蝦肝腸胞蟲感染病理特征、18S rRNA基因序列及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

周 穎, 祝 波, 錢 冬, 盧先東, 李小冰, 李 政, 劉艷紅, 蔡惠鳳, 吳仲寧, 袁思平, 張崇虎, 葉樂平, 馬榮榮*

蝦肝腸胞蟲感染病理特征、18S rRNA基因序列及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

周 穎1, 祝 波1, 錢 冬1, 盧先東2, 李小冰1, 李 政1, 劉艷紅2, 蔡惠鳳3, 吳仲寧3, 袁思平3, 張崇虎4, 葉樂平4, 馬榮榮1*

（1.寧波大學(xué) 海洋學(xué)院, 浙江 寧波 315832; 2.寧波愛基因科技有限公司, 浙江 寧波 315105; 3.寧波市鄞州區(qū)漁業(yè)技術(shù)管理服務(wù)站, 浙江 寧波 315117; 4.浙江正大畜禽水產(chǎn)有限公司 浙江 寧波 315806）

為調(diào)查浙江省部分地區(qū)蝦肝腸胞蟲(, EHP)暴發(fā)來源及與其他宿主來源的微孢子蟲進(jìn)化關(guān)系, 本研究利用形態(tài)學(xué)特征和分子鑒定, 嘗試對引起浙江多地凡納對蝦生長緩慢綜合征的病原進(jìn)行探究. 同時基于18S rRNA基因序列分析該病原與其他地區(qū)及其他宿主來源微孢子蟲的進(jìn)化關(guān)系. 結(jié)果顯示, 所采病蝦均為EHP陽性, 采樣地區(qū)EHP 18S rRNA基因具有高度同源性, 為98.5%～100%. 對國內(nèi)外EHP基因序列進(jìn)行同源性分析, 其同源性為86.2%～100%, 所采EHP與印度EHP聚為一個分支. EHP 18S rRNA基因序列與其他水生生物微孢子蟲18S rRNA均處于不同分支, 表明18S rRNA可作為EHP的主要鑒別序列. 將本研究所采EHP與NCBI中同源性較高的比氏腸胞蟲和金頭鯛微孢子蟲比較分析, 結(jié)果表明微孢子蟲基因序列同源性與宿主進(jìn)化發(fā)育程度有關(guān), 宿主之間進(jìn)化距離越近, 則微孢子蟲基因序列同源性相聚越近.

蝦肝腸胞蟲; 凡納對蝦; 病理特征; 18S rRNA; 系統(tǒng)進(jìn)化樹

微孢子蟲是一類分布廣泛的單細(xì)胞專性細(xì)胞內(nèi)寄生蟲, 由于其孢子具有較強(qiáng)的環(huán)境抗性, 微孢子蟲的宿主范圍極廣, 其可寄生于從原生動物到哺乳動物(包括人類)的幾乎所有動物類群[1], 在迄今已知的187個屬中, 幾乎有一半會感染水生生物, 約有50屬感染水生節(jié)肢動物, 占已知種類的四分之一[1]. 蝦肝腸胞蟲(,EHP)隸屬真菌界(Fungi)、微孢子蟲門(Microsporidia)、單倍期綱(Haplophasea)、壺孢目(Chytridiopsida)、腸胞蟲科(Enterocytozoonidae)、腸胞蟲屬(), 是一類主要寄生于對蝦肝胰腺上皮細(xì)胞的微孢子蟲, 最早在1989年發(fā)現(xiàn)于馬來西亞養(yǎng)殖斑節(jié)對蝦()中[2], 后于2009年由Tourtip等[3]首次分離并正式命名. 對蝦感染EHP早期可正常攝食, 無明顯癥狀[4], 2～3個月后開始出現(xiàn)攝食減少、生長緩慢甚至停止生長等現(xiàn)象[5-6], 部分對蝦出現(xiàn)白便癥狀[7]. EHP通常不會直接引起對蝦死亡, 但會對蝦體自身免疫力產(chǎn)生一定影響. 已有學(xué)者報道, 蝦肝腸胞蟲感染可增加對蝦感染副溶血弧菌風(fēng)險[8], 給對蝦養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失. 近年來, EHP在我國養(yǎng)殖對蝦中流行率居高不下, 已成為危害我國養(yǎng)殖對蝦的重要病原之一[9].

鑒于浙江省對蝦養(yǎng)殖中蝦肝腸胞蟲病頻發(fā)問題更為突出, 不同養(yǎng)殖場及不同蝦苗來源的養(yǎng)殖對蝦均有發(fā)病, 本文以浙江寧波、臺州養(yǎng)殖場的患病對蝦為研究對象, 對不同養(yǎng)殖場以及不同國家來源的蝦肝腸胞蟲18S rRNA基因序列進(jìn)行同源性差異分析, 探究蝦肝腸胞蟲疫情爆發(fā)病原來源, 并與其他常見水產(chǎn)養(yǎng)殖動物體內(nèi)寄生的微孢子蟲序列進(jìn)行比較, 為蝦肝腸胞蟲的溯源及分類研究提供線索, 以便為后續(xù)養(yǎng)殖過程中區(qū)域爆發(fā)蝦肝腸胞蟲病的防控提供參考與指導(dǎo), 對其他地區(qū)蝦肝腸胞蟲病的防控亦可發(fā)揮指導(dǎo)作用.

1 材料與方法

1.1 發(fā)病背景及臨床癥狀

2020年6—9月在浙江寧波北侖、象山以及臺州三地對蝦養(yǎng)殖場發(fā)現(xiàn)大量凡納對蝦出現(xiàn)生長緩慢綜合征(slow growth syndrome, SGS), 患病對蝦主要表現(xiàn)為生長遲緩, 同池對蝦體長差異較大, 養(yǎng)殖水體漂浮白便. 三地養(yǎng)殖場初步檢測均為蝦肝腸胞蟲陽性. 分別于發(fā)病地區(qū)采集患病癥狀的凡納對蝦各50尾, 其中9尾用于組織切片研究, 其余樣品于95%乙醇中固定后送至實驗室, 以便進(jìn)行后續(xù)實驗.

1.2 主要試劑及儀器

Taq DNA聚合酶和2×Mix購自康為世紀(jì)生物公司; 通用型DNA提取試劑盒購自Magen公司; 瓊脂糖粉購自Sigma公司; Trans2K DNA marker購自全式金生物公司.

凝膠成像儀GelDoc XR+購自Bio-Rad公司; 高壓滅菌鍋MLS-3781L-PC購自Panasonic公司.

1.3 Masson染色

取患病對蝦的肝胰腺組織, 用Davidson’s AFA固定液固定24h后換液. 經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋后進(jìn)行切片, 控制切片厚度為5μm左右. 參考Goldner[10]的方法進(jìn)行改進(jìn)Masson染色: 切片常規(guī)脫蠟至水; Weigert氏鐵蘇木素液染色5min, 流水沖洗; 1%鹽酸乙醇分化數(shù)秒, 流水沖洗數(shù)分鐘; 麗春紅酸性品紅染色5min, 后快速漂洗; 磷鉬酸水溶液處理4min, 傾去玻片上磷鉬酸溶液; 用苯胺藍(lán)液復(fù)染3min, 傾去玻片上染液; 1%冰醋酸分化1min, 至切片無藍(lán)色脫出, 無水乙醇洗去浮色, 二甲苯透明, 中性樹膠封固, 普通光學(xué)顯微鏡觀察[11].

1.4 蝦肝腸胞蟲18S rRNA PCR擴(kuò)增

對蝦肝胰腺樣品利用Magen DNA通用提取試劑盒進(jìn)行DNA提取, 利用以下序列進(jìn)行18S rRNA基因的PCR擴(kuò)增: 18S-F (5’-CACCAGGTTGATTC TGCCTGA-3’); 18S-R (5’-TCTGAAATAGTGACG GGCGG-3’)[12]. PCR反應(yīng)體系(25μL): 10μmol·L-1上下游引物各1μL, DNA模板1.0μL, 2×Mix 12.5 μL, 雙蒸水補(bǔ)足至25μL. PCR反應(yīng)條件: 94℃3min, 94℃ 30s, 60℃ 30s, 72℃ 30s, 循環(huán)35次, 最后72℃延伸10min[13].

1.5 目的基因序列分析

利用1%瓊脂糖凝膠分離PCR產(chǎn)物, 取條帶清晰、明亮的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序. 使用DNAMAN軟件對測序結(jié)果基因序列進(jìn)行校對, 在NCBI中下載水生生物微孢子蟲、比氏腸胞蟲()和國內(nèi)外各地蝦肝腸胞蟲18S rRNA核苷酸序列. 利用DNAstar進(jìn)行核苷酸同源性分析, 利用MEGA 7.0軟件構(gòu)建Neighbor-Joining (NJ)樹, 采用1000次重復(fù)抽樣進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析.

2 結(jié)果分析

2.1 蝦肝腸胞蟲臨床癥狀及病理形態(tài)學(xué)觀察

患病對蝦暫養(yǎng)于養(yǎng)殖池中, 3個月后, 可見患病蝦體體長僅為9～10cm, 患病對蝦生長明顯遲緩(圖1), 大量白便吸附于管壁上(圖2).

圖1 患病凡納對蝦

圖2 養(yǎng)殖水體中的白色糞便

Masson染色后, 可見凡納對蝦肝小管基膜為藍(lán)色, 細(xì)胞核為顏色較深的黑藍(lán)色(圖3(a)), 病蝦組織切片中肝胰腺腔體縮小及變形(圖3(b)), 蝦肝腸胞蟲在肝小管細(xì)胞質(zhì)中有明顯的顆粒感, 顏色為較組織更深的粉紅色, 形狀呈光滑橢圓形, 多聚集分布.

注: N為細(xì)胞核; BM為肝小管基膜; E為蝦肝腸胞蟲成熟孢子.

2.2 18S rRNA 測序結(jié)果

對采樣地區(qū)蝦肝腸胞蟲 18S rRNA基因進(jìn)行PCR檢測, 18S rRNA基因擴(kuò)增產(chǎn)物大小約為1150 bp (圖4), 與NCBI已有序列進(jìn)行對比, 其與蝦肝腸胞蟲的序列相似度可達(dá)99.48%, 結(jié)合采樣病蝦表現(xiàn)出攝食減少、生長緩慢、白便等生長緩慢綜合征典型癥狀及病理特征, 基本可以確定引起凡納對蝦患病病原為蝦肝腸胞蟲.

注: NBBL為寧波北侖蝦場樣本; NBXS為寧波象山蝦場樣本; ZJTZ為浙江臺州蝦場樣本. 下圖同.

2.3 18S rRNA基因核苷酸同源性及其系統(tǒng)進(jìn)化樹

對浙江三地采集的病蝦蝦肝腸胞蟲18S rRNA核苷酸序列進(jìn)行同源性分析, 利用Blastn在NCBI數(shù)據(jù)庫中選擇同源性較高的微孢子蟲(主要感染人類免疫缺陷患者, 引起患者腹瀉的比氏腸胞蟲()[14]和寄生于金頭鯛(), 引起消瘦綜合征的微孢子蟲()[15]),利用MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹. 同源性分析結(jié)果(圖5)顯示, 采樣地區(qū)蝦肝腸胞蟲的18S rRNA基因核苷酸序列同源性為98.5%～100%, 提示采樣地區(qū)蝦肝腸胞蟲18S rRNA具有高度同源性. 蝦肝腸胞蟲聚為一個分支, 與寄生于金頭鯛的微孢子蟲相距較近, 而與比氏腸胞蟲相距較遠(yuǎn). 蝦肝腸胞蟲系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖6)顯示, 除寧波北侖2號樣品外, 其余地區(qū)樣品均處于一個大分支上, 但仍有微小差異. 18S rRNA雖然高度保守, 但不同地區(qū)來源的微孢子蟲18S rRNA仍具有一定種內(nèi)差異, 這些微小差異可作為蝦肝腸胞蟲來源追蹤及鑒定的重要依據(jù).

圖5 采樣地區(qū)18s rRNA基因核苷酸序列的同源性分析

圖6 基于18S rRNA的系統(tǒng)進(jìn)化樹(NJ法)

國內(nèi)外蝦肝腸胞蟲同源性分析結(jié)果如圖7所示, 大部分印度蝦肝腸胞蟲與中國蝦肝腸胞蟲(包括本實驗采樣地區(qū))聚集, 處于一個大分支, 與少部分印度蝦肝腸胞蟲(KX013492.1、KX013491.1)、越南蝦肝腸胞蟲以及兩株泰國蝦肝腸胞蟲(KF362130.1、KF362129.1)相聚于一個分支, 而一株泰國蝦肝腸胞蟲(FJ496356.1)則處于另一分支.

圖7 基于18S rRNA序列的國內(nèi)外蝦肝腸胞蟲系統(tǒng)進(jìn)化樹(NJ法)

采樣地區(qū)蝦肝腸胞蟲的18S rRNA基因核苷酸序列同源性為86.2%～100%. NCBI信息顯示, 單獨位于一個分支上的蝦肝腸胞蟲位于泰國東部, 另外兩株蝦肝腸胞蟲采樣地區(qū)則靠近泰國曼谷, 臨近泰國灣. 兩株單獨不聚群印度病株檢測地區(qū)臨近西孟加拉邦, 其他印度聚群病株均靠近印度南部. 由此可推測, 蝦肝腸胞蟲種間差異可能與所處地理環(huán)境差異相關(guān), 不同區(qū)域的蝦肝腸胞蟲有一定的種間差異.

2.4 蝦肝腸胞蟲與水生生物微孢子蟲18S rRNA基因序列比對

蝦肝腸胞蟲與其他水生生物微孢子蟲中序列分析顯示, 蝦肝腸胞蟲僅與中華絨螯蟹腸胞蟲()位于同一分支, 二者雖遺傳距離較近, 但仍有一定的差異. 寄生于三疣梭子蟹的梭子蟹肌孢蟲()以及引起眼斑龍蝦微孢子蟲病的微孢子蟲(sp.)處于另一大分支, 與其他微孢子蟲遺傳距離較遠(yuǎn), 寄生于黃線狹鱈的微孢子蟲(sp.)、宿主未明確的微孢子蟲(sp.)以及引起真鯛格留蟲病的微孢子蟲(sp.)則位于另一個大分支(圖8). 由此可知, 微孢子蟲基因序列同源性與宿主進(jìn)化發(fā)育程度具有一定關(guān)系, 凡納對蝦與中華絨螯蟹同屬節(jié)肢動物門軟甲綱, 而與黃線狹鱈、真鯛等親緣關(guān)系較遠(yuǎn), 該結(jié)果為微孢子蟲宿主進(jìn)化關(guān)系的研究提供了線索.

3 討論

凡納對蝦是我國主要的水產(chǎn)養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)物種, 占我國海水養(yǎng)殖蝦類的79%[9]. 蝦肝腸胞蟲雖不直接導(dǎo)致對蝦死亡, 但其引起的凡納對蝦“生長緩慢綜合征”使同一養(yǎng)殖塘中相同時期放養(yǎng)的對蝦個體大小存在明顯差異, 抵抗力下降, 易感其他病害, 大大降低對蝦養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益, 對我國凡納對蝦養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失. 因此, 蝦肝腸胞蟲的早期診斷防控以及與其他水生生物微孢子蟲的區(qū)分鑒別在我國凡納對蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中具有重要意義.

本研究對浙江三地所采病蝦樣本, 進(jìn)行臨床病例特征觀察, 感染蝦肝腸胞蟲的凡納對蝦生長明顯遲緩. 正常對蝦養(yǎng)殖3個月體長可達(dá)20cm, 本實驗對蝦在相同條件下養(yǎng)殖3個月后, 體長不足正常養(yǎng)殖對蝦的一半. Masson法被廣泛應(yīng)用于節(jié)肢動物組織中纖維及炎性因子的染色, 故本研究以Masson染色法對患病凡納對蝦肝胰病變組織情況進(jìn)行觀察, 通過孢囊整體形態(tài)及染色深度初步判定為蝦肝腸胞蟲感染, 但由于蝦肝腸胞蟲大小僅為1～2μm[16], 難以對蝦肝腸胞蟲感染進(jìn)行確診. 病理切片診斷設(shè)備要求高, 觀察較為困難, 檢出率低, 無法確診, 不適于用作蝦肝腸胞蟲的常規(guī)檢測手段.

基于蝦肝腸胞蟲18S rRNA序列同源性分析以及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示, 從三種不同養(yǎng)殖地采樣并分離的蝦肝腸胞蟲18S rRNA同源性較高, 聚為一個分支, 同種間的序列差異較小. 與NCBI中同源性較高的比氏腸胞蟲和金頭鯛微孢子蟲比較分析發(fā)現(xiàn), EHP與這兩種微孢子蟲均位于不同的分支, 與寄生于金頭鯛的微孢子蟲基因序列相距較近, 而與感染人類的比氏腸胞蟲相距較遠(yuǎn), 表明微孢子蟲基因序列同源性與宿主進(jìn)化發(fā)育程度有關(guān), 且蝦肝腸胞蟲可通過18S rRNA序列與相似種群微孢子蟲進(jìn)行區(qū)分鑒定. 為進(jìn)一步探究EHP與NCBI中其余寄生水生生物微孢子蟲的序列同源性, 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示, 僅有中華絨螯蟹腸胞蟲與蝦肝腸胞蟲處于同一分支, 其余水生生物中的微孢子蟲遺傳距離都相對較遠(yuǎn), 提示二者親緣關(guān)系較近. 中華絨螯蟹腸胞蟲與蝦肝腸胞蟲均為肝腸胞屬微孢子蟲, 中華絨螯蟹腸胞蟲可引起中華絨螯的白化、水化、肝胰腺消失等明顯癥狀[17], 與EHP感染對蝦癥狀具有明顯差異. 而蝦肝腸胞蟲與寄生于三疣梭子蟹的梭子蟹肌孢蟲[18]、引起眼斑龍蝦微孢子蟲病[19-20]的微孢子蟲、寄生于黃線狹鱈的微孢子蟲、宿主未明確的微孢子蟲[21-22]以及引起真鯛格留蟲病[23-24]的微孢子蟲18S rRNA遺傳距離較遠(yuǎn), 同源性較低, 進(jìn)一步證明18S rRNA可作為蝦肝腸胞蟲的主要鑒別序列. 國內(nèi)外蝦肝腸胞蟲18S rRNA序列分析結(jié)果顯示, 同一地區(qū)或國家蝦肝腸胞蟲有明顯的聚群現(xiàn)象, 大部分印度蝦肝腸胞蟲與中國蝦肝腸胞蟲(包括本實驗采樣地區(qū))聚集, 處于一個大分支. 但同一國家中由于地理位置差異, 也會導(dǎo)致蝦肝腸胞蟲的18S rRNA序列存在一定的種內(nèi)差異.

圖8 不同宿主微孢子蟲18S rRNA序列進(jìn)化樹分析

蝦肝腸胞蟲病尚無針對性治療藥物, 蝦場爆發(fā)后往往難以根治, 針對該病應(yīng)仍以早期預(yù)防為主. 寧波北侖、象山及浙江臺州地區(qū)蝦場集體爆發(fā)蝦肝腸胞蟲病, 根據(jù)序列分析顯示該感染病原有較高的同源性, 部分蝦肝腸胞蟲18S rRNA基因核苷酸序列同源性高達(dá)100%, 提示蝦肝腸胞蟲來源可能相同. 通過國內(nèi)外蝦肝腸胞蟲18S rRNA序列分析結(jié)果可知, 我國EHP與大部分印度EHP處于同一分支, 同源性較高, 因此本研究結(jié)果亦可為我國各地對蝦養(yǎng)殖場蝦肝腸胞蟲病的防控提供參考, 在引進(jìn)蝦苗時, 應(yīng)盡可能進(jìn)行蝦肝腸胞蟲抽樣檢測, 確定蝦苗未攜帶或感染蝦肝腸胞蟲病原后再進(jìn)行大規(guī)模養(yǎng)殖生產(chǎn).

[1] Stentiford G D, Feist S W, Stone D M, et al. Microsporidia: diverse, dynamic, and emergent pathogens in aquatic systems[J]. Trends in Parasitology, 2013, 29(11):567-578.

[2] Anderson I G, Shariff M, Nash G. A hepatopancreatic microsporidian in pond-reared tiger shrimp,, from Malaysia[J]. Journal of Invertebrate Pathology, 1989, 53(2):278-280.

[3] Tourtip S, Wongtripop S, Stentiford G D, et al.sp. nov. (Microsporida: Enterocytozoonidae), a parasite of the black tiger shrimp(Decapoda: Penaeidae): Fine structure and phylogenetic relationships[J]. Journal of Invertebrate Pathology, 2009, 102(1):21-29.

[4] Kasthuri Raju K. Haematological parameters as predictive indicators of stress induced mortality in Pacific White Shrimp(Boone, 1931) broodstock during transboundary shipment[J]. Indian Journal of Geo- Marine Sciences, 2017, 46(7):1440-1446.

[5] 胡吉卉, 李正民, 段健誠, 等. 蝦類肝腸胞蟲流行病學(xué)研究進(jìn)展[J]. 水產(chǎn)養(yǎng)殖, 2020, 41(11):1-4; 10.

[6] Aranguren L F, Han J E, Tang K F J.(EHP) is a risk factor for acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) and septic hepatopancreatic necrosis (SHPN) in the Pacific white shrimp[J]. Aquaculture, 2017, 471:37- 42.

[7] Aranguren Caro L F, Mai H N, Pichardo O, et al. Evidences supportingassociation with white feces syndrome in farmedin Venezuela and Indonesia[J]. Diseases of Aquatic Organisms, 2020, 141:71-78.

[8] Zhu B, Lu X D, Liu Y H, et al. Effects ofsingle-infection or co-infection with Vibrio parahaemolyticus on the hepatopancreas of[J]. Aquaculture, 2022, 549:737726.

[9] 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁業(yè)漁政管理局, 全國水產(chǎn)技術(shù)推廣總站, 中國水產(chǎn)學(xué)會. 2020中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒[M]. 北京:中國農(nóng)業(yè)出版社, 2020.

[10] Goldner J. A modification of the Masson trichrome technique for routine laboratory purposes[J]. The American Journal of Pathology, 1938, 14(2):237-243.

[11] 常曉晴. 蝦肝腸胞蟲病理學(xué)檢測技術(shù)的建立[D]. 上海:上海海洋大學(xué), 2018.

[12] Wang L J, Lv Q, He Y T, et al. Integrated qPCR and staining methods for detection and quantification ofin shrimp[J]. Microorganisms, 2020, 8(9):1366.

[13] Ding Z F, Chen J Q, Lin J, et al. Development ofhybridization and real-time PCR assays for the detection of, a microsporidian pathogen in the Chinese mitten crab[J]. Journal of Fish Diseases, 2017, 40(7):919-927.

[14] Ou Y L, Jiang W, Roellig D M, et al. Characterizations ofat new genetic loci reveal a lack of strict host specificity among common genotypes and the existence of a canine-adapted[J]. International Journal for Parasitology, 2021, 51(2/3): 215-223.

[15] Palenzuela O, Redondo M J, Cali A, et al. A new intranuclear microsporidium,n. sp., causing an emaciative syndrome in a piscine host (), prompts the redescription of the family Enterocytozoonidae[J]. International Journal for Parasitology, 2014, 44(3/4):189-203.

[16] 常曉晴, 王元, 英娜, 等. 8種染色方法對組織切片中蝦肝腸胞蟲染色效果的比較[J]. 海洋漁業(yè), 2019, 41(1): 91-99.

[17] 王元. 脊尾白蝦與三疣梭子蟹微孢子蟲病的病原和病理[D]. 上海: 上海海洋大學(xué), 2013.

[18] Wang Y, Li X C, Fu G H, et al. Morphology and phylogeny ofn. sp. (Microsporidia) infecting the swimming crabfrom China[J]. European Journal of Protistology, 2017, 61(Pt A):122-136.

[19] Small H J, Stentiford G D, Behringer D C, et al. Characterization of microsporidiansp. nov. infecting Caribbean spiny lobsters[J]. Diseases of Aquatic Organisms, 2019, 136(3):209- 218.

[20] Small H J, Meyer G R, Stentiford G D, et al.metacarcini sp. nov. (Microsporidia) infecting the muscles of dungeness crabsfrom British Columbia, Canada[J]. Diseases of Aquatic Organisms, 2014, 110(3):213-225.

[21] Liu X H, Wen M Q, Zhao Y L, et al. Morphological and molecular characterization of a new freshwater micro- sporidium,sp. n. (Microsporidia) infecting the coelomocytes of(Oligochaeta: Naididae) in China[J]. Journal of Invertebrate Pathology, 2020, 173:107368.

[22] Sokolova Y Y, Overstreet R M. A new microsporidium,n. g., n. sp., from the Riverine grass shrimp(Decapoda: Caridea: Palaemonidae)[J]. Journal of Invertebrate Pathology, 2018, 157:125-135.

[23] Abdel-Baki A A S, Tamihi A F, Al-Qahtani H A, et al.sp. nov. infectingin the red sea: Ultrastructure and phylogeny[J]. Diseases of Aquatic Organisms, 2015, 116(3):185-190.

[24] Azevedo C, Abdel-Baki A A S, Rocha S, et al. Ultrastructure and phylogeny ofn. sp. (Microsporidia), infecting the marine fishfrom the Red Sea[J]. European Journal of Protistology, 2016, 52:11-21.

Pathological characteristics of, 18S rRNA gene sequence and phylogenetic analysis

ZHOU Ying1, ZHU Bo1, QIAN Dong1, LU Xiandong2, LI Xiaobing1, LI Zheng1, LIU Yanhong2, CAI Huifeng3, WU Zhongning3, YUAN Siping3, ZHANG Chonghu4, YE Leping4, MA Rongrong1*

( 1.School of Marine Sciences, Ningbo University, Ningbo 315832, China; 2.Ningbo Ai Gene Technology Co., Ltd., Ningbo 315105, China; 3.Ningbo Yinzhou District Fishery Technology Management Service Station, Ningbo 315117, China; 4.Zhejiang Zhengda Livestock, Poultry and Aquatic Products Co., Ltd., Ningbo 315806, China )

Outbreaks of slow growth syndrome ofoccurredin some areas of Zhejiang Province. In the present study, pathological characteristics and molecular identification were determined to examine the pathogen causing slow growth syndrome ofin shrimp farms. The relationship was also investigated between this pathogen and the microsporidia from other regions and other host sources based on 18S rRNA gene sequence. The results show that all the shrimps with the disease were EHP positive, and the EHP 18S rRNA gene in the sampling area was high homology (98.5%-100%). The homology analysis of EHP gene sequences at home and abroad was 86.2%-100%. The collected EHP and Indian EHP were clustered into one branch. The sequence of EHP 18S rRNA gene was in different branches from that of other aquatic organisms, indicating that 18S rRNA could be used as the main identification sequence of EHP. The comparative analysis of EHPwithandshowed that the gene sequence homology of microsporidium was related to the degree of host evolution and development. The closer the evolutionary distance between hosts, the closer the gene sequence homology of microsporidium.

;; pathological characteristics; 18S rRNA; phylogenetic tree

S945.1

A

1001-5132（2022）02-0008-07

2021?09?13.

寧波大學(xué)學(xué)報（理工版）網(wǎng)址: http://journallg.nbu.edu.cn/

寧波市公益性計劃（202002N3062）; 三門縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局項目（三招采-2019-GK013號）.

周穎（1999－）, 女, 陜西銅川人, 在讀碩士研究生, 主要研究方向: 水生動物醫(yī)學(xué). E-mail: zy18700697409@163.com

馬榮榮（1990－）, 女, 山東菏澤人, 助理研究員, 主要研究方向: 水生動物醫(yī)學(xué). E-mail: marongrong@nbu.edu.cn

（責(zé)任編輯 韓 超）