研究院有限公司，江西 樟樹(shù) 331208；3.羅坊中心衛(wèi)生院，江西 新余 338000

大黃是蓼科植物掌葉大黃Rheum palmatumL.、唐古特大黃Rheum tanguticumMaxim.ex Balf.或藥用大黃Rheum officinaleBaill.的干燥根和根莖［1-2］。具有瀉下攻積，清熱瀉火，涼血解毒，逐瘀通經(jīng)，利濕退黃之功效［3］；主要含有蒽醌類、多糖類和鞣質(zhì)；在調(diào)節(jié)胃腸功能、抗病原微生物、抗腫瘤，保護(hù)心腦血管、肝及抗衰老等方面具有顯著功效，正成為研究熱點(diǎn)。其中蒽醌類成分藥理作用主要應(yīng)用于調(diào)節(jié)胃腸功能，如大黃素、大黃酚、蘆薈大黃素、大黃素甲醚、大黃酸等，抗病原微生物主要成分有3-羧基大黃酸、羥基蘆薈大黃素、羥基大黃素等。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外對(duì)大黃進(jìn)行了大量的研究，其藥理作用不斷被認(rèn)識(shí)，臨床應(yīng)用范圍逐步擴(kuò)大，加之人們對(duì)中醫(yī)藥的不斷認(rèn)可，大黃臨床使用量逐年加大［4-5］。大黃炮制飲片具有不同功效，酒大黃善清上焦血分熱毒，用于目赤咽腫、齒齦腫痛。熟大黃瀉下力緩、瀉火解毒，用于火毒瘡瘍。大黃炭涼血化瘀止血，用于血熱有瘀出血癥［6］。大黃通便片為江西德上制藥股份有限公司獨(dú)家生產(chǎn)品種，單處方，主要成分為大黃，主要用于患者清實(shí)熱，臨床應(yīng)用于濕熱型造成的食欲不振及便秘［7］。目前，對(duì)大黃通便片的指標(biāo)性成分含量測(cè)定主要集中在大黃素和大黃酚上，本試驗(yàn)采用HPLC 法同時(shí)測(cè)定大黃通便片中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚5 種有效成分的總含量，以期為該產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供有效手段。

1 材料

1.1 儀器

LC-20AT 高效液相色譜儀（日本島津公司）；LE204E 電子天平［梅特勒托利多儀器（上海）有限公司］；MS105DU 精度電子天平［梅特勒托利多儀器（上海）有限公司］；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海江星儀器有限公司）；QTSXR20500 數(shù)控超聲波清洗儀（天津市瑞普電子儀器公司）；AXLK1810-1 超純水機(jī)（重慶阿修羅科技發(fā)展有限公司）。

1.2 試劑

蘆薈大黃素（批號(hào)110795-202011，純度97.5%）；大黃酸（批號(hào)110757-201607，純度99.3%）；大黃素（批號(hào)110756-201913，96.0%）；大黃酚（批號(hào)110796-201922，純度99.4%）；大黃素甲醚（批號(hào)110758-201817，純度99.2%）；均來(lái)源于中國(guó)食品藥品檢定研究院。甲醇為色譜純（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。其他試劑為分析純，來(lái)源于西隴科學(xué)股份有限公司；水為超純水。

1.3 藥品

大黃通便片共6 批，由江西德上制藥股份有限公司提供。批號(hào)分別為：20080201、20090201、20100203、20050202、21020202、21100202。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

C18 色譜柱（島津GL Sciences，250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸溶液（85∶15）；流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；進(jìn)樣量20 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1對(duì)照品溶液分別取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥24 h 的蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚5 種對(duì)照品適量，精密稱定，制成每1 mL含5 種對(duì)照品成分各19.30、16.02、39.31、19.41、18.72 μg 的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2供試品溶液 取大黃通便片(批號(hào)21020202）20 片，除去包衣，研細(xì)，取3 g，精密稱定，加入甲醇25 mL，稱定重量，水浴回流30 min，取出，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)。精密移取續(xù)濾液5 mL，置50 mL 圓底燒瓶中，揮去甲醇，加2.5 mol/L 硫酸溶液10 mL，超聲處理（功率120 W，頻率59 kHz）5 min，再加三氯甲烷10 mL，加熱回流1 h，冷卻，移置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗滌容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷層，酸液用三氯甲烷提取3 次，每次10 mL，合并三氯甲烷液，以適量無(wú)水硫酸鈉脫水，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状际谷芙?，轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.2.3陰性樣品溶液［8］取處方比率的淀粉與硬脂酸粉混合物3 g，精密稱定，其他同“2.2.2”制備方法，即得。

2.3 方法學(xué)考察［9］

2.3.1系統(tǒng)適用性考察取對(duì)照品、供試品、陰性樣品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果可知，蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰與相鄰色譜峰的分離度大于1.5，理論塔板數(shù)按大黃素計(jì)算不低于3 000［10］。

2.3.2 專屬性試驗(yàn)分別進(jìn)樣20 μL 對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液，記錄色譜圖，結(jié)果見(jiàn)圖1，供試品、對(duì)照品溶液在相同保留時(shí)間上都有色譜峰，陰性樣品的色圖譜與對(duì)照品的色譜圖比較，在蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚保留時(shí)間相應(yīng)位置上無(wú)相應(yīng)的色譜峰出現(xiàn)，說(shuō)明陰性樣品無(wú)干擾。

圖1 大黃通便片各成分HPLC色譜圖：A.陰性樣品；B.混合對(duì)照品；C.供試品

2.3.3 精密度試驗(yàn)［11］精密吸取同一對(duì)照品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6 次，測(cè)得蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰面積RSD%分別為0.43%、0.54%、0.46%、0.42%、0.87%，表明精密度良好。

2.3.4重復(fù)性［12］取大黃通便片（批號(hào)：21020202），精密稱定6 份，按“2.2.2”項(xiàng)下制備供試液，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，根據(jù)測(cè)定的樣品色譜峰面積計(jì)算，平均每片大黃通便片中含有蘆薈大黃素含量0.89 mg、大黃酸0.73 mg、大黃素1.09 mg、大黃酚4.35 mg、大黃素甲醚0.92 mg，RSD 分別為0.21%、0.06%、0.05%、0.25%、0.26%，表明重復(fù)性良好。

2.3.5線性范圍考察［13］將“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下分別進(jìn)樣5、10、15、20、25 μL，以對(duì)照品質(zhì)量濃度（mg/L）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚回歸方程。結(jié)果見(jiàn)表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系

2.3.6穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一批大黃通便片（批號(hào)21020202），按“2.2.2”制備供試品溶液，分別于0、2、4、6、12、24 h 在“2.1”項(xiàng)色譜條下進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰面積RSD 分別為0.8%，1.2%，0.9%，1.3%，1.7%。測(cè)試結(jié)果表明，5 種主要活性成分在24 h 穩(wěn)定性良好。

2.3.7 回收率試驗(yàn) 精密稱量各成分含量已知的大黃通便片（批號(hào)21020202）9 份，分別按低、中、高水平加入適量對(duì)照品溶液，每個(gè)對(duì)照品濃度各加入3 份，按“2.2.2”制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 （續(xù)）

2.3.8樣品含量測(cè)定分別取6 批大黃通便片適量，精密稱定，按“2.2.2”項(xiàng)下制備供試液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下分別精密吸取上述各供試液20 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定各色譜峰峰面積，根據(jù)外標(biāo)法計(jì)算含量。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 大黃通便片含量測(cè)定結(jié)果（mg/片）

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法篩選

考察了甲醇、水、50%甲醇，發(fā)現(xiàn)以水作為提取溶劑時(shí)，各成分含量低；以甲醇提取時(shí)，各成分提取效果最佳，因此，選擇甲醇作為提取溶劑。

考察了超聲、加熱回流、冷浸三種提取方式，發(fā)現(xiàn)加熱回流提取效果較好，冷浸效果最差。最終選擇加熱回流的提取方法。

3.2 色譜條件篩選

3.2.1色譜柱考察了月旭兩種不同貨號(hào)（00215-31043、00260-31043）色譜柱,兩個(gè)不同貨號(hào)的月旭色譜柱分離效果均最好，重復(fù)性理想。

3.2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)將對(duì)照品、樣品在190～800 nm 范圍內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)各成分在254 nm 處均有較大吸收峰,而且干擾較小，基線平穩(wěn)。因此，選擇254 nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)［14］。

4 結(jié)論

大黃通便片中添加的輔料有淀粉、硬脂酸鎂等，結(jié)果證明，添加的輔料對(duì)藥品中5 個(gè)主要成分的含量測(cè)定無(wú)影響。

使用甲醇作為溶劑，水浴回流提取，揮干后加硫酸溶液與三氯甲烷，繼續(xù)回流提取，以甲醇-0.1%磷酸溶液（85∶15）為流動(dòng)相，建立了高效液相法測(cè)定大黃通便片中5 種有效成分的含量，方法分離度高，峰形較好，溶劑干擾較小，能在30 min 內(nèi)完成所有目標(biāo)峰的測(cè)定。

本實(shí)驗(yàn)建立了HPLC 法同時(shí)測(cè)定大黃通便中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚含量，該方法操作簡(jiǎn)便，重復(fù)性好，準(zhǔn)確度高，可為該制劑的質(zhì)量控制提供參考。