HPLC-MS/MS 法測定美白類化妝品中氨甲環(huán)酸

吉偉佳，易路遙，楊婷婷

江西省藥品檢驗檢測研究院，國家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評價重點實驗室，江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，江西 南昌 330029

氨甲環(huán)酸又名傳明酸、凝血酸、止血環(huán)酸，化學(xué)名反-4-氨甲基環(huán)己烷甲酸，是具有溶酶作用的藥物成分。近年來，由于某知名牙膏中添加氨甲環(huán)酸事件，使得其走進(jìn)大眾視野，作為止血藥物被公眾認(rèn)知。因其出色的止血效果氨甲環(huán)酸在醫(yī)學(xué)上多應(yīng)用于外科手術(shù)止血及創(chuàng)傷出血，隨著在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，人們發(fā)現(xiàn)它還有一個有趣的“副作用”，那就是美白祛斑。有實驗證明，不僅口服含氨甲環(huán)酸的藥物對黃褐斑有治療效果，其外用對色斑仍有效果［1］?，F(xiàn)如今，在化妝品領(lǐng)域，氨甲環(huán)酸作為一種普遍使用的美白劑，已被多國允許使用在化妝品中，例如歐洲、美國等。我國在《已使用化妝品原料目錄（2015 版）》中也將氨甲環(huán)酸列入允許使用的范圍，這更加推動了其發(fā)展，在資生堂、歐萊雅等知名品牌以及公眾熟知的國產(chǎn)美白類化妝品中都有添加，屬于常見美白成分。

氨甲環(huán)酸的美白機制在于可與體內(nèi)酪氨酸酶競爭，影響酪氨酸酶對酪氨酸催化作用的代謝，進(jìn)而抑制酪氨酸酶的活性，或者抑制纖溶酶原轉(zhuǎn)化為纖溶酶。酪氨酸酶與纖溶酶都是黑色素細(xì)胞生成黑色素的重要酶，氨甲環(huán)酸通過以上兩種途徑減少或抑制黑色素細(xì)胞產(chǎn)生黑色素，從而改善皮膚色素沉積，達(dá)到美白淡斑效果［2-6］。國內(nèi)外有許多文獻(xiàn)已經(jīng)驗證了氨甲環(huán)酸的美白效果，加之媒體、網(wǎng)絡(luò)等廣泛傳播，其中不乏有將氨甲環(huán)酸奉為“美白神藥”的說辭。而氨甲環(huán)酸作為一種廣譜美白劑，并非某些博眼球的商家所鼓吹的“神藥”，苑辰等［7］在治療色素型黑眼圈時外用5%氨甲環(huán)酸的產(chǎn)品過程中，約13.8%患者出現(xiàn)一過性的刺激性的接觸性皮炎，1 例出現(xiàn)丘疹停用后好轉(zhuǎn)。另外，其關(guān)鍵品質(zhì)受有關(guān)物質(zhì)含量控制，品質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)中有關(guān)物質(zhì)含量≤0.5%，若超出標(biāo)準(zhǔn)范圍，經(jīng)約半年后可能出現(xiàn)產(chǎn)品發(fā)黃現(xiàn)象。因此，有關(guān)物質(zhì)含量控制對產(chǎn)品品質(zhì)保障尤為關(guān)鍵［8］。

綜上所述，用于化妝品中氨甲環(huán)酸的含量控制是用妝安全的重要環(huán)節(jié)，應(yīng)控制在安全有效的范圍內(nèi)，并非越高越好，同時需要警惕不法商家虛假標(biāo)注，誤導(dǎo)消費的情況。本實驗經(jīng)過對不同基質(zhì)美白化妝品提取檢測，建立高效、快速、靈敏的HPLC-MS/MS檢測方法，為百姓用妝安全、執(zhí)法監(jiān)管提供技術(shù)支撐。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Agilent 1200 快速液相色譜-API4000 串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國AB 公司）；XS205DU 型電子天平（精度0.01 mg，梅特勒托利多有限公司）；超聲波清洗器（中國昆山市超聲儀器有限公司）；Micro Pure UV/UF 超純水系統(tǒng)（美國Thermo Fisher 公司）；離心機（美國Thermo Fisher 公司）。

1.2 試劑

氨甲環(huán)酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度大于99%，中國食品藥品檢定研究院）；乙腈、甲醇均為色譜純，購于Sigma 公司；乙醇為色譜純，購于西隴化工公司；水為超純水。

1.3 樣品

市售美白霜、美白精華、美白乳液、美白嫩膚水、美白潔面乳、美白面膜。

2 測試方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

精密稱取氨甲環(huán)酸標(biāo)準(zhǔn)品10.00 mg，置100 mL容量瓶中，用超純水溶解稀釋定容至刻度，搖勻，作為標(biāo)準(zhǔn)儲備液，備用。（該溶液4 ℃下保存期為30 d）。再準(zhǔn)確移取適量的上述標(biāo)準(zhǔn)儲備液于10 mL容量瓶，制備成標(biāo)準(zhǔn)使用中間液備用。分別吸取適量標(biāo)準(zhǔn)使用中間液置于10 mL 容量瓶中，用80%甲醇配制成5、10、20、30、40 和50 ng/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，于4 ℃條件下儲存。

2.2 樣品前處理

取樣品0.25 g，精密稱定，置25 mL 具塞比色管中，加40%乙腈水溶液20 mL，渦旋至樣品完全分散，超聲15 min，冷卻至室溫后用40%乙腈水溶液定容至25 mL，搖勻，以5 000 r/min 離心5 min，上清液過0.22 μm 濾膜，備用。

2.3 儀器條件

2.3.1 液相色譜條件 Agilent XDB-C18 色譜柱（4.6 mm×50 mm，1.8 μm）；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：2 μL；流動相：A（水）∶B（甲醇）=80∶20；流速：0.4 mL/min。

2.3.2 質(zhì)譜條件 離子源：ESI 源；掃描方式：正離子模式掃描；掃描范圍：100～1 000 m/z；噴霧電壓：4 500 V；干燥氣溫度：450 ℃；干燥氣流速：1 000 L/h；離子源氣體1∶60.0 psi；離子源氣體2∶55.0 psi；氣簾氣：20.0 psi；碰撞氣：6 psi；入口電壓：10.0 V；質(zhì)譜采集參數(shù)見表1。

表1 氨甲環(huán)酸的質(zhì)譜條件

3 結(jié)果與討論

3.1 色譜條件的選擇

試驗考察了40%甲醇-水、50%甲醇-水、60%甲醇-水、80%甲醇-水以及40%乙腈-水、50%乙腈-水、60%乙腈-水、80%乙腈-水作為流動相體系時對目標(biāo)物的色譜分離情況。結(jié)果表明：以甲醇-水體系、乙腈-水體系為流動相時，氨甲環(huán)酸目標(biāo)峰均可有效分離，尤其是使用80%甲醇-水溶液時，目標(biāo)峰峰形尖銳對稱，響應(yīng)信號強度最高，在2 min 內(nèi)可以完成出峰且無干擾峰出現(xiàn)。試驗選擇流動相為80%甲醇-水溶液，結(jié)果如圖1 所示。

圖1 不同流動相中目標(biāo)物質(zhì)出峰情況

3.2 質(zhì)譜條件的選擇

本試驗采用快速液相色譜-API 4000 串聯(lián)質(zhì)譜儀分析系統(tǒng)，ESI 離子源，采用多反應(yīng)監(jiān)測方式檢測。實驗中，對質(zhì)譜的采集模式（Positive 與Negative），質(zhì)譜的采集條件包括錐孔電壓（Cone）、去簇電壓（DP），選擇提取離子（定性離子和定量離子）及其碰撞能量（CE）等進(jìn)行了充分優(yōu)化，獲得優(yōu)化結(jié)果。

3.3 提取溶劑的選擇

氨甲環(huán)酸極性較強，在水中易溶，適合用一定比例水溶液進(jìn)行提取，本實驗分別考察甲醇、乙腈、乙醇在不同比例（20%、40%、80%）情況下對樣品的提取效果。結(jié)果表明，氨甲環(huán)酸回收率均在80.4%～118.5%之間，其中40%乙腈作為提取溶劑時，低、中、高水平添加回收率在95.4%～97.6%之間，最接近100%，且相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%，選擇40%乙腈作為提取溶劑效果最佳，結(jié)果詳見表2。

表2 氨甲環(huán)酸在不同比例提取溶劑時的回收率（%）

3.4 線性關(guān)系

實驗考察氨甲環(huán)酸的線性行為，精密吸取濃度范圍為5～50 μg/L 的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，記錄峰面積，以質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，對應(yīng)峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示：氨甲環(huán)酸在5～50 μg/L 范圍內(nèi)與其峰面積呈良好線性關(guān)系，線性回歸方程為Y=4 761.3X+4 134.2，線性相關(guān)系數(shù)r=0.999 9。

3.5 基質(zhì)效應(yīng)考察

實驗選擇市售6 種不同基質(zhì)、不含目標(biāo)物質(zhì)的美白化妝品，分別為霜、水、乳、精華、膏、面膜，以不同基質(zhì)樣品待測溶液配制氨甲環(huán)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和用80%甲醇作為稀釋劑配制氨甲環(huán)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，比較上述標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)譜相應(yīng)情況?；|(zhì)效應(yīng)（ME）的計算等于基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液與對應(yīng)濃度的80%甲醇溶液配制氨甲環(huán)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)譜響應(yīng)百分比減去100，若結(jié)果為負(fù)值，則為基質(zhì)抑制，若結(jié)果為正值，則為基質(zhì)增強［9］。結(jié)果顯示：上述6 種不同基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液基質(zhì)效應(yīng)增強或抑制效果均不明顯（-5.3%～1.8%），與80%甲醇溶液配制標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)譜響應(yīng)基本一致，因此認(rèn)為該方法基本不存在基質(zhì)效應(yīng)。

3.6 回收率試驗與精密度

分別選取美白爽膚水、美白乳、美白霜、美白精華、美白面膜、美白潔面膏六種類型陰性產(chǎn)品，按照試驗方法分析，并進(jìn)行加標(biāo)實驗。設(shè)定高、中、低添加水平，平行試驗6 份。記錄待測物色譜峰面積，計算回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。結(jié)果表明，建立的方法對不同基質(zhì)美白化妝品具有良好的回收率，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%。方法回收率和精密度滿足試驗需求，結(jié)果詳見表3。

表3 6種美白類化妝品的回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（%）

選取目標(biāo)物質(zhì)含量為6.35 μg/g 的陽性樣品，按照實驗方法重復(fù)測定6 次，計算精密度，結(jié)果表明，陽性樣品含量為6.35 μg/g（氨甲環(huán)酸檢出），RSD 值為0.5%。取陰性樣品6 份，加入氨甲環(huán)酸對照品溶液（0.1 μg/g）按試驗方法測定，計算精密度，結(jié)果表明，樣品含量為0.098 μg/g，RSD 值為1.2%。試驗結(jié)果表明，方法精密度良好，滿足實驗要求。

3.7 檢出限與定量限

取不含目標(biāo)物質(zhì)的陰性樣品適量，精密稱定，加入不同體積的氨甲環(huán)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照試驗方法測定，選擇3 倍信噪比（S/N=3）時的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為儀器檢出限，選擇10 倍信噪比（S/N=10）時的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為定量限。本方法氨甲環(huán)酸的檢出限為0.1 μg/kg，定量限為0.3 μg/kg。

3.8 實際樣品分析

隨機選取市售美白類化妝品48 批，其中包含美白乳液10 批、美白面霜10 批、美白潤膚水7 批、美白精華10 批、美白面膜5 批、美白潔面膏6 批。按試驗方法進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：陰性樣品分析未見干擾成分，各品類均有陽性樣品檢出，檢出率高達(dá)27.1%，檢出含量范圍在0.02～1 231.60 mg/kg之間。含量較高類別為精華類，面霜類、乳液類、面膜類、潤膚水、潔面膏含量差異較小，低于精華類。可見，氨甲環(huán)酸作為一種美白劑被廣泛用于化妝品中，可能是美白祛斑功效的核心成分。

4 結(jié)論

本實驗研究建立了美白化妝品中氨甲環(huán)酸的HPLC-MS/MS 測定方法，通過優(yōu)化液相方法和前處理方法實現(xiàn)了有效避免樣品測試中的基質(zhì)效應(yīng)、解決雜質(zhì)干擾問題。方法準(zhǔn)確可靠、易于操作、檢測周期短、回收率高，為美白類化妝品中氨甲環(huán)酸的監(jiān)管工作提供技術(shù)手段。