天然低共熔溶劑提取杜仲葉綠原酸及其抗氧化活性

郁 峰， 王志宏， 張光耀， 杜志云， 彭密軍*

(1.廣東省科學(xué)院測(cè)試分析研究所(中國廣州分析測(cè)試中心) 廣東省化學(xué)危害應(yīng)急檢測(cè)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州 510070; 2.廣東工業(yè)大學(xué) 生物醫(yī)藥學(xué)院,廣東 廣州 510070)

杜仲又名思仲、思仙等，是我國名貴中藥材，杜仲葉和皮有著相似的化學(xué)成分和藥理特性。綠原酸為杜仲葉主要活性成分之一，為《中國藥典》2020版中給出的杜仲葉標(biāo)志性成分，具有抗氧化、抗紫外、抗輻射、抗菌、保護(hù)心血管、調(diào)節(jié)免疫等多種藥理作用[1]，在生物、醫(yī)藥、食品和化工等領(lǐng)域都具有廣泛的應(yīng)用。已有研究表明，癌癥、衰老或其他疾病大都與過量自由基的產(chǎn)生有關(guān)，而綠原酸的抗氧化作用可以有效克服自由基所帶來的危害。如何高效和綠色地從杜仲葉中提取綠原酸一直備受關(guān)注。傳統(tǒng)有機(jī)溶劑如乙醇、氯仿和乙酸乙酯等作為提取劑廣泛應(yīng)用于制藥、食品、化妝品等行業(yè)中，但大量使用有機(jī)溶劑會(huì)污染環(huán)境，并存在溶劑殘留，所以選擇一種天然、綠色的提取溶劑十分重要。天然低共熔溶劑(NADES)[2-3]是具有類似離子液體(ILs)物理性質(zhì)的溶劑。目前已有報(bào)道由膽堿、尿素[3]、有機(jī)酸[4]和糖[5]等不同組分組成的NADES。與ILs和傳統(tǒng)有機(jī)溶劑相比，NADES具有經(jīng)濟(jì)、環(huán)保等優(yōu)勢(shì)，如可生物降解、可回收、成本低、制備方法簡(jiǎn)單等。此外，NADES對(duì)非極性和極性化合物都具有很強(qiáng)的增溶能力，并對(duì)生物活性成分具有較高的提取效率[6]，同時(shí)NADES可以溶解大分子[7]。因此，將NADES用作溶劑來提取有價(jià)值的生物活性成分在食品、化妝品和制藥行業(yè)中具有巨大的發(fā)展前景。NADES替代傳統(tǒng)溶劑對(duì)紅花中酚類次生代謝物[8]、槐花中總黃酮[9]、丹參中生物堿[10]、沙棘籽粕中多酚[11]等的提取已有報(bào)道，但還沒有NADES用于提取杜仲葉中綠原酸的報(bào)道。本研究以杜仲葉為原料，采用超聲波輔助NADES提取杜仲葉中的綠原酸，通過單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面優(yōu)化確定最佳提取工藝，進(jìn)一步考察杜仲葉綠原酸提取物的抗氧化活性，以期為杜仲葉在制藥、食品、化妝品等行業(yè)中的開發(fā)和利用提供理論基礎(chǔ)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

杜仲葉于2017年8月采于吉首大學(xué)張家界校區(qū)杜仲試驗(yàn)基地，經(jīng)吉首大學(xué)谷伏安副教授鑒定為杜仲科杜仲屬杜仲(EucommiaulmoidesOliver)樣品，采集后于50 ℃烘干，粉碎、過篩，取粒徑小于300 μm的部分裝袋于常溫下保存,備用。綠原酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(純度大于99%)購于美國Sigma公司；氯化膽堿、甜菜堿、L-乳酸、山梨醇、尿素、DL-蘋果酸、D-果糖、葡萄糖、檸檬酸、抗壞血酸(Vc)、無水乙醇均為市售分析純；試驗(yàn)所用水均為超純水。

LC-20A高效液相色譜(HPLC)儀，日本島津公司；C18色譜柱(250×4.6 mm，5 μm)，美國Boston公司；5840R高速離心機(jī)，德國艾本德公司；C-MAG HS7加熱磁力攪拌器；BSA2245電子天平；AS20500BT超聲波儀，天津奧特賽恩斯有限公司。

1.2 天然低共熔溶劑篩選

1.2.1溶劑體系的篩選 制備10種不同體系的天然低共熔溶劑(NADES)用于提取杜仲葉中綠原酸，以綠原酸得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選出合適的溶劑體系。采用加熱攪拌的方法制備[7]，將氯化膽堿/L-乳酸/水、氯化膽堿/葡萄糖/水、氯化膽堿/DL-蘋果酸/水、氯化膽堿/D-果糖/水、氯化膽堿/尿素/水、甜菜堿/DL-蘋果酸/水、甜菜堿/L-乳酸/水、甜菜堿/檸檬酸/水、檸檬酸/D-果糖/水和檸檬酸/D-山梨醇/水10種NADES按物質(zhì)的量比1 ∶1 ∶4放入燒杯中，用磁力加熱攪拌器在60 ℃下攪拌為澄清均一的液體(約20～50 min)，即得制備好的溶劑。準(zhǔn)確稱取杜仲葉粉0.5 g于錐形瓶中，各加入10 mL的10種自制NADES、水和60%乙醇，混勻后超聲波輔助提取，提取條件為超聲波功率300 W、提取時(shí)間30 min、提取溫度為40 ℃，提取后離心得上清液于4 ℃保藏待測(cè)。

1.2.2溶液配比 以甜菜堿/L-乳酸/水為溶劑體系，討論3者用量對(duì)杜仲葉中綠原酸提取得率的影響。提取條件同1.2.1節(jié)。討論水用量影響時(shí)，固定甜菜堿和L-乳酸用量為1 mol，水用量分別為1、 2、 4、 6、 10 mol。然后固定水用量為4 mol，討論甜菜堿和L-乳酸用量的影響。

1.3 杜仲葉綠原酸提取工藝優(yōu)化

1.3.1單因素試驗(yàn) 確定NADES溶劑體系后，考察不同因素對(duì)杜仲綠原酸提取的影響。設(shè)置的單因素分別是：液料比(5 ∶1、 10 ∶1、 20 ∶1、 30 ∶1、 40 ∶1，mL ∶g)；提取時(shí)間(10、 30、 50、 70、 90 min)；提取溫度(30、 40、 50、 60、 70 ℃)；超聲波功率(100、 200、 300、 400、 500 W)。

1.3.2響應(yīng)面優(yōu)化工藝 在前期研究的基礎(chǔ)上，選擇影響較大的3個(gè)因素提取時(shí)間(X1)、超聲波功率(X2)、NADES中水用量(X3)為自變量，綠原酸得率(Y)為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)原理，設(shè)計(jì)3因素3水平響應(yīng)面分析試驗(yàn)。

1.4 杜仲葉綠原酸得率的測(cè)定

1.4.1HPLC分析條件 C18色譜柱；流動(dòng)相為乙腈與0.4%磷酸(體積比13 ∶87，下同)；柱溫箱溫度30 ℃；紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)327 nm；檢測(cè)時(shí)間15 min，進(jìn)樣量10 μL。

1.4.2綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密稱取20 mg綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈與0.4%磷酸溶液定容至100 mL，制得母液。分別取0.5、 1.0、 2.0、 3.0、 4.0、 5.0 mL母液至10 mL容量瓶中定容至刻度，得到一系列對(duì)照品溶液，采用HPLC測(cè)定峰面積，以峰面積(y)對(duì)對(duì)照品質(zhì)量濃度(x)作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線y=30 656.43x-44 030.48(R2=0.999 1)。

1.4.3樣品制備 綠原酸提取液稀釋20倍過0.45 μm膜后進(jìn)樣分析，得到峰面積后代入標(biāo)準(zhǔn)曲線得到稀釋液中綠原酸質(zhì)量濃度。按下式計(jì)算綠原酸得率：

Y=C×V×N/M

(1)

式中：Y—綠原酸得率，mg/g；C—稀釋液中綠原酸質(zhì)量濃度，g/L；V—提取溶液體積mL；N—稀釋倍數(shù)；M—杜仲葉原料質(zhì)量，g。

1.5 綠原酸提取物抗氧化能力測(cè)試

1.5.1羥基自由基清除率 羥基自由基(·OH)是動(dòng)物體內(nèi)常見的活性氧，會(huì)對(duì)生物分子(如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸)造成嚴(yán)重?fù)p害。試驗(yàn)使用·OH試劑盒測(cè)定杜仲葉綠原酸提取物對(duì)·OH的清除效果。測(cè)定原理為通過 Fenton反應(yīng)產(chǎn)生·OH，提供供電子受體，電子轉(zhuǎn)移后用griess試劑顯色，可形成紅色物質(zhì)，據(jù)顏色深淺定量測(cè)定樣本的抑制·OH產(chǎn)生的能力[12]。先配制不同質(zhì)量濃度的杜仲葉綠原酸提取物(NADES提取物、水提取物和60%乙醇提取物)及陽性對(duì)照品Vc(100、 200、 300、 400和500 mg/L)，分別取1 mL配制好的溶液于10 mL試管中，按試劑盒加入過氧化氫溶液、鐵離子溶液后混勻，室溫下反應(yīng)1 min后，加入griess顯色劑混勻，室溫靜置20 min后，在550 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度，分別計(jì)算杜仲葉綠原酸提取物·OH清除率(R1，%)，以未加樣的試劑作為空白對(duì)照，計(jì)算公式如式(2)：

R1=(A-B)/A×100%

(2)

式中：A—空白對(duì)照吸光度；B—樣品吸光度。

1.5.2DPPH自由基清除率 1,1-二苯基-2吡啶酰肼自由基(DPPH·)有單電子，其醇溶液顏色呈紫色，在515 nm處有強(qiáng)吸收。當(dāng)有抗氧化劑存在時(shí)，DPPH自由基被清除，溶液顏色變淺，515 nm處的吸光度下降，在一定范圍內(nèi)其吸光度的變化與自由基被清除的程度成正比[13]。首先配制不同質(zhì)量濃度杜仲葉綠原酸提取物(NADES提取物、水提取物和60%乙醇提取物)及陽性對(duì)照品Vc(20、 40、 60、 80和100 mg/L)，分別取2 mL配制好的溶液于10 mL試管中，加2 mL DPPH·的醇溶液后混勻，于黑暗中25 ℃ 水浴下保溫30 min后，在515 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度值，分別計(jì)算杜仲葉綠原酸提取物對(duì)DPPH·的清除率(R2，%)，以未加樣的試劑作為空白對(duì)照，計(jì)算公式如式(3)：

R2=(Ai-Bi)/Ai×100%

(3)

式中：Ai—空白對(duì)照吸光度；Bi—樣品吸光度。

1.5.3ABTS自由基清除率 按照Re等[14]的方法測(cè)定提取物的ABTS自由基(ABTS·)清除活性。ABTS·是通過ABTS儲(chǔ)備溶液與過硫酸鉀以體積比2 ∶1反應(yīng)產(chǎn)生，混合物在使用前在室溫下黑暗放置16 h。使用前用無水乙醇稀釋ABTS儲(chǔ)備溶液與過硫酸鉀的混合液至吸光度為0.70±0.02，得到ABTS工作溶液。配制不同質(zhì)量濃度杜仲葉綠原酸提取物(NADES提取物、水提取物和60%乙醇提取物)及陽性對(duì)照品Vc(10、 20、 30、 40和50 mg/L)，分別取0.4 mL配制好的溶液于10 mL試管中，加入3.6 mL ABTS工作溶液后混勻，室溫下反應(yīng)6 min后，在734 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度，分別計(jì)算杜仲葉綠原酸提取物對(duì)ABTS·的清除率，以未加樣的試劑作為空白對(duì)照，計(jì)算公式如式(4)：

R3=(Aii-Bii)/Aii×100%

(4)

式中：Aii—空白對(duì)照吸光度；Bii—樣品吸光度。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2007，GraphPad Prism 7.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，每組實(shí)驗(yàn)均設(shè)3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 天然低共熔溶劑篩選

2.1.1溶劑體系篩選 氯化膽堿/L-乳酸/水、氯化膽堿/葡萄糖/水、氯化膽堿/DL-蘋果酸/水、氯化膽堿/D-果糖/水、氯化膽堿/尿素/水、甜菜堿/DL-蘋果酸/水、甜菜堿/L-乳酸/水、甜菜堿/檸檬酸/水、檸檬酸/D-果糖/水、檸檬酸/D-山梨醇/水，以及水和60%乙醇提取杜仲葉綠原酸的得率分別為30.15、 16.02、 20.86、 17.75、 28.10、 22.79、 30.21、 23.59、 19.65、 17.86、 26.95和27.78 mg/g，其中甜菜堿、L-乳酸和水組成的NADES溶液體系提取綠原酸的得率最高，為30.21 mg/g，相比水提與醇提方法分別提高了12.10%和8.75%。因此選擇甜菜堿/L-乳酸/水組成的NADES溶液體系進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.1.2溶劑配比選擇

2.1.2.1水用量 準(zhǔn)確稱取杜仲葉粉0.5 g于錐形瓶中，加入10 mL甜菜堿/L-乳酸/水NADES溶液，在提取溫度40 ℃，提取時(shí)間30 min，超聲波功率300 W的條件下考察NADES中甜菜堿和L-乳酸用量為1 mol時(shí)，水用量為1、 2、 4、 6和10 mol對(duì)綠原酸得率的影響。隨著NADES水用量的增加，綠原酸得率分別為22.11、 26.44、 30.40、 30.39和30.27 mg/g，表明NADES中水用量的增加綠原酸得率呈現(xiàn)先增加后逐漸下降的趨勢(shì)。其中，當(dāng)NADES中水用量為4 mol時(shí)，提取得率最高為30.40 mg/g。這可能是因?yàn)殡S著NADES中水用量的增加，綠原酸可以充分地溶解，所以提取得率增加。當(dāng)NADES中水用量達(dá)到4 mol 時(shí)，綠原酸已基本溶解完全，再增加NADES中水用量對(duì)提取得率幾乎沒有影響。因此，適宜的NADES中水用量為4 mol。

2.1.2.2甜菜堿和L-乳酸用量 確定水用量后，按2.1.2.1節(jié)實(shí)驗(yàn)條件，用10 mL不同甜菜堿和L-乳酸用量的甜菜堿/L-乳酸/水NADES溶液進(jìn)行提取，考察各組分不同物質(zhì)的量比對(duì)綠原酸得率的影響。由表1可知，當(dāng)甜菜堿/L-乳酸/水中各組分的物質(zhì)的量比為1 ∶1 ∶4 時(shí)綠原酸得率最高為31.27 mg/g，而物質(zhì)的量比為2 ∶1 ∶4時(shí)綠原酸得率最低。這主要是由于低共溶溶劑中各組分的比例不同，會(huì)影響綠原酸在天然低共溶溶劑中溶解度，因此，適宜的NADES中各組分物質(zhì)的量比為 1 ∶1 ∶4。

表1 溶劑中各組分配比對(duì)綠原酸提取得率的影響Table 1 Effect of the proportion of each component in the solvent

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1液料比的影響 準(zhǔn)確稱取杜仲葉粉0.5 g于錐形瓶中，按液料比5 ∶1、 10 ∶1、 20 ∶1、 30 ∶1和40 ∶1(mL ∶g，下同)加入不同體積的甜菜堿/L-乳酸/水NADES溶液(各組分物質(zhì)的量比1 ∶1 ∶4，下同)，在提取溫度40 ℃，提取時(shí)間30 min，超聲波功率300 W的條件下考察液料比對(duì)綠原酸得率的影響，結(jié)果見圖1(a)。

從圖1(a)可知，液料比在5 ∶1～30 ∶1范圍時(shí)綠原酸得率隨液料比的增長(zhǎng)而增長(zhǎng)很快，當(dāng)液料比達(dá)到30 ∶1之后綠原酸得率變化不大。在提取過程中，液料比的提高必然會(huì)在較大程度上提高傳質(zhì)推動(dòng)力，有利于綠原酸得率的增加[15]。然而到達(dá)一定液料比時(shí)，傳質(zhì)推動(dòng)力不再增加。因此，適宜的液料比為30 ∶1(mL ∶g)，得率29.21 mg/g。

2.2.2提取時(shí)間 準(zhǔn)確稱取杜仲葉粉0.5 g于錐形瓶中，加入10 mL甜菜堿/L-乳酸/水NADES溶液，提取溫度40 ℃，超聲波功率300 W的條件下考察提取時(shí)間(10、 30、 50、 70、 90 min)對(duì)綠原酸得率的影響，結(jié)果見圖1(b)。

從圖1(b)可知，綠原酸得率隨著提取時(shí)間的增加先增高后降低，當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到30 min時(shí)綠原酸得率最高，為30.06 mg/g。這可能是因?yàn)樵诔暡ㄩL(zhǎng)時(shí)間作用下，其他雜質(zhì)溶出干擾綠原酸的提取，綠原酸得率反而下降。因此，適宜的提取時(shí)間為30 min。

2.2.3提取溫度 準(zhǔn)確稱取杜仲葉粉0.5 g于錐形瓶中，加入10 mL甜菜堿/L-乳酸/水NADES溶液，提取時(shí)間30 min，超聲波功率300 W的條件下考察提取溫度(30、 40、 50、 60、 70 ℃)對(duì)綠原酸得率的影響，結(jié)果見圖1(c)。

考慮到溫度對(duì)活性物質(zhì)穩(wěn)定性的影響，將30～70 ℃作為考察范圍。從圖1(c)可知，當(dāng)溫度在30～50 ℃時(shí)，綠原酸得率先增大后降低。40 ℃時(shí)綠原酸得率最高，為30.56 mg/g，隨后溫度增加，綠原酸得率增幅不大?？紤]到實(shí)際工業(yè)應(yīng)用，故選擇40 ℃繼續(xù)研究。

2.2.4超聲波功率 準(zhǔn)確稱取杜仲葉粉0.5 g于錐形瓶中，加入10 mL甜菜堿/L-乳酸/水NADES溶液，提取溫度40 ℃，提取時(shí)間30 min的條件下考察超聲波功率(100、 200、 300、 400、 500 W)對(duì)綠原酸得率的影響，結(jié)果見圖1(d)。

a.液料比liquid-to-material ratio; b.提取時(shí)間extraction time; c.提取溫度extraction temp.; d.超聲波功率ultrasonic power

由圖1(d)可知，綠原酸得率隨著功率的增加先增高后降低，當(dāng)超聲波功率達(dá)到400 W時(shí)綠原酸得率最高，為30.46 mg/g。超聲波的功率升高可使溶劑的擴(kuò)散率提高，并提高化合物的解吸率和溶解性，從而促進(jìn)成分的溶出。而功率繼續(xù)升高，有可能導(dǎo)致部分綠原酸解吸，因而得率降低。因此，適宜的超聲波功率為400 W。

2.3 杜仲葉綠原酸提取工藝響應(yīng)面優(yōu)化

2.3.1響應(yīng)面優(yōu)化及實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析 根據(jù)溶劑篩選及單因素試驗(yàn)結(jié)果，可知提取時(shí)間、超聲波功率、NADES中水用量對(duì)綠原酸得率均有顯著影響，故選取提取時(shí)間(X1)、超聲波功率(X2) 、NADES中水用量(X3)為自變量，綠原酸得率(Y)為因變量，液料比為30 ∶1(mL ∶g)，提取溫度40 ℃，根據(jù)Box-Behnken 中心組合設(shè)計(jì)原理進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，具體方案和結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

對(duì)模型的二次回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

表3 方差分析Table 3 Regression statistical analysis

2.3.2最佳條件確定 通過繪制響應(yīng)曲面圖可以更加直觀地探討相關(guān)變量之間的交互關(guān)系以及變量對(duì)響應(yīng)值的影響趨勢(shì)。模型的響應(yīng)曲面圖和等高線圖如圖2，等高線的形狀能反映兩個(gè)因素之間的相互作用情況。若等高線呈橢圓形，則兩個(gè)因素之間存在顯著交互作用；若等高線呈圓形，則兩個(gè)因素之間的交互作用無顯著性。

a.Y=f(X1,X3); b.Y=f(X1,X2); c.Y=f(X2,X3)

由圖2可知，提取時(shí)間和超聲波功率對(duì)綠原酸得率有顯著交互影響；超聲波功率和NADES中水用量對(duì)綠原酸得率有顯著交互影響。當(dāng)超聲波功率、提取時(shí)間、NADES中水用量增加時(shí)，響應(yīng)值呈現(xiàn)出先增加后減少的趨勢(shì)。響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與單因素試驗(yàn)結(jié)果相吻合。在響應(yīng)面設(shè)計(jì)的因素范圍內(nèi)，按照回歸模型利用Design-Expert 10.0.7軟件分析得出的綠原酸提取最佳條件為：提取時(shí)間42.35 min，超聲波功率342.47 W，NADES中水用量為5.43 mol，模型預(yù)測(cè)最佳綠原酸得率為31.25 mg/g。

2.3.3最佳條件驗(yàn)證 為證實(shí)預(yù)測(cè)結(jié)果以及便于實(shí)驗(yàn)操作，修正提取條件為甜菜堿、L-乳酸與水的物質(zhì)的量比為1 ∶1 ∶4，液料比為30 ∶1(mL ∶g)，提取溫度40 ℃，提取時(shí)間42 min，超聲波功率340 W，低共熔溶劑中水用量為5 mol，實(shí)際綠原酸得率為(31.46±0.25)mg/g，與理論值接近。由此可見，應(yīng)用響應(yīng)面優(yōu)化法確定的綠原酸提取條件具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。與在同等條件下用水或者60%乙醇提取綠原酸相比，NADES提取綠原酸得率分別提高了18.23%(26.61 mg/g)和14.82%(27.40 mg/g)。

2.4 綠原酸提取物抗氧化能力測(cè)試

2.4.1DPPH自由基清除率 如圖3(a)所示，在質(zhì)量濃度10～100 mg/L的范圍內(nèi)，杜仲葉綠原酸提取物對(duì)DPPH·清除活性表現(xiàn)出劑量依賴性且隨著質(zhì)量濃度的增加逐漸增大，在質(zhì)量濃度為100 mg/L時(shí)NADES提取物對(duì)DPPH·的清除率達(dá)到最大，為63.80%。計(jì)算各物質(zhì)的半數(shù)抑制質(zhì)量濃度( IC50)值，結(jié)果表明:Vc、NADES、水和60%乙醇提取物的IC50值分別為17.36、 75.16、 94.33和67.67 mg/L。由此可知，NADES提取物對(duì)DPPH·的清除效果較好，清除率強(qiáng)于水提物低于Vc和醇提物。杜仲葉綠原酸提取物含豐富酚羥基，保證了它提供質(zhì)子的能力，從而達(dá)到清除DPPH·的效果，其具體的機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

2.4.2ABTS自由基清除率 如圖3(b)所示，在質(zhì)量濃度5～50 mg/L的范圍內(nèi)，杜仲葉綠原酸提取物對(duì)ABTS·清除活性表現(xiàn)出劑量依賴性且隨著質(zhì)量濃度的增加逐漸增大，在質(zhì)量濃度為50 mg/L時(shí)NADES提取物對(duì)ABTS·的清除率達(dá)到最大，為80.54%。計(jì)算各物質(zhì)的IC50值，結(jié)果表明:Vc、NADES、水和60%乙醇提取物的IC50值分別為6.58、 19.98、 40.03和25.14 mg/L。由此可知，NADES提取物對(duì)ABTS·的清除效果較好，清除率強(qiáng)于水提物和醇提物略低于Vc。

2.4.3OH自由基清除率 如圖3(c)所示，在質(zhì)量濃度100～500 mg/L的范圍內(nèi)，杜仲葉綠原酸提取物對(duì)·OH清除活性表現(xiàn)出劑量依賴性且隨著質(zhì)量濃度的增加逐漸增大，在質(zhì)量濃度為500 mg/L時(shí)NADES提取物對(duì)·OH清除率達(dá)到最大，為82.74%。計(jì)算各物質(zhì)的IC50值，結(jié)果表明:Vc、NADES、水和60%乙醇提取物的IC50值分別為224.50、 314.20、 448.40和400.10 mg/L。由此可知，NADES提取物對(duì)·OH的清除效果較好，清除率強(qiáng)于水提物和醇提物略低于Vc。

圖3 不同提取物對(duì)DPPH·(a)、ABTS·(b)和·OH(c)消除率的影響

3 結(jié) 論

3.1采用超聲波輔助NADES提取杜仲葉綠原酸，以綠原酸得率為響應(yīng)值，通過響應(yīng)面試驗(yàn)確定杜仲葉綠原酸的最佳提取工藝為:甜菜堿、L-乳酸與水的物質(zhì)的量比為1 ∶1 ∶4，低共熔溶劑中水用量為5 mol，液料比為30 ∶1(mL ∶g)，提取溫度40 ℃，提取時(shí)間42 min，超聲波功率340 W，在此條件下提取杜仲綠原酸得率為31.46 mg/g。

3.2杜仲葉綠原酸NADES提取物具有良好的抗氧化活性，在一定濃度范圍內(nèi)其自由基清除效果與質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，清除DPPH自由基的能力強(qiáng)于水提物弱于Vc和醇提物，清除ABTS自由基和羥基自由基的能力強(qiáng)于水提物和醇提物略弱于Vc。