曹紅妹,胡桂萍*,蔡 翔,石旭平,葉 川,王 豐,胡麗春,王亞威
(1.江西省蠶桑茶葉研究所,江西 南昌 330202;2.江西省經(jīng)濟作物研究所,江西 南昌 330202;3.江西省蠶桑工程技術(shù)研究中心,江西 南昌 330202)
桑葚又稱桑果、桑子等,是??坡淙~喬木桑(Morus alba L.)的成熟果實[1],其富含有機酸、糖分、游離氨基酸、礦物質(zhì)及微量元素[2],還含有豐富的花青素、蘆丁、白藜蘆醇等多種功能性成分。據(jù)《中國藥典》(2010年版一部),桑葚中藥材標準中記載其具有安神明目、滋陰補血、抗氧化、防癌抗癌等多種功效,被原國家衛(wèi)生部認定為“藥食同源”的農(nóng)產(chǎn)品之一[3]。當前,桑葚被開發(fā)加工成不同產(chǎn)品,包括桑葚果粉、桑葚汁、桑葚膏、桑葚果醋、桑葚酒、桑葚酸奶等[4-5],其中桑葚酸奶通過桑葚和酸奶共發(fā)酵制得,桑葚和酸奶均為大眾較喜愛的兩類健康飲品,其體系內(nèi)活性物質(zhì)豐富且氧化活性穩(wěn)定,因而桑葚酸奶產(chǎn)品兼具桑葚和酸奶的營養(yǎng)保健效果于一身,在大眾對多元化功能飲品高標準的需求形勢下,桑葚酸奶逐漸成為新寵,具有較高的研究價值和市場潛力[6]。
研究資料表明,桑葚中含有豐富的天然抗氧化組分,如多酚、黃酮等活性成分,在清除自由基、延防衰老等方面顯示出積極的作用[7]。在人體內(nèi),酚類物質(zhì)必須經(jīng)過消化吸收后才能作用于目標細胞或組織,發(fā)揮其有益作用[8]。但是,胃腸消化環(huán)境也會不同程度地對多酚類物質(zhì)的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響,同時改變其抗氧化活性[9]。如李亞等[10]研究表明藍莓經(jīng)模擬胃腸消化后其總黃酮、總多酚及ABTS+?自由基清除能力均高于消化前水平,而花色苷含量則變化不大;趙永波等[9]研究藍莓酸奶在消化過程中酸奶中多酚類物質(zhì)的穩(wěn)定性及抗氧化活性時,得出藍莓酸奶經(jīng)胃腸消化后其多酚類物質(zhì)被釋放、抗氧化活性增強的結(jié)論,具體表現(xiàn)為消化前,藍莓酸奶的各項指標均低于藍莓果料;體外消化后,除了藍莓酸奶的DPPH?自由基清除能力和總黃酮含量低于藍莓果料外,總抗氧化、總酚、花色苷含量以及ABTS+?清除能力均高于藍莓果料。
食物中酚類物質(zhì)的穩(wěn)定性是決定其抗氧化活性和吸收利用的關(guān)鍵前提[11]。有研究表明,體外消化法可在生理條件下通過模仿體內(nèi)環(huán)境pH值、鹽的種類與濃度、消化酶的作用、消化時間和溫度等因素,模擬食物的消化過程,該方法在食品科學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛的研究與應(yīng)用[8]。而桑葚酸奶體系內(nèi)酚類物質(zhì)穩(wěn)定性及抗氧化活性受消化過程的影響程度尚未見報道。因此,本試驗以桑葚酸奶、桑葚原汁和酸奶為研究對象,建立口腔、胃、腸體外模擬消化模型,研究消化對各樣品酚類物質(zhì)的穩(wěn)定性及抗氧化活性的影響,以期為桑葚酸奶在營養(yǎng)功能食品中的推廣應(yīng)用提供基礎(chǔ)依據(jù)。
速凍桑葚由江西省蠶桑茶葉研究所的蠶桑課題組提供;脫脂乳為市售蒙牛品牌脫脂乳;酸奶發(fā)酵劑為直投式酸奶發(fā)酵劑[嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌(德氏乳桿菌保加利亞亞種)],由北京川秀科技有限公司提供;蔗糖和果膠為市售食品級;α-淀粉酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、DPPH?、ABTS+?等為美國Sigma公司產(chǎn)品;牛膽鹽產(chǎn)自國藥集團化學(xué)試劑有限公司;抗壞血酸Vc(純度99.7%)、沒食子酸(純度99%)產(chǎn)自天津市光復(fù)精細化工研究所;蘆?。兌?5%) 產(chǎn)自上海金穗生物科技有限公司;福林酚試劑產(chǎn)自北京索萊寶科技有限公司;甲醇、冰乙酸、十二烷基磺酸鈉(SDS)、無水乙酸、鹽酸、亞硝酸鈉、碳酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、氯化鉀、無水乙酸鈉、鐵氰化鉀、三氯化鐵等均為國產(chǎn)分析純。
Varioskan LUX多功能酶標儀(賽默飛世爾科技公司);快速漩渦混勻器(金壇市中大儀器廠);GL-21M高速冷凍離心機(Thermo scientific公司);FA2004電子分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司);FE20實驗室pH計[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司];XMTD-204數(shù)顯恒溫水浴箱(上海比朗儀器有限公司);hz-82震蕩型數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇新航有限公司)。
1.3.1 樣品的制備 (1)桑葚果汁的制備:參考?cibisz等[12]的方法并略有改動。將速凍桑葚(60%)、蔗糖(35%)、變性淀粉(2%)、水(2.4%)和果膠(0.6%)混勻并倒入料理機磨漿,經(jīng)過80目細紗網(wǎng)過濾果柄和果渣后獲得原汁桑葚果汁,再使用100 mL旋蓋玻璃瓶灌裝好,進行殺菌(85 ℃、15 min)處理,待冷卻后置于4 ℃冰箱冷藏備用。
(2)酸奶制備:參考Trigueros等[13]方法并略有改動。脫脂乳和蔗糖按照100∶5的比例加入蔗糖,隨后攪拌均勻至蔗糖全部融化,再將其進行殺菌(85 ℃、15 min)處理,待冷卻至30 ℃后按照5%的接種量加入酸奶發(fā)酵劑,37 ℃條件下黑暗恒溫發(fā)酵約24 h,至pH值低于4.7后終止發(fā)酵,冷卻至室溫,保存?zhèn)溆谩?/p>
(3)桑葚酸奶的制備:參考胡桂萍[14]的方法并略有改動,將桑葚果汁和(2)中制備的酸奶以1∶4比例混合,在無菌條件下混勻并灌裝于滅菌玻璃瓶中,獲得桑葚酸奶成品。
試驗設(shè)置2組樣品,1組為試驗組,另1組為對照組,各組樣品包括等質(zhì)等量的桑葚酸奶(20%桑葚果汁+80%酸奶)、桑葚果汁(20%桑果汁+80%去離子水)和酸奶(20%去離子水+80%酸奶),各組樣品分別設(shè)置3個重復(fù);將兩組試驗樣品放在完全相同的貯藏條件下貯藏48 h后,對試驗組和對照組各樣品進行體外模擬消化試驗。
1.3.2 模擬消化 體外連續(xù)模擬消化試驗參考Oliveira等[15]的方法并略有改動。分別稱取各個試驗消化樣品10 g置于不同的50 mL離心管中,依次加入0.9%的NaCl溶液10 mL進行稀釋處理,同時調(diào)節(jié)消化樣品溶液pH值分別進行模擬口腔(1 min)、胃(1 h)和腸(2 h)的消化。
1.3.2.1 模擬口腔消化 試驗組:先將α-淀粉酶溶于1 mmol/L CaCl2溶液,酶活力為100 U/mL制成模擬唾液待用,再調(diào)整各試驗消化樣品的pH值為6.0(使用1 mol/L NaHCO3溶液),最后將0.3 mL模擬唾液添加至pH值為6.0的各試驗消化樣品中,在37 ℃、200 r/min條件下消化1 min,用冰水浴冷卻結(jié)束反應(yīng)。
對照組:調(diào)整各試驗消化樣品的pH值為6.0(使用1 mol/L NaHCO3溶液)后,用1 mmol/L CaCl20.3 mL替代模擬唾液,其他處理同上。
1.3.2.2 模擬胃消化 試驗組:將250 mg胃蛋白酶溶于10 mL 0.1 mol/L HCl中制成模擬胃液,再使用1 mol/L HCl溶液調(diào)整各組模擬口腔消化后樣品的pH值至2.0,然后在pH值為2.0的各試驗消化樣品中添加模擬胃液,添加比例為0.05 mL/g消化樣,在37 ℃、100 r/min條件下分別消化0、30、60 min,冰水浴冷卻以終止反應(yīng)。
對照組:使用1 mol/L HCl溶液調(diào)整各組模擬口腔消化后樣品的pH值至2.0后,用0.1 mol/L HCl替代模擬胃液,其他處理同上。
1.3.2.3 模擬腸消化 試驗組:將40 mg胰蛋白酶和250 mg牛膽鹽溶于10 mL 0.1 mol/L NaHCO3制成模擬腸液,再調(diào)整各組模擬口腔和胃消化后樣品的pH值至6.0(使用1 mol/L NaHCO3溶液),然后在pH值為6.0的各試驗消化樣品中添加模擬腸液,添加比例為0.125 mL/g消化樣,在37 ℃、100 r/min條件下分別消化0、60、120 min,冰水浴冷卻終止反應(yīng)。
對照組:使用1 mol/L NaHCO3溶液調(diào)整各組模擬口腔和胃消化后樣品的pH值至6.0,用0.1 mol/L的NaHCO3溶液替代模擬腸液,其他同上。
1.3.3 各樣品提取液的制備 經(jīng)消化試驗后,各樣品提取液的制備參考Cebeci等[16]方法并略有改動。取桑葚酸奶10 g置于50 mL的離心管中,加15 mL含0.05 mL濃鹽酸的酸化甲醇,先12000 r/min離心機提取1 min,再-20 ℃靜置1 h使蛋白充分沉淀后,在4℃、7000 r/min條件下離心10 min,取上清液用于多酚類物質(zhì)含量和體外抗氧化活性測定。
1.3.4 酚類物質(zhì)含量的測定 總多酚含量的測定采用福林-酚法[13],以沒食子酸標準品作曲線計算多酚的含量(y= 6.17151x+0.0408342,R2=0.999,單位:mg/100 g);總黃酮含量的測定參考蔡萌等[17]的方法,以蘆丁為標準曲線計算黃酮含量(y=0.585034x-0.0144429,R2=0.999,單位:mg/100 g)。
1.3.5 抗氧化活性的測定 ABTS+?清除能力的測定參考Re等[18]的方法(標準曲線y=0.009x+0.076,R2=0.992);DPPH自由基清除能力的測定參考Shen Y B等[19]方法(標準曲線y=2.460x-0.230,R2=0.993);總抗氧化活力的測定參考Berker等[20]方法(標準曲 線y= 5.33653x+0.00988779,R2=0.999),均 以Vc(0.025~0.120 mg/mL)為標準品作標準曲線,結(jié)果用每百克干樣品中Vc當量表示(mg/100 g)。
用Sigmaplot 12.5軟件作圖;用SPSS Statistics 17.0軟件進行數(shù)據(jù)分析,用Duncan檢驗進行數(shù)據(jù)的顯著性分析,P<0.05表示差異顯著;用Microsoft Excel(2016版)軟件分析數(shù)據(jù)的相關(guān)性。
由表1可知,相對于消化前,模擬口腔消化過程,試驗組和對照組各樣品的總多酚含量無顯著影響(P>0.05),模擬胃腸消化均可促進樣品總多酚物質(zhì)的釋放。試驗組消化前桑葚酸奶、桑葚果汁和酸奶的總多酚含量分別為53.73、35.46、7.91 mg/100 g。模擬胃消化過程中,試驗組桑葚酸奶的總多酚含量在60 min結(jié)束時各樣品的總酚含量較消化前的含量分別提高了176.47%、95.48%、49.18%(P<0.05),顯著高于桑葚果汁和酸奶。對照組中各樣品的總酚含量呈現(xiàn)不同的變化趨勢,其含量在胃消化結(jié)束時較消化前分別提高了23.88%、降低了1.58%、降低了19.60%(P>0.05),變化幅度均低于試驗組。模擬腸消化過程中,試驗組較對照組變化更明顯:試驗組桑葚酸奶和桑葚果汁均在腸消化60 min時達到最高值,分別為185.02、84.19、15.46 mg/100 g,且到120 min結(jié)束時各樣品的總酚含量較消化前的含量分別提高了216.38%、102.31%、94.55%(P<0.05);對照組中各樣品的總多酚含量保持在相對穩(wěn)定水平,相較消化前,腸消化結(jié)束時總多酚含量分別提高了14.24%、降低了5.10%、降低了43.23%(P>0.05)。
由表2結(jié)果可知,相對于消化前,模擬口腔過程,試驗組和對照組各樣品的總多酚無顯著影響(P>0.05),模擬胃消化能夠促進黃酮物質(zhì)的釋放,總黃酮物質(zhì)在模擬腸消化環(huán)境中較為穩(wěn)定,并且桑葚酸奶的總黃酮含量高于桑葚果汁和酸奶。試驗組中消化前桑葚酸奶、桑葚果汁和酸奶的總黃酮含量分別為56.86、65.97、11.83 mg/100 g。模擬胃消化過程中,試驗組桑葚酸奶的總黃酮含量均超過桑葚果汁和酸奶,且在60 min時桑葚酸奶的總黃酮含量較消化前的含量提高比例最高,為70.64%。對照組中各樣品的總黃酮含量均保持在相對穩(wěn)定水平,胃消化結(jié)束時各樣品的總黃酮含量較消化前的含量分別提高了10.22%、3.94%、降低了4.73%(P>0.05),提升幅度均低于試驗組。模擬腸消化過程中,試驗組桑葚酸奶總黃酮含量在60 min時達到最大值,為117.79 mg/100 g,60~120 min趨于平穩(wěn),桑葚果汁和酸奶在腸消化過程中總黃酮物質(zhì)含量均保持在相對穩(wěn)定水平,腸消化結(jié)束時較消化前,3種樣品總黃酮含量分別提高了105.03%、14.36%、16.65%(P<0.05);對照組中各樣品的總黃酮含量保持在相對穩(wěn)定水平,腸消化結(jié)束時各樣品的總黃酮含量較消化前的含量分別提高了15.27%、4.49%、降低了1.69%(P>0.05),提升幅度均低于試驗組。
表2 體外消化處理對各樣品總黃酮含量的影響
由圖1可以看出,模擬胃腸消化可有效促進桑葚酸奶和桑葚果汁總抗氧化活性成分的釋放。消化前桑葚酸奶、桑葚果汁和酸奶的總抗氧化活力 分 別 為67.55、52.21、13.06 mg/100 g,經(jīng) 模 擬口腔消化,各樣品的總抗氧化活力與消化前無顯著差異(P>0.05)。在模擬胃消化過程中,試驗組桑葚酸奶在30~60 min的總抗氧化活力值和增幅均反超桑葚果汁,在60 min結(jié)束時各樣品的總抗氧化活力較消化前分別提高了55.47%、94.99%、57.83%(P<0.05)。對照組中各樣品的總抗氧化活力略呈下降趨勢并保持在相對穩(wěn)定水平,胃消化結(jié)束時僅桑葚果汁的總抗氧化活力較消化前提高了6.34%,而其他樣品均呈現(xiàn)下降趨勢(P>0.05),變化幅度均低于試驗組。在模擬腸消化過程中,試驗組桑葚酸奶總抗氧化活力在60 min時達到最大值為113.56 mg/100 g,60~120 min時略微下降,桑葚果汁和酸奶在腸消化過程中總抗氧化活力均略呈下降趨勢并保持在相對穩(wěn)定水平,腸消化結(jié)束時較消化前含量分別提高了44.24%、74.68%、7.54%(P<0.05)。對照組中各樣品的總抗氧化活力保持在相對穩(wěn)定水平,腸消化結(jié)束時各樣品的總抗氧化活力較消化前的分別降低了4.84%、提高了3.73%和降低了9.73%(P>0.05),提升幅度均低于試驗組。
圖1 體外消化處理對各樣品總抗氧化能力的影響
由圖2可以看出,模擬胃腸消化均可促進各樣品ABTS+?自由基清除能力的釋放,但是腸消化的釋放能力弱于胃消化過程,口腔消化對各樣品的ABTS+?自由基清除能力無顯著影響(P>0.05)。在消化前桑葚酸奶、桑葚果汁和酸奶的ABTS+?自由基清除能力分別為57.68、75.57、9.22 mg/100 g。在模擬胃消化過程中,試驗組桑葚酸奶的ABTS+?自由基清除能力在0~60 min均持續(xù)顯著提高(P<0.05),至60 min時達到最高值為123.27 mg /100 g,提高的百分率最高,為113.70%(P<0.05)。對照組中各樣品的ABTS+?自由基清除能力保持在相對穩(wěn)定水平,胃消化結(jié)束時各樣品的ABTS+?自由基清除能力較消化前的含量分別提高了7.35%、10.57%、27.19%(P>0.05),提升幅度均低于試驗組。在模擬腸消化過程中,試驗組各樣品的ABTS+?自由基清除能力均呈現(xiàn)下降變化,腸消化結(jié)束時較消化前ABTS+?自由基清除能力分別提高了42.73%、30.73%、2.96%(P<0.05);對 照 組 中 各 樣 品 的ABTS+?自由基清除能力保持在相對穩(wěn)定水平,腸消化結(jié)束時各樣品的ABTS+?自由基清除能力較消化前分別提高了2.77%、6.09%、0.31%(P>0.05),提升幅度均低于試驗組。
圖2 體外消化處理對各樣品ABTS+?自由基清除能力的影響
由圖3可以看出,模擬胃腸消化均可促進各樣品DPPH?自由基清除能力的釋放,釋放能力表現(xiàn)為胃消化過程強于腸消化過程,模擬口腔1 min對各樣品的DPPH?自由基除能力無顯著影響(P>0.05)。試驗組在消化前桑葚酸奶、桑葚果汁和酸奶的DPPH?自由基清除能力分別為44.61、62.57、6.29 mg/100 g。在模擬胃消化過程中,桑葚酸奶DPPH?自由基清除能力在0~60 min持續(xù)顯著升高(P<0.05),并在30~60 min過程中超過在桑葚果汁的DPPH?自由基清除能力,60 min時達到最高值為86.11 mg/100 g;胃消化結(jié)束時各樣品的DPPH?自由基清除能力較消化前分別提高了93.03%、17.30%、173.69%(P<0.05)。對照組中各樣品的DPPH?自由基清除能力保持在相對穩(wěn)定水平,胃消化結(jié)束時各樣品的DPPH?自由基清除能力較消化前的含量分別提高了11.16%、6.76%、0.89%(P>0.05),提升幅度均低于試驗組。在模擬腸消化過程中,試驗組各樣品的DPPH?自由基清除能力均呈現(xiàn)下降變化,桑葚酸奶的減弱速度最慢,且僅桑葚酸奶在腸消化結(jié)束時較消化前DPPH?自由基清除能力提高了22.49%(P<0.05),桑葚果汁和酸奶的分別下降了30.54%、15.59%(P<0.05)。對照組中各樣品的DPPH?自由基清除能力保持在相對穩(wěn)定水平但均呈現(xiàn)下降變化,腸消化結(jié)束時各樣品的DPPH?自由基清除能力較消化前分別下降了10.07%、1.44%、1.86%(P>0.05),提升幅度均低于試驗組。
圖3 體外消化處理對各樣品DPPH?自由基清除能力的影響
由表3可知,桑葚酸奶的總多酚和總黃酮與總抗氧化活力呈極顯著相關(guān)(P<0.01),相關(guān)系數(shù)分別為0.962和0.891;桑葚酸奶的總多酚和總黃酮與ABTS+?自由基清除能力、DPPH?自由基清除能力的相關(guān)性系數(shù)在0.202~0.479范圍內(nèi),無顯著相關(guān)性(P>0.05)。桑葚果汁的總多酚與總抗氧化活力呈顯著相關(guān)性(P<0.05),總黃酮與DPPH?自由基清除能力的相關(guān)性系數(shù)為-0.09,呈現(xiàn)負相關(guān)性,其余則無顯著相關(guān)性(P>0.05)。酸奶的總多酚、總黃酮與總抗氧化活力、ABTS+?自由基清除能力的相關(guān)系數(shù)在0.093~0.538,無顯著相關(guān)性(P>0.05);酸奶的總多酚、總黃酮與DPPH?自由基清除能力的相關(guān)系數(shù)則分別為-0.433和-0.218,呈現(xiàn)負相關(guān)性。因此,桑葚酸奶總多酚和總黃酮與總抗氧化活力密切相關(guān),是其主要抗氧化活性成分;桑葚果汁總多酚與總抗氧化活力密切相關(guān),是其主要抗氧化活性成分。
表3 各樣品中多酚類物質(zhì)及抗氧化活性的相關(guān)性分析
以桑葚為原料制成的酸奶,不僅提高了酸奶制品的風(fēng)味,還更具抗氧化、調(diào)節(jié)機體免疫力、預(yù)防心血管疾病、降低膽固醇、增加鈣元素吸收、促進腸胃消化等多種生理功能[7]。本研究結(jié)果顯示:桑葚酸奶中酚類物質(zhì)在模擬體外消化過程中穩(wěn)定性好,且經(jīng)過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),桑葚酸奶的總多酚和總黃酮與總抗氧化活力呈極顯著相關(guān)性(P<0.01),相關(guān)系數(shù)分別為0.962和0.891,表明桑葚酸奶總多酚和總黃酮與總抗氧化活力密切相關(guān),是其主要抗氧化活性成分。
本研究結(jié)果與封易成等[21]的研究的結(jié)果基本保持一致,即胃消化可促進抗氧化活性物質(zhì)的釋放且酚類物質(zhì)穩(wěn)定性好,腸消化對酚類物質(zhì)和抗氧化活性物質(zhì)的釋放作用逐漸減弱。具體表現(xiàn)為,模擬胃消化過程中試驗組桑葚酸奶相較于消化前和對照組,總多酚、總黃酮、總抗氧化、ABTS+?自由基清除能力及DPPH?自由基清除能力均顯著提升(P<0.05),表明模擬胃消化能夠促進各樣品中酚類物質(zhì)的釋放,并且桑葚酸奶和桑葚果汁的總酚含量均高于藍莓果汁,可能是由于在胃酸和胃蛋白酶的作用下,有利于酚類物質(zhì)從果膠、蛋白等交聯(lián)作用中釋放,并從結(jié)合態(tài)轉(zhuǎn)化為游離態(tài)[22];模擬腸消化過程中試驗組桑葚酸奶的酚類物質(zhì)與抗氧化活性物質(zhì)含量均高于消化前和對照組含量,可能是由于到達腸消化過程時桑葚酚類物質(zhì)部分發(fā)生降解,桑葚酸奶中的乳鐵蛋白在胰蛋白作用下進一步水解并釋放水溶性蛋白,或者酸奶基質(zhì)促進了桑葚酚類物質(zhì)的釋放,彌補了桑葚多酚的損失,促使腸消化過程酚類物質(zhì)含量仍保持較高水平[23],但總多酚、總黃酮和總抗氧化活力在腸消化過程中均呈現(xiàn)先升高后下降的變化,ABTS+?自由基清除能力及DPPH?自由基清除能力在腸消化過程中均呈現(xiàn)持續(xù)下降的變化,可能是由于腸道中的胰蛋白酶對桑葚酸奶中的酚類物質(zhì)和抗氧化活性物質(zhì)的釋放作用逐漸減小,甚至在腸消化中后期會降低桑葚酸奶中的酚類物質(zhì)和抗氧化活性物質(zhì)的含量。
因此,體外模擬消化處理可明顯影響桑葚酸奶中酚類物質(zhì)的穩(wěn)定性及其抗氧化活性,且胃腸環(huán)境對其影響較大。這可能與胃蛋白酶、胰蛋白酶、牛膽鹽及胃腸環(huán)境pH值的變化產(chǎn)生的直接或間接影響有關(guān)[24]。若要實現(xiàn)桑葚酸奶在營養(yǎng)功能食品中的推廣應(yīng)用,還需對桑葚酸奶的代謝途徑、生物利用率等相關(guān)機理開展進一步探究。