云南地方稻耐低鉀種質(zhì)資源的篩選和評價(jià)

唐海浪，程在全，羅 瓊*，鐘巧芳*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所/云南省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)試驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部 西南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)試驗(yàn)室，云南 昆明 650205）

鉀是植物生長發(fā)育必需的三大營養(yǎng)元素之一，與植物的各種代謝密切相關(guān)，在作物的生長、產(chǎn)量、品質(zhì)和抗逆性等方面具有重要作用［1－3］。水稻（Oryza sativa L.）是我國重要的糧食作物之一，60%的人口以稻米為主食。水稻生長所需的鉀營養(yǎng)主要來自土壤，而我國1/4~1/3的耕地土壤處于缺鉀或嚴(yán)重缺鉀狀態(tài)，在南方稻區(qū)土壤缺鉀尤為嚴(yán)重。我國鉀資源匱乏，鉀肥年產(chǎn)量少，所需的大量鉀肥主要依靠進(jìn)口［4］。為了保證水稻的高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)，生產(chǎn)者長期偏重施用鉀肥。鉀肥的長期大量增施，不僅造成生產(chǎn)成本增加、肥料利用率降低、土壤肥力下降，而且還帶來稻米品質(zhì)下降、環(huán)境污染等一系列問題［5－7］。充分利用我國豐富的水稻種質(zhì)資源，發(fā)掘水稻自身的遺傳潛力，培育耐低鉀水稻品種是解決我國鉀資源短缺等問題，促進(jìn)水稻生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展的有效途徑［8－10］。優(yōu)異耐低鉀水稻資源的發(fā)掘是水稻鉀高效育種的關(guān)鍵和基礎(chǔ)。大量研究表明，不同基因型水稻的鉀素吸收利用能力存在明顯差異［11-14］，且這種能力是受遺傳控制的數(shù)量性狀［15-18］。已有研究表明，耐低鉀基因型對低鉀脅迫具有較強(qiáng)的耐性，能夠保持較強(qiáng)的生長勢、較高的鉀吸收和利用效率，而且能夠獲得較高的產(chǎn)量。目前在鉀高效水稻種質(zhì)資源篩選、耐低鉀遺傳機(jī)制、QTL定位及相關(guān)基因等方面已取得較好的進(jìn)展。劉國棟等利用水培法對86種不同秈稻材料進(jìn)行了篩選比較，發(fā)現(xiàn)其吸鉀速率、生物量和鉀素利用效率的基因型差異十分顯著，吸鉀速率的基因型差異可達(dá)1倍［19］。張寧等利用2個(gè)不同供鉀濃度的水培試驗(yàn)，以相對耐低鉀指數(shù)為評價(jià)指標(biāo)，篩選出2個(gè)耐低鉀水稻品種、6個(gè)中等耐低鉀水稻品種和1個(gè)鉀敏感品種［20］。王廣洋等利用水培法對257份水稻種質(zhì)進(jìn)行了篩選比較，發(fā)現(xiàn)供試水稻種質(zhì)在低鉀耐性上存在顯著差異，并從中篩選出8個(gè)耐低鉀品種［21］。陳璇利用混池分組分析法對由20個(gè)耐低鉀植株和20個(gè)不耐低鉀植株分別混合成的2個(gè)樣本池及親本進(jìn)行全基因組重測序，通過對候選的36個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行功能注釋，找到了2個(gè)可能在低鉀條件下參與水稻鉀離子吸收或轉(zhuǎn)運(yùn)的耐低鉀候選基因OsHAK3和OsNAC25［22］。Venkata等利用IL群體檢測到3個(gè)鉀離子濃度的QTL和4個(gè)相對莖葉鉀含量的QTL，可解釋表型變異的5.84%~14.80%［15］。羅曦等根據(jù)綜合指數(shù)從159份遺傳差異較大的水稻品種中篩選出18份耐低鉀和10份低鉀敏感的水稻品種。利用耐低鉀水稻品種臺農(nóng)67和低鉀敏感品種制西構(gòu)建重組自交系，共檢測到27個(gè)耐低鉀相關(guān)性狀的QTL，其LOD值為2.52~9.23，可解釋表型變異的2.22%~7.25%，其中貢獻(xiàn)率最高的QTL是qKC-2，該QTL定位在水稻2號染色體上，可能是1個(gè)控制水稻鉀含量的未知基因［18］。有關(guān)不同水稻基因型鉀素營養(yǎng)效率的差異，國內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)進(jìn)行了大量研究，但目前對水稻鉀高效基因型還沒有統(tǒng)一的篩選指標(biāo)和可靠的評價(jià)體系。傳統(tǒng)的研究多以大田成熟期產(chǎn)量作為評定品種耐低鉀的主要標(biāo)準(zhǔn)，但明顯存在周期長、費(fèi)工費(fèi)時(shí)、不易重復(fù)等缺點(diǎn)；相比之下，苗期鑒定具有耗時(shí)短、容量大、重復(fù)性強(qiáng)、易于活體鑒定和環(huán)境影響小等優(yōu)點(diǎn)［10，18，20－21，23］。因此，選擇合適的苗期篩選指標(biāo)，建立科學(xué)、快速、有效的苗期耐低鉀基因型鑒定方法，對大量的鉀高效基因型篩選工作具有重要的意義。云南是世界上最大的稻種遺傳生態(tài)多樣性中心之一，分布了大量豐富多樣的地方特色水稻品種資源。這些資源具有許多優(yōu)良的遺傳特性及其控制基因，是寶貴的基因庫，從中發(fā)掘優(yōu)異耐低鉀種質(zhì)資源的可能性非常大［24-27］。鑒于此，本研究采用水培法對已進(jìn)行大田抗病性鑒定的84份云南地方稻種質(zhì)材料進(jìn)行了耐低鉀篩選和評價(jià)，并獲得了一些優(yōu)異的耐低鉀水稻資源材料，可為耐低鉀水稻種質(zhì)創(chuàng)新和耐低鉀水稻優(yōu)良品種培育提供優(yōu)良的材料，同時(shí)為水稻耐低鉀基因的發(fā)掘以及水稻耐低鉀機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

前期經(jīng)大田抗病性鑒定挑選出的具有較好抗病能力的84份云南地方稻種質(zhì)材料（表1），由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物種質(zhì)庫提供。

表1 供試的84份云南地方稻種質(zhì)材料信息

1.2 水稻苗的水培培養(yǎng)

水培營養(yǎng)液參照國際水稻所的水培配方（稍作改良）［23］，配制成除K+濃度不同，其余成分完全相同的完全營養(yǎng)液和低鉀營養(yǎng)液，調(diào)節(jié)pH值至5.5～5.8。將不同基因型的水稻種子分別取50粒，加入3%的過氧化氫溶液滅菌消毒30 min，再用滅菌蒸餾水洗5~8次，然后轉(zhuǎn)入滅菌的組培瓶內(nèi)，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)2~3 d，直至水稻露白。隨后在28 ℃下光照培養(yǎng)8~10 d，待水稻苗生長至2葉期時(shí)，從中選取長勢一致的水稻苗，去其胚乳，采用根朝下、芽朝上的方式將其移入去底的潔凈96孔PCR板中，在蒸餾水中過渡水培3~5 d，然后將其轉(zhuǎn)入完全營養(yǎng)液或低鉀營養(yǎng)液中培養(yǎng)，每3 d更換1次營養(yǎng)液，直至水稻苗生長至5葉期。每個(gè)水稻材料設(shè)置8個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 最適宜低鉀脅迫濃度的確定

隨機(jī)選取8個(gè)不同的水稻材料，按上述方法進(jìn)行水培培養(yǎng)，在2葉期時(shí)分別將其移入0、0.5、1、2、3、4、5、10、20、40 mg/L共10個(gè)不同的鉀離子濃度營養(yǎng)液中，在28 ℃條件下，每天光照培養(yǎng)16 h，暗培養(yǎng)8 h；待培養(yǎng)至5葉期時(shí)，觀察植株的生長情況和缺鉀癥狀，并測量每份材料的根長、株高、鮮重，干重等指標(biāo)，篩選出最適宜的低鉀脅迫濃度。

1.4 植株耐低鉀能力相關(guān)指標(biāo)的測定

將待篩選的84份地方稻資源同時(shí)置于低鉀營養(yǎng)液和完全營養(yǎng)液雙濃度水培液中，將其培養(yǎng)至5葉期。在培養(yǎng)過程中，注意觀察水稻的生長發(fā)育情況和缺鉀癥狀。待生長至5葉期時(shí)，測量植株單株的根長、株高、地上部鮮重、地上部干重等性狀指標(biāo)。在測量植株鮮重后，收集植株地上部，將其置于烘箱（105 ℃）中殺青10 min，然后在80 ℃下烘至恒重，最后稱重。

1.5 耐低鉀品種的綜合評價(jià)

計(jì)算不同基因型水稻幼苗各性狀的相對耐性指數(shù)（低鉀脅迫下的測定值/正常供鉀下的測定值）。采用平均分配權(quán)重法，選擇根長、株高、鮮重、地上部干重這4個(gè)苗期主要性狀的相對耐性指數(shù)，計(jì)算耐低鉀綜合指數(shù)（SYI），SYI=同品種4個(gè)性狀的相對耐性指數(shù)之和/4。再根據(jù)耐低鉀綜合指數(shù)，按照表2中的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，對各水稻材料苗期的耐低鉀能力進(jìn)行綜合評價(jià)，最終篩選出較優(yōu)異的耐低鉀水稻品種。

表2 水稻苗期耐低鉀綜合指數(shù)的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié)果與分析

2.1 最適宜低鉀脅迫濃度的確定

8個(gè)地方稻材料在不同K+濃度處理下的5葉期生長情況如圖1所示，在0~2 mg/L K+濃度范圍內(nèi)，隨著K+濃度升高，植株生長越旺盛，株高增高，葉片變綠，缺鉀癥狀越少，根系越發(fā)達(dá)。當(dāng)K+濃度為2 mg/L時(shí)，水稻生長發(fā)育狀況明顯得到改善，葉片無缺鉀癥狀，根系比較發(fā)達(dá)。當(dāng)K+濃度繼續(xù)升高至3~20 mg/L范圍時(shí)，與完全營養(yǎng)液下的水稻相比，水稻的生長發(fā)育（如株高和根長等）反而受到了不同程度的抑制，葉尖變黃，植株變矮，出現(xiàn)缺鉀癥狀。

圖1 部分地方稻材料在不同K+濃度水培液中的生長情況

不同K+濃度處理對8個(gè)地方稻材料株高、根長、鮮重、干重等性狀的影響如表3所示，在不同K+濃度處理下，8個(gè)材料的株高、根長、鮮重、干重有顯著差異。當(dāng)K+濃度為2 mg/L時(shí)，株高、根長、鮮重、干重這4個(gè)性狀均顯著升高，8個(gè)材料的生長狀態(tài)和性狀值最接近完全培養(yǎng)條件下的。因此確定以2 mg/L作為水稻苗期耐低鉀篩選的最佳低鉀脅迫濃度。

表3 不同K+濃度處理對水稻苗期株高、根長、鮮重、干重的影響

2.2 不同水稻基因型的苗期耐低鉀相關(guān)性狀差異

在2種不同鉀濃度營養(yǎng)液中，5葉期不同水稻材料間的生長發(fā)育情況出現(xiàn)了明顯差異（圖2）。在低鉀培養(yǎng)液中，不耐低鉀水稻出現(xiàn)明顯的缺鉀癥狀，植株矮小，葉片發(fā)黃，出現(xiàn)褐斑，根系細(xì)弱，逐漸枯死。耐低鉀水稻的生長狀態(tài)接近于完全營養(yǎng)液中的，直至5葉期時(shí)生長發(fā)育仍良好，根系發(fā)達(dá)，缺鉀癥狀不明顯（圖3）。

圖2 在2種K+濃度下部分地方稻材料在5葉期的生長情況

圖3 在低鉀（2 mg/L）脅迫下不同材料在5葉期的根系和株高表現(xiàn)

在2種鉀濃度處理下，5葉期水稻株高、根長、鮮重和干重的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和方差分析結(jié)果如表4所示，發(fā)現(xiàn)株高、根長、鮮重和干重這4個(gè)性狀在不同K+濃度處理和不同基因型間均存在顯著差異。

表4 在兩種鉀濃度下水稻苗期耐低鉀相關(guān)性狀的差異

2.3 不同基因型水稻苗期耐低鉀性狀的相對耐性指數(shù)差異及相關(guān)性分析

為了消除不同水稻基因型之間的生物學(xué)特性差異，引入相對耐性指數(shù)（R）作為鉀高效水稻種質(zhì)篩選的相對指標(biāo)。在2種鉀濃度處理下，株高、根長、地上部鮮重和地上部干重這4個(gè)苗期性狀的相對耐性指數(shù)如表5所示。從表5可以看出：在4個(gè)性狀中，地上部鮮重和地上部干重的相對耐性指數(shù)都較小，平均值分別為68.27%和70.09%；株高和根長的相對耐性指數(shù)均較大，平均值分別為91.70%和115.88%。這說明地上部鮮重和地上部干重對低鉀脅迫較敏感，遺傳力??；株高和根長對低鉀脅迫不敏感，遺傳力大。從變異系數(shù)可知，株高、根長、地上部鮮重和地上部干重的相對耐性指數(shù)的變異都比較大。

表5 在2種鉀濃度處理下水稻苗期性狀的相對耐性指數(shù)

在2種鉀濃度處理下，84份地方稻苗期相對株高、相對根長、地上部相對鮮重和地上部相對干重的分布頻數(shù)如圖4所示。從圖4中可以看出，在低鉀處理下水稻的株高、根長、地上部鮮重和地上部干重均明顯低于正常處理下的。具體來說，相對株高的范圍為34.83%～175.64%，主要分布在60%～90%，均值為91.70%；相對根長的范圍為57.23%～281.63%，主要分布在65%～150%，均值為115.88%；地上部相對鮮重的范圍為25.22%～130.50%，主要分布在35%～110%，均值為68.27%；地上部相對干重的范圍為23.28%～121.00%，主要分布在50%～95%，均值為70.09%。

圖4 84份地方稻苗期耐低鉀性狀的相對耐性指數(shù)的分布頻率

各性狀相對耐性指數(shù)之間的相關(guān)性分析結(jié)果如表6所示，結(jié)果表明：株高與根長、地上部鮮重和地上部干重均呈顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.402、0.395和0.420。

表6 各性狀相對耐性指數(shù)之間的相關(guān)系數(shù)

2.4 耐低鉀品種的綜合評價(jià)

在2種鉀濃度處理下，84份地方稻苗期株高、根長、地上部鮮重和地上部干重的耐低鉀綜合指數(shù)的分布頻率如圖5所示。綜合指數(shù)的分布范圍為0.368～1.480，主要分布在0.67～1.00，均值為0.865。根據(jù)綜合指數(shù)并結(jié)合稻苗的實(shí)際生長表現(xiàn)，對84份地方稻材料的耐低鉀能力進(jìn)行綜合評價(jià)和等級劃分（表7），最終篩選出11個(gè)耐低鉀品種（表8），這些材料苗期各性狀的相對耐性指數(shù)均高于90%，且SYI＞1.1；另外篩選出20個(gè)較耐低鉀品種（SYI為0.903～1.480）。

圖5 84份地方稻苗期4個(gè)性狀的耐低鉀綜合指數(shù)的分布頻率

表7 84份地方稻苗期耐低鉀能力的綜合評價(jià)結(jié)果

表8 耐低鉀品種的相對耐性指數(shù)和耐低鉀綜合指數(shù)

3 小結(jié)與討論

鉀是植物生長必需的元素之一，與植物的生長發(fā)育和新陳代謝等密切相關(guān)。前人諸多研究表明，不同基因型水稻在低鉀耐性上具有明顯的遺傳差異性［11-14］，這為從云南豐富多樣的地方稻資源中篩選和培育優(yōu)異耐低鉀水稻種質(zhì)提供了理論依據(jù)和可能性。本研究發(fā)現(xiàn)，在低鉀（2 mg/L K+）條件下，84個(gè)云南地方稻品種的性狀表現(xiàn)出明顯差異，其中株高、地上部鮮重和地上部干重這3個(gè)性狀的平均值均小于正常處理，而根長的平均值明顯高于正常處理；在低鉀條件下，大部分稻苗（63.10%）均表現(xiàn)出不同程度的植株矮小，生長緩慢，莖稈細(xì)弱，葉呈現(xiàn)褐斑，下部葉片發(fā)黃，部分品種（36.90%）生長狀況較佳，接近于正常處理，但也有少部分品種（13.10%）的性狀甚至超過正常處理的，這與已有的研究結(jié)果［10-13，18-21，23］基本一致。

目前有關(guān)水稻鉀高效基因型篩選的研究很多，在這類研究中水培法、盆栽法、大田試驗(yàn)法等都是常用方法。但總體而言，水稻鉀高效基因型的篩選目前還缺乏統(tǒng)一的篩選指標(biāo)和可靠的評價(jià)體系。由于盆栽法和大田試驗(yàn)法等難以控制單一因素的缺乏且生長周期長，易受天氣、季節(jié)和氣候的影響等，對于大規(guī)模的批量篩選可行性低［10，18，20－21，23］。本試驗(yàn)采用水培法，與大田試驗(yàn)相比，水稻的生長條件如溫度、水分、光照可人工調(diào)控，減少了不可控因素對耐低鉀水稻篩選的影響，且鑒定周期短、更高效。此外本試驗(yàn)鑒定材料的數(shù)量多，將材料置于去底的96孔PCR板上進(jìn)行培養(yǎng)，不僅節(jié)省了空間和成本，而且操作相對簡便有效，可以作為大規(guī)模品種前期高效、快速篩選的方法之一。

本試驗(yàn)在2 mg/L低鉀處理下，利用由株高、根長、地上部鮮重和地上部干重這4個(gè)性狀的相對耐性指數(shù)構(gòu)成的綜合指數(shù)作為耐低鉀能力的評價(jià)指標(biāo)，最終篩選出11個(gè)耐低鉀地方稻品種（小紅早谷、遲考皮、高糯、勐選二號、白齊頭谷、花谷、白香糯、紅根細(xì)、冬大白、紫稈谷和冷水谷）。但這一苗期鑒定結(jié)果具有一定的局限性。為了更全面地評價(jià)這些材料的鉀高效特性和產(chǎn)量潛力，后續(xù)還需進(jìn)行大田試驗(yàn)鑒定，研究這些品種在不同生育期吸收利用鉀的情況，并結(jié)合株高、穗長、單株產(chǎn)量、結(jié)實(shí)率、千粒重等主要產(chǎn)量性狀進(jìn)行綜合篩選和評價(jià)，以獲得更有應(yīng)用潛力的鉀高效水稻材料。