依托泊苷脂質(zhì)微球注射液熱原及細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法

孫 丹

遼寧省檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證中心遼寧省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院藥理室，遼寧沈陽(yáng) 110036

依托泊苷是肺癌患者臨床化學(xué)治療的重要一線藥物，尤其針對(duì)廣泛期、預(yù)后較差的小細(xì)胞肺癌，其聯(lián)合順鉑方案的治療有效率高，已沿用數(shù)十年。市售依托泊苷一般會(huì)具有骨髓抑制等明顯不良反應(yīng)，并且水中的溶解度差（溶解度為58.7 mg/L）[1-2]，常會(huì)誘發(fā)刺激等不良反應(yīng)[3]。最近幾年來逐步開展的有關(guān)依托泊苷脂質(zhì)體類藥物新劑型研究，都在力求降低該品種的毒副作用，同時(shí)最大限度保留其抗癌細(xì)胞增殖生長(zhǎng)的相關(guān)藥效[2]。

依托泊苷脂質(zhì)微球注射液包含依托泊苷、脂溶性介質(zhì)、水和表面活性劑，這些成分使依托泊苷在油水兩相的界面膜中都會(huì)有一定比例的分布，從而可提高在油水均難溶的依托泊苷在乳劑介質(zhì)中的穩(wěn)定性和載藥量，并可降低其毒性及血管刺激性，同時(shí)可提高藥物的化學(xué)穩(wěn)定性及療效，使得該制劑在臨床應(yīng)用中具有高效性、低毒性和低刺激性的優(yōu)勢(shì)。目前來看，國(guó)內(nèi)已批準(zhǔn)上市的脂質(zhì)體注射劑類型還比較少，其產(chǎn)業(yè)化規(guī)模、生產(chǎn)工藝水平同國(guó)外相關(guān)制劑相比還有一定差距，質(zhì)量控制中的熱原檢查項(xiàng)也未有文獻(xiàn)報(bào)道[4-5]。本研究通過按照《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版四部通則[6-7]中收載的“熱原檢查和細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”，旨在探討依托泊苷脂質(zhì)微球注射液2種藥典方法的可操作性與可行性，從而找出適用于該品種的相關(guān)檢查方法，以控制藥品質(zhì)量。

1 儀器與材料

ZRY-2D智能熱原儀（天津天大天發(fā)科技公司），ET-96內(nèi)毒素凝膠法測(cè)定儀（天津天大天發(fā)科技公司），vortex-5渦旋混合器（海門市其林貝爾儀器制造公司），omh180烘箱（賽默飛世爾科技公司）。

細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：150601-201885，規(guī)格：80 EU/支）；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（BET水，湛江博康海洋生物有限公司，批號(hào)：151210，2 ml/支）；鱟試劑（湛江安度斯生物有限公司，批號(hào)： 1307031，規(guī)格：0.1 ml/支，靈敏度：0.06 EU/ml；福州市新北生化工業(yè)有限公司，規(guī)格：0.1 ml/支，批號(hào)：14111112，靈敏度：0.06 EU/ml）。依托泊苷脂質(zhì)微球注射液（沈陽(yáng)藥科大學(xué)，批號(hào)：20131101、20131102、20131103，規(guī)格：50 ml∶50 mg）。

日本大耳白兔，體重2.6～3.0 kg，雄雌不限，雌兔無孕，由沈陽(yáng)藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心供應(yīng)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（遼）2014-0002。

2 方法與結(jié)果

2.1 熱原檢查

本品臨床最大給藥量為靜脈滴注，一日按體表面積100～150 mg/m2。參照《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版四部通則中“9301注射劑安全性檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則”[8]，熱原檢查設(shè)定限值可參照臨床劑量計(jì)算，樣品的注射體積每千克體重一般不少于0.5 ml，不超過10 ml。另樣品每平方米體表面積的劑量乘以0.027即可換算為每千克的體重劑量（M），故樣品臨床用量為4.05 mg/kg，熱原檢查實(shí)驗(yàn)給藥體積設(shè)定為最大給藥劑量的2倍，即8 ml/kg·BW。

按《中華人民共和國(guó)藥典》2015版四部通則中“1142熱原檢查法”[6]進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。取檢體溫合格的家兔，每批3只，耳靜脈注射本品，8 ml/kg·BW，給藥后測(cè)定體溫，共測(cè)定6次，每次間隔30 min，以6次測(cè)量體溫中最高溫度值減去基礎(chǔ)測(cè)量體溫值，即為該只家兔體溫升高溫度。結(jié)果表明，三批樣品中每只家兔體溫升高值均低于0.6 ℃，3只家兔的體溫升高數(shù)值總和均低于1.3℃。熱原檢查實(shí)驗(yàn)結(jié)果均符合規(guī)定。見表1。

表1 依托泊苷脂質(zhì)微球注射液熱原實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 細(xì)菌內(nèi)毒素

2.2.1 鱟試劑靈敏度復(fù)核標(biāo)定根據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版四部通則中“1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”[7]，進(jìn)行鱟試劑的靈敏度復(fù)核。結(jié)果顯示，2個(gè)批次的鱟試劑標(biāo)定結(jié)果均在0.5～2λ之間。見表2。2個(gè)批次鱟試劑的靈敏度均符合規(guī)定。

表2 鱟試劑靈敏度復(fù)核標(biāo)定（EU/ml）

2.2.2 細(xì)菌內(nèi)毒素限值的確定參照《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版四部通則中“9301注射劑安全性檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則”[8]進(jìn)行樣品細(xì)菌內(nèi)毒素限值的確定。計(jì)算公式：L=K/M，其中M為人使用該制劑每千克體重每小時(shí)的最大給予劑量，本品為100 mg/m2×0.027=2.7 mg/kg，K為靜脈給藥途徑，人使用該制劑每千克體重每小時(shí)最大可接受的內(nèi)毒素劑量，注射劑品種K值為5 EU/（kg·h），L=K/M=5 EU/（kg·h）/2.7 mg/（kg·h）=2 EU/mg。

2.2.3 干擾實(shí)驗(yàn)預(yù)實(shí)驗(yàn)經(jīng)過對(duì)體積分?jǐn)?shù)為1.25%、2.5%、5%乙醇溶液的考察，結(jié)果顯示，體積分?jǐn)?shù)為1.25%的乙醇對(duì)內(nèi)毒素檢查方法無影響，說明在實(shí)驗(yàn)過程中，要保證乙醇最后稀釋成終濃度為1.25%的乙醇溶液，才不會(huì)干擾內(nèi)毒素與鱟試劑的反應(yīng)。見表3。

表3 乙醇內(nèi)毒素檢查法考察結(jié)果

按《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版四部通則中“1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”[7]檢查。取3批樣品，使用靈敏度為0.06 EU/ml的鱟試劑。先使用60%乙醇代替內(nèi)毒素檢查用水稀釋樣品原液，并在渦旋混合器上振蕩5 min，經(jīng)過步驟稀釋后樣品終濃度為0.03 mg/ml（與λ=0.06 EU/ml鱟試劑相對(duì)應(yīng)的稀釋液濃度）及0.06 mg/ml（用于考察）。陰性對(duì)照（NC）為細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水，陽(yáng)性對(duì)照（PC）為0.125 EU/ml內(nèi)毒素溶液，樣品陽(yáng)性對(duì)照（PPC）為含0.125 EU/ml內(nèi)毒素的相應(yīng)濃度的樣品溶液。加完樣品后，輕輕混勻，37℃±1℃保溫1 h后記錄試驗(yàn)結(jié)果。見表4。結(jié)果表明，依托泊苷脂質(zhì)微球0.03 mg/ml稀釋液（NPC）細(xì)菌內(nèi)毒素檢查符合規(guī)定，初步確定該樣品0.03 mg/ml濃度為最大無干擾濃度。

表4 依托泊苷脂質(zhì)微球注射液細(xì)菌內(nèi)毒素干擾實(shí)驗(yàn)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.4 干擾試驗(yàn)按《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版四部通則中“1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”[7]進(jìn)行干擾實(shí)驗(yàn)，依托泊苷脂質(zhì)微球稀釋液濃度為0.03 mg/ml。將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品分別用BET水和樣品稀釋液稀釋至0.125、0.06、0.03、0.015 mg/ml濃度，平行4管，同時(shí)用上述樣品稀釋液及BET水分別做平行2管陰性對(duì)照，輕輕混勻，37℃±1℃測(cè)定儀保溫1 h后，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。見表5。結(jié)果表明，用上述兩個(gè)廠家鱟試劑分別進(jìn)行干擾試驗(yàn)，Es均在0.5～2.0λ，Et均在0.5～2.0 Es，依托泊苷脂質(zhì)微球注射液0.03 mg/ml濃度稀釋液無干擾。

表5 依托泊苷脂質(zhì)微球注射液的干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果（λ=0.06 EU/ml）

2.2.5 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查樣品細(xì)菌內(nèi)毒素限值擬定為：每1 mg依托泊苷脂質(zhì)微球注射液中含內(nèi)毒素的量應(yīng)小于2 EU。按《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版四部通則中“1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”[7]進(jìn)行檢查。使用鱟試劑的靈敏度為0.06 EU/ml，樣品濃度為0.03 mg/ml稀釋液，陰性對(duì)照為BET水，陽(yáng)性對(duì)照為0.125 EU/ml內(nèi)毒素溶液，樣品陽(yáng)性對(duì)照是以樣品0.03 mg/ml濃度稀釋液來稀釋0.125 EU/ml的內(nèi)毒素溶液，樣品加完后，注意輕輕混勻，37℃±1℃保溫1 h并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。見表6。結(jié)果表明，按照擬定標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)，三批依托泊苷脂質(zhì)微球注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查均符合設(shè)定限值規(guī)定。

表6 依托泊苷脂質(zhì)微球注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果（安度斯λ=0.06 EU/ml）

3 討論

參照《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版四部通則中“9301注射劑安全性檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則”[8]，熱原檢查限值參照臨床使用劑量計(jì)算，對(duì)于重癥用藥、需聯(lián)合用藥的藥品，一般為人用每千克體重每小時(shí)最大給予供試品劑量的2～5倍。依托泊苷脂質(zhì)微球注射液適用于與其他抗腫瘤藥物如順鉑等合用，治療支氣管肺癌及睪丸癌。也可用于惡性淋巴瘤、急性非淋巴細(xì)胞性白血病、尤文氏癌和消化道惡性腫瘤的聯(lián)合化療。故熱原檢查試驗(yàn)劑量設(shè)定為8 ml/kg，相當(dāng)于臨床人用劑量的2倍，從嚴(yán)保障臨床用藥安全性。

預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)直接使用BET水稀釋依托泊苷脂質(zhì)微球注射液進(jìn)行干擾預(yù)實(shí)驗(yàn)，但從結(jié)果來看樣品稀釋液對(duì)鱟試劑有增強(qiáng)型的干擾作用。故參照文獻(xiàn)[9]實(shí)驗(yàn)方法，以60%乙醇溶液溶解本品，再進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。具體操作使用0.67 ml 60%乙醇溶液加入1 ml樣品原液，振蕩5 min。接下來按照一般樣品稀釋步驟進(jìn)行，即保證乙醇溶液終體積分?jǐn)?shù)為1.25%。本品內(nèi)毒素限值擬定為計(jì)算限值，即2 EU/mg，三批樣品的內(nèi)毒素檢查結(jié)果均符合制定限值規(guī)定。但本品有干擾作用，需用60%乙醇溶解本品，同時(shí)鱟試劑中含有多種蛋白質(zhì)，而乙醇則使蛋白質(zhì)變性，從而干擾鱟試劑與內(nèi)毒素產(chǎn)生凝膠反應(yīng)[10]，這就決定了供試品中乙醇含量不能過高，且還需選用高靈敏度的鱟試劑才能排除干擾。

因各生產(chǎn)企業(yè)在鱟試劑生產(chǎn)過程中原料、工藝、批次、質(zhì)量控制等方面的不同，本實(shí)驗(yàn)前期選用不同品牌鱟試劑進(jìn)行了預(yù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)本研究使用的兩家鱟試劑干擾較小，適用于該品種的檢查。

和傳統(tǒng)熱原檢查法相比較[11-14]，細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法因其具有多種優(yōu)點(diǎn)而被各國(guó)藥典采用，并逐步替代家兔熱原檢查法控制注射劑內(nèi)毒素的相關(guān)安全性。現(xiàn)在已經(jīng)有越來越多的藥品施行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。但與此同時(shí)，某些中藥、抗生素、生物制品、氨基酸相關(guān)注射劑、醫(yī)療器械等品種，因其與內(nèi)毒素產(chǎn)生的致熱協(xié)同反應(yīng)或干擾作用或因樣品材料的特殊、復(fù)雜性，仍需使用家兔法對(duì)特殊樣品進(jìn)行熱原控制[15]。

依托泊苷為植物成分鬼臼毒素的衍生物，臨床上主要用于小細(xì)胞肺癌、惡性生殖細(xì)胞瘤、惡性淋巴瘤、白血病等癌癥的治療。其具有廣譜抗癌癥活性及較高的治療指數(shù)，尤其對(duì)小細(xì)胞肺癌的治療效果非常好，能提高2年生存率并改善患者生存質(zhì)量。但依托泊苷在臨床使用過程中最常見不良反應(yīng)為Ⅲ～Ⅳ度血液學(xué)不良反應(yīng)、發(fā)熱及感染，成因主要是藥理作用通過抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ，導(dǎo)致DNA結(jié)構(gòu)被破壞造成永久損傷，引發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡而起到治療作用。故骨髓抑制為藥物的主要毒性，其中嗜中性白細(xì)胞會(huì)顯著減少。而肝臟、腎臟、心臟及神經(jīng)系統(tǒng)的不良反應(yīng)比較少[16]。需要嚴(yán)格控制藥品質(zhì)量，以排除因藥品質(zhì)量問題引起的發(fā)熱反應(yīng)，保證臨床用藥安全。以目前對(duì)依托泊苷脂質(zhì)微球的研究發(fā)展程度來看，以后必然會(huì)出現(xiàn)越來越多相關(guān)制劑，本研究盡早制訂其熱原、內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)，為以后該品種的發(fā)展盡一份綿薄之力。