PD-1、PD-L1蛋白在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)及其臨床意義*

秦緒穎，劉秀芳，張麗麗，隋紅梅，李愛華

252000 山東 聊城，山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬聊城醫(yī)院 婦產(chǎn)科(秦緒穎、張麗麗、隋紅梅、李愛華); 252000 山東 聊城，聊城市東昌府區(qū)婦幼保健院 產(chǎn)科(劉秀芳)

子宮內(nèi)膜癌(endometrial carcinoma,EC)是最常見的婦科惡性腫瘤之一[1],高級別和轉(zhuǎn)移/復(fù)發(fā)性EC患者預(yù)后差且存活率低，目前尚無明確推薦的靶向藥物。腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment,TME)是腫瘤細(xì)胞和宿主免疫系統(tǒng)相互作用的主要位點[2],是目前腫瘤學(xué)家關(guān)注的熱點。PD-1表達(dá)于多種免疫細(xì)胞表面[3]，是免疫檢查點,可抑制過度免疫反應(yīng)，防止自身免疫[4]。PD-L1作為PD-1的特異性配體，發(fā)揮分子“屏蔽”作用，使PD-L1表達(dá)陽性的腫瘤細(xì)胞免受CD8陽性T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫殺傷作用[5]。PD-1/PD-L1通路是TME影響腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵機(jī)制之一。

阻斷PD-1/PD-L1通路能夠在具有高度免疫原性的腫瘤中表現(xiàn)出持久的腫瘤抑制作用，并帶來長期緩解[6]。一項對宮頸鱗狀細(xì)胞癌的研究顯示，PD-L1陽性患者對pembrolizumab(帕博利珠單抗)顯示出良好的反應(yīng)性[7]。而nivolumab(納武利優(yōu)單抗)在鉑類耐藥卵巢癌患者中也顯示出令人鼓舞的療效[8]。EC被認(rèn)為是一種具有高度免疫原性的疾病[9]，已有學(xué)者對其開展了關(guān)于PD-1/PD-L1通路的臨床試驗[10]，但相關(guān)研究仍然較少。本課題通過檢測EC組織中PD-1、PD-L1表達(dá)情況，探討其作為EC組織中TME機(jī)制與生存期的關(guān)系,以期為EC的免疫治療提供更多依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 主要試劑

兔抗人PD-L1單克隆抗體(SP142)、免疫組化抗原修復(fù)緩沖液(pH 8.0/9.0)：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；鼠抗兔PD-1抗體(MX033)；即用型免疫組化EliVixion plus試劑盒(鼠/兔)(Kit-9901)、DAB顯色試劑盒(20×)(DAB-0031)：福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.2 研究對象

收集本院病理科2007年1月至2009年1月的子宮內(nèi)膜組織石蠟標(biāo)本，其中正常子宮內(nèi)膜標(biāo)本20例，EC標(biāo)本112例,患者年齡36～79歲，中位58.5歲；未絕經(jīng)者63例，已絕經(jīng)者49例；Ⅰ型(子宮內(nèi)膜樣癌)標(biāo)本102例，Ⅱ型EC標(biāo)本10例(透明細(xì)胞EC2例,漿液性EC8例)；高、中分化EC 62例，低分化EC 50例；分期參照2009年FIGO標(biāo)準(zhǔn)：早期(Ⅰ～Ⅱ期)80例,晚期(Ⅲ～Ⅳ期)32例；淋巴結(jié)陽性79例，淋巴結(jié)陰性33例，淺肌層浸潤49例，深肌層浸潤63例。所有標(biāo)本均由2位經(jīng)驗豐富的病理科專家閱片，所有患者術(shù)前均未進(jìn)行過任何輔助治療，具有完整的病歷資料，隨訪從手術(shù)日起到隨訪日期或死亡日期，10例失訪。所有患者家屬知情并簽署知情同意書，本研究由本院倫理委員會審查并批準(zhǔn)。

1.3 實驗方法

采用免疫組化SP法檢測PD-1、PD-L1蛋白表達(dá)。評分標(biāo)準(zhǔn)及結(jié)果判定：該實驗選用雙盲法，由兩位病理科專業(yè)醫(yī)師單獨閱片并進(jìn)行評分(本研究中以PD-1、PD-L1在淋巴細(xì)胞中的染色為陽性表達(dá))，鏡下隨機(jī)觀察5個高倍鏡視野，每視野計數(shù)100個淋巴細(xì)胞，觀察淋巴細(xì)胞的染色強度及數(shù)目，評估樣品PD-L1和PD-1陽性淋巴細(xì)胞的染色強度和所占百分比，無染色為0分，淡黃色為1分，黃色至褐色為2分，深褐色3分，超過5%淋巴細(xì)胞染色強度≥2認(rèn)定為陽性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，卡方檢驗(Pearson、Fisher精確檢驗)用于分析PD-1、PD-L1組間表達(dá)差異及其與臨床病理特征的相關(guān)性，采用Spearman分析EC組織中PD-1與PD-L1表達(dá)的相關(guān)性；通過Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析，P<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PD-1、PD-L1在正常子宮內(nèi)膜及EC組織中的表達(dá)情況

2.1.1 PD-1在正常子宮內(nèi)膜及EC組織中的表達(dá) 正常子宮內(nèi)膜組織中PD-1陽性表達(dá)率為25.0%，主要定位于淋巴細(xì)胞細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中，顯示為散在的淡棕黃色顆粒；EC組織中PD-1陽性表達(dá)率為61.6%，定位于腫瘤間質(zhì)淋巴細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，彌漫或散在分布,表現(xiàn)為黃色、棕色、棕褐色顆粒。EC組織中PD-1陽性表達(dá)率明顯高于正常子宮內(nèi)膜(表1，圖1)。

表1 正常子宮內(nèi)膜組織和子宮內(nèi)膜癌組織中PD-1的表達(dá)情況

圖1 PD-1在正常子宮內(nèi)膜及子宮內(nèi)膜樣腺癌中的表達(dá)

2.1.2 PD-L1在正常子宮內(nèi)膜及EC組織中的表達(dá) PD-L1在正常子宮內(nèi)膜組織中陽性表達(dá)率為30.0%，主要定位于淋巴細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜,為散在的棕黃色顆粒,或彌漫的黃色物質(zhì)。在EC組織中PD-L1蛋白主要定位于腫瘤間質(zhì)淋巴細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上，表現(xiàn)為散在或彌漫的棕黃色、黃色顆粒，少數(shù)定位于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上，PD-L1在EC組織中的陽性表達(dá)率為64.7%，明顯高于正常子宮內(nèi)膜(表2，圖2)。

表2 正常子宮內(nèi)膜組織和子宮內(nèi)膜癌組織中PD-L1的表達(dá)情況

圖2 PD-L1在正常子宮內(nèi)膜及子宮內(nèi)膜樣腺癌中的表達(dá)

2.2 EC組織中 PD-1、PD-L1的表達(dá)與不同臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.2.1 EC組織中 PD-1的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 EC組織中PD-1陽性表達(dá)率，高中分化組高于低分化組(75.8%vs50.0%,χ2=7.911，P=0.005)，早期高于晚期(78.8%vs53.1%；χ2=5.168，P=0.023)，淋巴結(jié)陰性組高于陽性組(79.7%vs48.5%；χ2=5.839，P=0.016)，淺肌層浸潤組高于深肌層組(77.6%vs46.0%；χ2=5.873,P=0.015)，均呈負(fù)相關(guān)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義；PD-1表達(dá)與年齡、絕經(jīng)狀態(tài)、EC類型無關(guān)(表3)。

表3 患者臨床病理特征與子宮內(nèi)膜癌組織中PD-1的表達(dá)情況

2.2.2 EC組織中PD-L1的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 EC組織中PD-L1陽性表達(dá)率，低分化組高于高中分化組(78.0%vs53.2%；χ2=7.399，P=0.007)，晚期高于早期(87.5%vs55.0%；χ2=9.148，P=0.002)，淋巴結(jié)陽性組高于陰性組(87.9%vs54.4%；χ2=9.933，P=0.002)，深肌層浸潤組高于淺肌層組，均呈正相關(guān),差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(74.6%vs51.0%；χ2=6.677，P=0.010)。除此之外，PD-L1陽性表達(dá)率與患者年齡、絕經(jīng)狀態(tài)無關(guān)(表4)。

表4 患者臨床病理特征與子宮內(nèi)膜癌組織中PD-L1的表達(dá)情況

2.3 EC組織中 PD-L1和PD-1 蛋白表達(dá)的相關(guān)性

在EC組織，PD-1的陽性表達(dá)率為61.6%，PD-L1的陽性表達(dá)率為64.7%，Spearman相關(guān)性分析檢驗顯示：rs=0.025，P=0.797，二者表達(dá)沒有相關(guān)性(表5)。

表5 PD-1表達(dá)與PLD-L1表達(dá)的相關(guān)性

2.4 EC組織中PD-1和PD-L1蛋白表達(dá)與患者術(shù)后總生存期的關(guān)系

采用 Kaplan-Meiri法分析 PD-1及PD-L1表達(dá)與總生存期(overall survival,OS)的關(guān)系，PD-1陽性組優(yōu)于陰性組[(95.8±3.8)個月vs(79.6±5.0)個月；χ2=6.551,P=0.010]；PD-L1陰性組優(yōu)于陽性組[(111.5±3.3)個月vs(77.25±3.7)個月；χ2=27.020，P<0.001]。另外，單因素分析顯示OS與病理類型、FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肌層浸潤深度、PD-1、PD-L1表達(dá)有關(guān)，多因素分析表明病理類型、FIGO分期、PD-1、PD-L1蛋白表達(dá)是獨立預(yù)后因素(表6，圖3、4)。

表6 Kaplan-Meier生存分析

圖3 EC組織中PD-1蛋白表達(dá)與生存關(guān)系圖

圖4 EC組織中PD-L1蛋白的表達(dá)與生存關(guān)系圖

根據(jù)PD-1、PD-L1蛋白在EC中的表達(dá)將其分為4種類型，I型：PD-1陽性+PD-L1陽性；II型：PD-1陽性+PD-L1陰性；III型：PD-1陰性+PD-L1陽性；IV型：PD-1陰性+PD-L1陰性。采用Kaplan-Meiri對4個組合進(jìn)行生存分析，結(jié)果表明：II型患者OS最長，III型OS最差(χ2=43.915,P<0.001)，各組數(shù)據(jù)兩兩比較統(tǒng)計學(xué)意義如下：IvsII(P=0.018)；IvsIII(P=0.038)；IvsIV(P=0.256)；IIvsIII(P<0.001)；IIvsIV(P=1.000)；IIIvsIV(P<0.001)(圖5、6)。

圖5 依據(jù)PD-1、PD-L1表達(dá)的子宮內(nèi)膜癌四分型(40×)

圖6 EC組織中PD-1、PD-L1蛋白組合表達(dá)與生存關(guān)系圖

3 討 論

3.1 PD-1、PD-L1在不同腫瘤組織中表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系

PD-1及PD-L1在許多類型惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)，與臨床病理參數(shù)存在密切聯(lián)系。Chiu等[11]研究發(fā)現(xiàn)PD-1和PD-L1在胃癌組織中均表達(dá)升高，其中PD-1在腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(tumor infiltrating lymphocyte,TIL)特別是CD3陽性效應(yīng)T細(xì)胞表達(dá)升高；而PD-L1表達(dá)與腫瘤大小、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及組織學(xué)分級顯著相關(guān)[12-15]。在乳腺癌中的研究結(jié)果與此相似，且PD-1和PD-L1表達(dá)也存在較強的相關(guān)性[14]，因此作者認(rèn)為表達(dá)于腫瘤細(xì)胞的PD-L1與TIL細(xì)胞表面PD-1相互作用，從而抑制免疫系統(tǒng)啟動對癌細(xì)胞的殺傷作用[14,16]。

本研究結(jié)果顯示，EC組織中PD-1主要分布于腫瘤間質(zhì)淋巴細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中，陽性表達(dá)率為61.6%，顯著高于正常子宮 內(nèi)膜，表達(dá)與組織分化、FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤浸潤深度呈負(fù)相關(guān)。而PD-L1蛋白主要分布于腫瘤間質(zhì)淋巴細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上，少數(shù)分布于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜(本研究將淋巴細(xì)胞PD-L1表達(dá)陽性定義為組織表達(dá)陽性)。但在2例子宮內(nèi)膜透明細(xì)胞癌組織中PD-L1主要定位于腫瘤細(xì)胞。PD-L1陽性表達(dá)率為64.7%，顯著高于正常子宮內(nèi)膜，表達(dá)與病理類型、組織學(xué)分級、FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度呈正相關(guān)，與患者年齡、絕經(jīng)狀態(tài)無關(guān)。EC組織和正常子宮內(nèi)膜中PD-1和PD-L1蛋白的表達(dá)差異及二者與臨床病理特征之間的相關(guān)性進(jìn)一步證明了PD-1/PD-L1蛋白可能成為預(yù)測EC不良結(jié)局的獨立因素。然而，在本研究中EC組織的PD-1與PD-L1蛋白表達(dá)并沒有顯示出相關(guān)性。

3.2 PD-1、PD-L1表達(dá)的預(yù)后價值

多項研究表明PD-L1表達(dá)與癌癥患者的預(yù)后密切相關(guān)，如黑色素瘤[17]、腎癌[18]、肺癌[19]和結(jié)腸直腸癌[20]，PD-L1過表達(dá)的患者預(yù)后較差,其原因可能在于PD-L1表達(dá)可導(dǎo)致TIL功能受損，阻礙抗腫瘤免疫[14]。本研究結(jié)果顯示，在EC組織中PD-1陽性組OS優(yōu)于陰性組，PD-L1陰性組OS優(yōu)于陽性組，單因素分析顯示OS與PD-1、PD-L1表達(dá)、病理類型、FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度有關(guān)，多因素分析表明病理類型、FIGO分期、PD-1、PD-L1蛋白表達(dá)是EC的獨立預(yù)后因素，結(jié)果證實了EC組織中PD-L1表達(dá)對預(yù)后的不良影響，以及PD-1高表達(dá)的生存獲益[15]?；赑D-1與PD-L1在EC中的表達(dá)情況，將其分為四種類型，Ⅰ型：PD-1陽性+PD-L1陽性；Ⅱ型：PD-1陽性+PD-L1陰性；Ⅲ型：PD-1陰性+PD-L1陽性；Ⅳ型：PD-1陰性+PD-L1陰性。采用Kaplan-Meier對4種組合進(jìn)行生存分析，結(jié)果表明：Ⅱ型患者OS最長，Ⅲ型OS最差。盡管有臨床研究報道了免疫細(xì)胞[21]和腫瘤細(xì)胞[22]PD-L1不同的預(yù)后價值，但均未能充分證明其生物標(biāo)記物意義[23-24]，而我們通過對PD-1及PD-1L組合的方法可以更加準(zhǔn)確地評估EC的預(yù)后，進(jìn)一步證實了PD-1及PD-1L作為EC預(yù)后的生物標(biāo)志意義。

3.3 EC相關(guān)PD免疫治療

近年來，TME成為腫瘤治療學(xué)研究的熱點[25]。PD-1是屬于T細(xì)胞受體CD28家族免疫檢查點受體，其配體PD-L1在TME中被激活，有助于抗腫瘤免疫逃避[25]。針對PD-1/PD-L1途徑的單克隆抗體在非小細(xì)胞肺癌、腎細(xì)胞癌和錯配修復(fù)缺陷相關(guān)結(jié)直腸癌顯示出很好的療效[20,22,26]。免疫檢查點抑制劑可誘導(dǎo)T細(xì)胞活性恢復(fù),釋放抗腫瘤免疫反應(yīng)[25,27]。腫瘤進(jìn)展是腫瘤侵襲和宿主免疫防御失衡的結(jié)果[28]，腫瘤進(jìn)展過程中往往伴隨著免疫細(xì)胞或免疫因子的變化[29]，而越來越多的研究表明：一些免疫標(biāo)記物較TNM分期更有預(yù)測價值[30]。

目前可用于PD-1抑制劑療效預(yù)測的分子標(biāo)志物有：1)PD-L1表達(dá)水平；2)微衛(wèi)星不穩(wěn)定和基因錯配修復(fù)缺陷；3)腫瘤突變免疫負(fù)荷檢測；4)腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞表達(dá)。Pembrolizumab在多種腫瘤類型中表現(xiàn)出強大的抗腫瘤活性和良好的安全性，60多個國家已批準(zhǔn)其應(yīng)用于晚期惡性腫瘤的治療，KEYNOTE-028研究發(fā)現(xiàn)Pembrolizumab應(yīng)用于晚期EC患者維持治療的療效滿意[31]，為靶向治療提供了重要參考。本研究中PD-1與PD-L1在EC中表達(dá)情況的組合分析，不僅具有指導(dǎo)預(yù)后的意義，而且對于靶向治療的選擇也具有一定的指導(dǎo)意義。

3.4 研究的優(yōu)勢及局限性

本研究結(jié)果顯示EC組織中PD-1/PD-L1單克隆抗體顯示出良好的反應(yīng)性，明確了EC組織中PD-1高表達(dá)的生存獲益和PD-L1表達(dá)對預(yù)后的不良影響，為EC的預(yù)后提供了重要參考；此外，本研究通過對PD-1、PD-L1蛋白的表達(dá)組合后進(jìn)行生存分析，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)PD-1陽性+PD-L1陰性組患者預(yù)后最好，而PD-1陰性+PD-L1陽性者預(yù)后最差，不僅提供預(yù)后信息，也為EC靶向治療提供了重要參考，為其他相關(guān)研究提供了新的研究思路。局限性：樣本均取自初次行手術(shù)治療的EC患者；沒有研究子宮內(nèi)膜上皮內(nèi)瘤變及復(fù)發(fā)性EC；沒有評估PD-1/PD-L1在子宮內(nèi)膜不同病變狀態(tài)的演變；由于樣本量少，未深入探討PD-1、PD-L1在II型EC中的意義；未對淋巴細(xì)胞進(jìn)一步標(biāo)記，無法判斷腫瘤間質(zhì)中染色的免疫細(xì)胞是否為TIL；目前用于預(yù)測免疫治療療效的分子標(biāo)志物還有：MSI、dMMR、TMB及TIL表達(dá)，但本研究未對其他分子標(biāo)志物進(jìn)行檢測，無法和其他因子進(jìn)行對照。

總之，EC中PD-1/PD-L1的深入研究，有助于篩選適當(dāng)?shù)腅C患者進(jìn)行免疫治療，使他們得到更好的生存獲益。

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