共載吳茱萸堿及磷酸氯喹復(fù)方脂質(zhì)體的制備及乳腺癌抗癌效果初步研究*

楊成莉，文志鵬，李明，鄭志昌

550000 貴陽(yáng)，貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 藥劑科

2020年全球乳腺癌新發(fā)病例高達(dá)226萬(wàn)例，已成為威脅女性健康的第一大癌[1]。化療仍然為其主要治療方法之一，但效果不盡理想，原因之一是缺乏適當(dāng)?shù)妮d體將化療藥物準(zhǔn)確、高效地輸送至癌癥部位發(fā)揮殺死癌癥細(xì)胞的作用。因此，研究?jī)?yōu)良載體以包載化療藥物實(shí)現(xiàn)有效遞送,對(duì)提高化療藥物治療作用具有重要意義[2]。

吳茱萸堿(evodiamine,EVO)為色胺吲哚類生物堿，是中藥吳茱萸的主要活性成分[3-4]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究結(jié)果表明，其可調(diào)控NF-κB、P53蛋白表達(dá)，具有抗癌作用[5]。Zhu等[6]研究發(fā)現(xiàn)EVO能用于抑制ER陽(yáng)性/陰性乳腺癌細(xì)胞的增殖。磷酸氯喹(chloroquine,CQ)具有抑制細(xì)胞自噬的作用使它成為抗腫瘤的熱點(diǎn)，普遍認(rèn)為其是通過(guò)阻斷自噬體與溶酶體融合過(guò)程發(fā)揮自噬抑制機(jī)制的;除此之外，CQ能調(diào)控抑瘤蛋白P53，增強(qiáng)化療藥物抗癌活性[7-8]。已有研究表明，在化學(xué)藥物治療晚期，基于細(xì)胞自我修復(fù)機(jī)制，腫瘤細(xì)胞過(guò)度激活自噬機(jī)制，進(jìn)行受損細(xì)胞自體修復(fù)，降低化療效果[9]。因此，聯(lián)合使用自噬抑制劑，抑制腫瘤細(xì)胞晚期自噬上調(diào)，或可起到協(xié)同抗腫瘤的效果。

基于以上理論研究基礎(chǔ)，本研究擬將磷酸氯喹與吳茱萸堿用于聯(lián)合抗腫瘤。但是，EVO是脂溶性藥物，水溶性小，體內(nèi)生物利用度低；而CQ為抗瘧疾藥物，對(duì)正常組織細(xì)胞也有較強(qiáng)的殺傷作用。因此，如何將EVO、CQ高效準(zhǔn)確地遞送入腫瘤部位成為本研究所要解決的關(guān)鍵問(wèn)題,而藥物載體的設(shè)計(jì)為其帶來(lái)契機(jī)。為了增加藥物在癌癥血管部位的累積，目前最常用的制劑學(xué)手段是設(shè)計(jì)納米給藥系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)化療藥物靶向遞送[9-10]。脂質(zhì)體是由類脂雙分子層形成的微型泡囊體，可同時(shí)將親水及親油的物質(zhì)包載于其中，故本研究擬將CQ及EVO共同包載于脂質(zhì)體內(nèi)，制備吳茱萸堿及磷酸氯喹復(fù)方脂質(zhì)體，作用于乳腺癌細(xì)胞，利用兩者均具有抗癌活性藥理作用，協(xié)同殺死腫瘤細(xì)胞，使治療作用更加迅速、高效。

1 材 料

1.1 儀器

SW-CJ-2F超凈工作臺(tái)(蘇凈集團(tuán)安泰公司)，BB15細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo 公司)，IX73-U倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)，ELX800通用酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-tek公司)，RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)，G16W高速離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司)，超聲波細(xì)胞破碎儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)，720型紫外分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限公司)，超聲波細(xì)胞破碎儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

1.2 試劑

膽固醇(cholesterol，CHOL;批號(hào)：111618-200301，美侖生物)、氫化大豆卵磷脂(lecithin hydrogenated，HSPC;批號(hào)：525600-2130493-01，美侖生物)、吳茱萸堿(批號(hào)：PS0075-0025，成都普思生物科技有限公司)、磷酸氯喹(批號(hào)：100421-200401，索萊寶生物試劑有限公司)、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT，批號(hào)：CO41004，美國(guó)Sigma公司)，二甲基亞砜等常規(guī)試劑(DMSO，分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)。

1.3 細(xì)胞株

人體胚胎腎細(xì)胞HEK293由四川大學(xué)生物治療國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室友情提供，人乳腺癌細(xì)胞MCF-7購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司。

2 方 法

2.1 含量測(cè)定方法

2.1.1 測(cè)定波長(zhǎng) 精密稱取干燥至恒重的EVO及CQ原料藥0.25 mg及5 mg，加1 mL甲醇溶解后，置于100 mL溶量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度為2.5 μg/mL的EVO及2.5 μg/mL的CQ對(duì)照品溶液。以蒸餾水為空白溶劑對(duì)照，在200～600 nm范圍內(nèi)進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，結(jié)果表明在EVO在λ=225 nm，CQ在λ=343 nm處有最大吸收峰[11-12]；分別取破乳后的空白脂質(zhì)體溶液，破乳后EVO-CQ-Lips脂質(zhì)體溶液同法掃描，結(jié)果表明樣品溶液同樣在225 nm及343 nm處分別有最大吸收，而空白脂質(zhì)體溶液在該兩個(gè)波長(zhǎng)處無(wú)吸收，說(shuō)明輔料和溶劑對(duì)藥物測(cè)定沒有干擾。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密稱取一定質(zhì)量的EVO并用容量瓶精密配置濃度為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 μg/mL。用720型紫外分光光度計(jì)在λ=225 nm測(cè)定其吸光度(A值)，以吸光度A值對(duì)濃度(C)線性回歸，得回歸方程：A=0.1744C+0.0504(R2=0.9991)，結(jié)果表明EVO質(zhì)量濃度在1.0～3.0 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度線性擬合度較好。

精密稱取一定質(zhì)量的CQ并用容量瓶精密配置濃度為10.0、15.0、20.0、25.0、30.0 μg/mL。用720型紫外分光光度計(jì)在λ=343 nm測(cè)定其吸光度，以吸光度A值對(duì)濃度C線性回歸，得回歸方程：A=0.0212C+0.0962(R2=0.9994)，結(jié)果表明CQ質(zhì)量濃度在1.0～3.0 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度線性擬合度較好。

2.1.3 精密度實(shí)驗(yàn) 日內(nèi)精密度：分別對(duì)EVO(1.0、2.0、3.0 μg/mL)及CQ(10.0、20.0、30.0 μg/mL)于一天內(nèi)平行測(cè)定5組吸光度，計(jì)算吸光度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)(%)，EVO、CQ吸光度的日內(nèi)精密度RSD<5.0%，結(jié)果表明EVO、CQ的日內(nèi)精密度良好。

日間精密度：分別對(duì)EVO(1.0、2.0、3.0 μg/mL)及CQ(10.0、20.0、30.0 μg/mL)于1、2、3、4、5天內(nèi)平行測(cè)定5組吸光度，計(jì)算RSD(%)，EVO、CQ吸光度的日內(nèi)精密度RSD<5.0%，結(jié)果表明EVO、CQ的日內(nèi)精密度良好。

2.1.4 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 采用加樣回收試驗(yàn)法進(jìn)行回收率計(jì)算，具體操作方法如下：分別取不同濃度EVO(1.0、2.0、3.0 μg/mL)及CQ(10.0、20.0、30.0 μg/mL)各1.0 mL與已知含量樣品溶液濃度0.5 mL進(jìn)行混合，進(jìn)行回收率(%)的計(jì)算，加樣回收率(%)=(實(shí)測(cè)值-已知量)/理論加入量×100%。結(jié)果測(cè)得EVO、CQ的回收率(%)在95%～105%之間，本法測(cè)定EVO、CQ的包封率準(zhǔn)確度良好。

2.2 EVO-CQ-Lips的制備

2.2.1 EVO-Lips的制備 采用乳化溶劑揮發(fā)法結(jié)合薄膜分散法制備EVO-Lips，按處方比例稱取EVO、HSPC、CHOL,用適量有機(jī)溶劑超聲溶解后加入20 mL圓底燒瓶中，在減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上進(jìn)行旋蒸除去有機(jī)溶劑氯仿使其形成穩(wěn)定的脂質(zhì)體膜。將制備好的脂質(zhì)體膜加入1.5 mL的硫酸銨緩沖溶液進(jìn)行水合1 h，水合1 h后轉(zhuǎn)移至4 mL EP管中，用超聲波細(xì)胞破碎儀超聲(變幅桿先用ddH2O超聲30 s，再通無(wú)水乙醇超聲30 s，超聲脂質(zhì)體時(shí)按處方設(shè)置超聲功率、超聲時(shí)間、時(shí)間設(shè)置為超聲5 s停頓5 s)。

2.2.2 EVO-CQ-Lips的制備 硫酸銨梯度法[13]：超聲完成后加入到透析袋中用PBS溶液(pH 7.4)進(jìn)行透析12 h，透析介質(zhì)為0.01 mol PBS緩沖液1 L。透析12 h后加入200 μL CQ儲(chǔ)備液(濃度為50 mg/mL)65 ℃在恒溫水浴鍋上孵育30 min，即可得到EVO-CQ-Lips。

2.2.3 EVO-CQ-Lips處方篩選 按照上述方法，以脂質(zhì)體中EVO、CQ粒徑、外觀形態(tài)、包封率載藥量為指標(biāo)，對(duì)影響因素包括乳化有機(jī)溶劑、脂質(zhì)配比、硫酸銨溶液濃度、超聲功率采用單因素結(jié)合正交設(shè)計(jì)進(jìn)行處方篩選。

2.3 EVO-CQ-Lips表征

2.3.1 粒徑分布考察 利用馬爾文激光散射粒度儀測(cè)定EVO-CQ-Lips的粒徑、多分散系數(shù)(polydisperity index,PDI)，取1 mg/mL的EVO-CQ-Lips的樣品溶液，加入粒徑比色皿及電位杯中進(jìn)行檢測(cè)，25 ℃下，重復(fù)測(cè)定3次。并且重復(fù)3次平行實(shí)驗(yàn)。

2.3.2 外觀形貌測(cè)定 采用磷鎢酸負(fù)染法[14]：按最優(yōu)處方制備EVO-CQ-Lips，雙蒸水重懸后，滴至專用銅絲上，靜置風(fēng)干后，再滴加2%(w/v)磷鎢酸負(fù)染2 min，于透射電子顯微鏡下觀察其外觀形態(tài)。

2.3.3 包封率測(cè)定 采用超速離心法測(cè)脂質(zhì)體包封率，取制備好的脂質(zhì)體混懸液，于0.8 μm濾頭過(guò)濾除去未包封于脂質(zhì)體的EVO及CQ，將過(guò)濾后的脂質(zhì)體溶液加入1.5 mL離心管中，以13 000 rpm離心90 min，收集脂質(zhì)體，加入適量甲醇超聲破乳，用 PBS 稀釋定容至適當(dāng)濃度后測(cè)定吸光度，計(jì)算脂質(zhì)體中藥物含量為WEVO及WCQ，設(shè)總投藥量為MEVO，MCQ。按下式計(jì)算包封率：EE%=WEVO/CQ/MEVO/CQ×100%。用甲醇消解EVO-CQ-Lips，使其釋放出已經(jīng)包封的EVO及CQ，采用紫外分光光度計(jì)在[λmax(EVO)=225 nm和λmax(CQ)=343 nm]分別測(cè)定EVO、CQ的包封率，根據(jù)測(cè)出的粒徑和包封率篩選出最優(yōu)處方。超速離心法加樣回收率考察: 精密稱取EVO、CQ原料于量瓶中，甲醇溶解后，加蒸餾水稀釋成濃度EVO為1.0、2.0、3.0 μg/mL,CQ為10.0、20.0、30.0 μg/mL的溶液，分別取不同質(zhì)量濃度藥物溶液 0.1 mL 與 0.2 mL 空白脂質(zhì)體混勻，同上方法離心處理加入到超濾管中，離心超濾后收集濾液，稀釋后測(cè)定吸光度，計(jì)算回收率。

2.3.4 EVO-CQ-Lips穩(wěn)定性及體外釋放研究 穩(wěn)定性：按最優(yōu)處方制備脂質(zhì)體8份，均分為A、B兩組，A組靜置于4 ℃、B組靜置于室溫條件下，于制備好脂質(zhì)體后的0、0.5、1、2、4、8、16、28、32日時(shí)用粒度儀測(cè)定其粒徑(nm)。體外釋放：最優(yōu)處方制備脂質(zhì)體在1 mL PBS溶液(A組用pH 4.0、B組用pH 7.4)重懸后放置于37 ℃、120 rpm的恒溫?fù)u床中。在預(yù)設(shè)時(shí)間點(diǎn)(0 h、0.5 h、2 h、4 h、6 h、18 h、1 d、2 d、4 d、7 d、14 d、21 d、28 d)將釋放介質(zhì)全部取出，并立即補(bǔ)以預(yù)熱的相同體積對(duì)應(yīng)pH的新鮮釋放介質(zhì)。采用UV-vis 法在225 nm、343 nm波長(zhǎng)處測(cè)定樣品中的EVO及CQ的含量，計(jì)算各樣品累計(jì)釋放率并以釋放率及對(duì)應(yīng)時(shí)間制作釋放曲線。

2.4 EVO-CQ-Lips體外毒性研究

以人腎胚細(xì)胞HEK293細(xì)胞為正常細(xì)胞研究模型，采用MTT法檢測(cè)EVO-CQ-Lips對(duì)正常細(xì)胞殺傷作用。具體來(lái)說(shuō)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HEK293細(xì)胞以每孔4 000個(gè)的密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，放入CO2孵箱24 h后吸棄原有培養(yǎng)基，然后依次加入系列濃度藥EVO-CQ-Lips培養(yǎng)基溶液200 μL，同時(shí)加入全培養(yǎng)基作為空白對(duì)照組，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL),于4 h后從孵箱中取出96孔板中，將其液體吸出，加入150 μL的二甲基亞砜溶液后立即用酶標(biāo)儀于570 nm測(cè)定其吸光值。

2.5 EVO-CQ-Lips細(xì)胞體外抗腫瘤活性研究

2.5.1 MTT檢測(cè)EVO-CQ-Lips對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖抑制作用 采用MTT法測(cè)定EVO-CQ-Lips體外抗MCF-7增殖作用。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞以3500個(gè)/孔接種于96孔板中，放入CO2孵箱24 h后吸棄原有培養(yǎng)基，然后依次加入系列濃度藥EVO-CQ-Lips以及其對(duì)應(yīng)濃度的游離EVO和CQ，以及游離EVO聯(lián)合CQ藥物培養(yǎng)基溶液200 μL，同時(shí)加入全培養(yǎng)基作為空白對(duì)照組，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL),于4 h后從孵箱中取出96孔板中，將其液體吸出，加入150 μL的二甲基亞砜溶液后立即用酶標(biāo)儀于570 nm測(cè)定其吸光值。

2.5.2 細(xì)胞活死染色對(duì)MCF-7細(xì)胞毒性作用考察 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)MCF-7細(xì)胞，以8×104/孔接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，24 h后加入終濃度梯度的EVO-CQ-Lips的納米粒細(xì)胞培養(yǎng)液0.05、5、100 μM。每個(gè)濃度設(shè)置三個(gè)復(fù)孔，同時(shí)加入全培養(yǎng)基作為空白對(duì)照組，24 h后加入配制好的Calcein-AM/PI染液。37℃孵育30 min，吸棄染色工作液，終止孵育，加入10 μL抗熒光淬滅封片液，復(fù)以細(xì)胞爬片，中性樹脂封片，于490 nm激發(fā)波長(zhǎng)下觀察黃綠色活細(xì)胞，并于545 nm處激發(fā)波長(zhǎng)下觀察紅色的死細(xì)胞。

3 結(jié) 果

3.1 EVO-CQ-Lips最優(yōu)處方確定

3.1.1 乳化溶劑篩選 采用乳化溶劑揮發(fā)法結(jié)合薄膜分散法制備脂質(zhì)體，首先對(duì)乳化溶劑進(jìn)行篩選，選擇成膜較好且均勻，真空減壓旋蒸不起泡的溶劑作為處方溶劑，乳化溶劑篩選結(jié)果見表1。結(jié)果表明，以氯仿作為成膜溶劑為最優(yōu)選項(xiàng)。

表1 處方溶劑篩選

3.1.2 最優(yōu)處方比例篩選及結(jié)果 通過(guò)單因素處方篩選方法，以氫化大豆卵磷脂∶膽固醇∶吳茱萸堿(HSPC∶CHOL∶EVO)比例、超聲功率(%)、硫酸銨濃度(pH 4.5)為影響因素，探討其對(duì)膽固醇和氫化大豆卵磷脂影響粒徑(nm)、包封率(%)的影響。以基本處方HSPC∶CHOL∶EVO取6∶3∶1、硫酸銨濃度(pH 4.5)3 M、超聲功率40%為基準(zhǔn)，孵育溫度65 ℃、超聲時(shí)間3 min為固定值,結(jié)果如表2所示。

表2 處方篩選指標(biāo)

以氯仿為處方溶劑、按處方比例制備了1～9個(gè)處方的EVO-CQ-Lips，測(cè)定其粒徑(nm)、PDI、EVO包封率(EE%)、CQ包封率(EE%)，結(jié)果如表3所示。

表3 處方篩選

綜合以上9個(gè)處方的結(jié)果可見，我們選擇了HSPC∶CHOL∶EVO為7∶2∶1、硫酸銨濃度(pH)為1 M、超聲功率為40 %為最優(yōu)處方配比，所制備最優(yōu)處方制備納米粒，粒徑、電位及包封率如表4。

表4 最優(yōu)處方納米粒特征

3.2 EVO-CQ-Lips表征

3.2.1 EVO-CQ-Lips的形態(tài)粒徑及分布測(cè)定 粒徑分布：采用粒度儀測(cè)定其粒徑(nm)及分布，粒度分布如圖1所示。由結(jié)果可見，最優(yōu)處方所制備EVO-CQ-Lips粒徑在(170±6.24)nm，其粒度分布較為均勻，PDI為0.21±0.05。TEM形態(tài)考察：透射電子顯微鏡下觀察其外觀形態(tài)。結(jié)果如圖2所示。

圖1 最優(yōu)處方的粒徑(nm)

圖2 EVO-CQ-Lips的TEM

由圖可見，EVO-CQ-Lips呈光滑類球形且分散較不均勻，EVO-CQ-Lips由于包裹了一層膽固醇和大豆磷脂酰膽堿成分，故呈不規(guī)則類球形；由于外殼連接一層CQ親水層，可見一層顏色較深的陰影層，因膽固醇含量較高，形態(tài)較穩(wěn)定。

3.2.2 EVO-CQ-Lips中EVO、CQ包封率測(cè)定 EVO的超濾離心法平均回收率可達(dá)97.4%，CQ可達(dá)98.1%，且RSD<5%，因此包封率的測(cè)定可采用超速離心法。所測(cè)得包封率為EE(EVO)%=60.03%,EE(CQ)%=76.31%。

3.3 EVO-CQ-Lips穩(wěn)定性及體外釋放研究

3.3.1 穩(wěn)定性考察 按最優(yōu)處方制備脂質(zhì)體8份，均分為A、B兩組，A組靜置于4 ℃、B組靜置于室溫條件下，于制備好脂質(zhì)體后的0、0.5、1、2、4、8、16、28、32日時(shí)用粒度儀測(cè)定其粒徑(nm)。粒徑(nm)的穩(wěn)定性結(jié)果如圖3所示。

圖3 EVO-CQ-Lips 儲(chǔ)存穩(wěn)定性考察(N=3)

最優(yōu)處方脂質(zhì)體在4 ℃和25 ℃條件下0～2 d時(shí)粒徑(nm)較為穩(wěn)定，在2～8 d時(shí)有所波動(dòng)但粒徑(nm)變化并不大，可能是因?yàn)?0 plus PALS粒度儀趨于穩(wěn)定，因而EVO-CQ-Lips在4℃和室溫儲(chǔ)存0～32 d穩(wěn)定性都較為良好。

3.3.2 體外釋放結(jié)果考察 最優(yōu)處方制備脂質(zhì)體在1 mL磷酸鹽緩沖鹽溶液(A組：pH 4.0；B組：pH 7.4)重懸后放置于37 ℃、120 rpm的恒溫?fù)u床中。在預(yù)設(shè)時(shí)間點(diǎn)(0 h、0.5 h、2 h、4 h、6 h、18 h、1 d、2 d、4 d、7 d、14 d、21 d、28 d)。釋放率曲線結(jié)果如圖4所示。

圖4 EVO及CQ在不同pH條件下釋放率比較(N=3)

體外釋放結(jié)果顯示在低pH時(shí)，CQ較EVO釋放快，而pH接近中性時(shí)兩者釋放速率相當(dāng)，釋放率均能達(dá)到80%以上。

3.4 EVO-CQ-Lips體外毒性研究

納米粒細(xì)胞毒性檢測(cè)結(jié)果見圖5。由圖可見，隨著納米粒濃度增大，對(duì)HEK293細(xì)胞的抑制率升高，但是直到濃度增大到50 μM，細(xì)胞抑制率仍然低于20%，細(xì)胞存活率高于80%。因而，納米粒對(duì)正常細(xì)胞毒性較低，可較為安全地應(yīng)用。

圖5 EVO-CQ-Lips毒性考察

3.5 EVO-CQ-Lips細(xì)胞體外抗腫瘤活性研究

結(jié)果如圖6所示，圖A顯示游離EVO對(duì)MCF-7細(xì)胞的生長(zhǎng)有抑制作用，且當(dāng)EVO濃度達(dá)到100 μM時(shí)，抑制率達(dá)到68%作用，由圖B顯示了游離CQ通過(guò)增強(qiáng)自噬對(duì)MCF-7細(xì)胞的生長(zhǎng)也有一定抑制作用，且濃度在92 μM時(shí)，抑制率接近30%。圖C將聯(lián)合EVO以及EVO-CQ-Lips對(duì)應(yīng)濃度CQ對(duì)MCF-7的抑制作用進(jìn)行考察，結(jié)果顯示盡管在高濃度時(shí)聯(lián)合CQ對(duì)EVO的抑制作用沒有顯著影響，但是在較低濃度時(shí)，抑制作用較EVO單藥有顯著提高。圖D顯示EVO-CQ-Lips對(duì)MCF-7細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用顯著高于游離CQ聯(lián)合EVO組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，并且在EVO為50 μM時(shí)，抑制作用即達(dá)到80%以上，并且EVO-CQ-Lips能達(dá)到EVO及CQ的協(xié)同遞送，更有利于體內(nèi)應(yīng)用，結(jié)果如表5所示。

圖6. MCF-7細(xì)胞長(zhǎng)抑制率圖(N=6)

表5 游離EVO、游離CQ及EVO-CQ-Lips對(duì)乳腺癌細(xì)胞的IC50值(N=5)

結(jié)果表明，EVO-CQ-Lips較游離EVO及CQ具有更強(qiáng)的體外乳腺癌增殖抑制作用，可能與脂質(zhì)體包載后顯著提高藥物溶解性有顯著關(guān)系。

3.6 細(xì)胞活死染色結(jié)果

由圖7可見，隨著納米粒藥物濃度增加，鈣黃綠素著色細(xì)胞量顯著減少，表明活細(xì)胞急劇減少，而PI著色的凋亡細(xì)胞核熒光逐漸增強(qiáng)，表明死細(xì)胞數(shù)量顯著增加。因而表明納米粒對(duì)MCF-7細(xì)胞具有顯著的殺傷作用。

圖7 不同濃度EVO-CQ-Lips對(duì)MCF-7細(xì)胞活死染色結(jié)果

4 討 論

吳茱萸堿EVO具有保護(hù)心臟、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗老年癡呆等藥理活性[15-16],現(xiàn)代藥理學(xué)研究結(jié)果則表明EVO具有抗癌作用[17]。現(xiàn)在普遍認(rèn)為自噬在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起促進(jìn)和抑制的雙重作用，在晚期腫瘤細(xì)胞中自噬過(guò)度激活，抑制氧化應(yīng)激，啟動(dòng)細(xì)胞損傷修復(fù)作用，影響抗癌效果[18-19]。磷酸氯喹具有抑制細(xì)胞自噬的作用使它成為抗腫瘤治療研究的熱點(diǎn)[20-21]。

由于吳茱萸堿是難溶性藥物，水溶性低，體內(nèi)生物利用度低，磷酸氯喹為水溶性藥物，但是其對(duì)正常細(xì)胞有一定損傷作用。故將其制備成脂質(zhì)體利用其被動(dòng)靶向修飾作用可以顯著提高吳茱萸堿生物利用度及降低磷酸氯喹毒性。

本研究采用薄膜分散法制備載吳茱萸堿脂質(zhì)體，再通過(guò)硫酸銨梯度法將酸性磷酸氯喹主動(dòng)包載于載吳茱萸堿脂質(zhì)體內(nèi)，制備共載吳茱萸堿及磷酸氯喹的復(fù)方脂質(zhì)體。通過(guò)處方優(yōu)化所制備最優(yōu)處方粒徑為(170±6.24)nm，EVO的包封率為59.22%±4.52%、載藥量6.59%±1.38%，CQ的包封率為76.29%±1.02%、載藥量10.03%±0.31%；外觀形態(tài)由于脂質(zhì)體囊泡而非實(shí)體納米球，故為不光滑類球形，體外穩(wěn)定性及釋放性能良好；乳腺癌細(xì)胞體外增殖抑制試驗(yàn)顯示該復(fù)方脂質(zhì)體較單獨(dú)使用同濃度游離藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞具有良好的殺傷效果。并且由人腎胚細(xì)胞HEK293毒性研究結(jié)果顯示，納米粒對(duì)正常細(xì)胞毒性較低，可在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)安全遞送。因此本研究成功制備載吳茱萸堿及磷酸氯喹脂質(zhì)體，并獲得良好的體外抑瘤效果。該脂質(zhì)體可共同包載CQ及EVO，提高兩者生物利用度，并且由于其粒徑<200 nm，可通過(guò)腫瘤高通透滯留效應(yīng)，將EVO及CQ被動(dòng)靶向遞送于腫瘤部位，有望在體內(nèi)進(jìn)一步獲得優(yōu)異的治療效果，值得進(jìn)一步研究。

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