竹葉黃酮對蕭山雞公雞精液品質(zhì)和血液生理生化指標(biāo)的影響

阮振婷，王留超，吳志偉，俞奇力，陳 菲，盧立志，劉長國*

（1.浙江農(nóng)林大學(xué)動物科技學(xué)院?動物醫(yī)學(xué)院，浙江杭州 311300；2.杭州蕭山種雞（蕭山雞）有限公司，浙江杭州 311200；3.浙江省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所，浙江杭州 311000）

種公雞精液品質(zhì)的優(yōu)劣是判斷其繁殖性能的重要依據(jù)，也是決定種雞生產(chǎn)效益的關(guān)鍵因素，因此種雞場必須保證和改善公雞精液的品質(zhì)。竹葉黃酮是從竹葉中提取的天然物質(zhì)，具有多種生物學(xué)活性功能，不但能夠抗氧化、抗炎、抑菌、調(diào)節(jié)血栓血脂，還能夠保護(hù)心腦血管以及肝臟健康。另外，研究表明，竹葉黃酮能夠提高家禽的生產(chǎn)性能和免疫功能。因此，本試驗(yàn)旨在研究飼糧中添加不同濃度的竹葉黃酮對公雞精液品質(zhì)以及血液生理生化指標(biāo)的影響，以期為竹葉黃酮應(yīng)用于種公雞生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 竹葉黃酮純度40%（浙江圣氏生物科技有限公司），桿菌肽鋅預(yù)混劑純度10%（天津新星制藥廠）。

1.2 試驗(yàn)動物及設(shè)計(jì) 選取健康狀況良好、平均體重為（2.35±0.29）kg 的34 周齡蕭山雞公雞180 只，采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將公雞隨機(jī)分為6 組，每組6 個重復(fù)，每個重復(fù)5 只雞。其中，空白對照組飼喂基礎(chǔ)日糧，在基礎(chǔ)日糧中添加0.40‰（400 mg/kg）桿菌肽鋅作為陽性對照，試驗(yàn)組分別在基礎(chǔ)日糧中添加0.75‰、1.50‰、2.25‰、3.00‰竹葉黃酮。

1.3 飼養(yǎng)管理及基礎(chǔ)日糧 試驗(yàn)公雞單籠飼養(yǎng)，每日清晨06:30 喂料120 g，自由飲水。采用16 h 光照+8 h 黑暗的光照模式。預(yù)試期15 d，正試期90 d。基礎(chǔ)日糧參照NRC（1994）標(biāo)準(zhǔn)中家禽種雞營養(yǎng)需求水平設(shè)計(jì)（表1）。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)成分（干物質(zhì)基礎(chǔ)）

1.4 精液采集 分別于試驗(yàn)期第30、60、90 天，用腹背聯(lián)合按摩法采集公雞精液，每個重復(fù)采3 只公雞的精液。精液放入37℃保溫盒，10 min 內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室，置37℃水浴鍋中，進(jìn)行品質(zhì)評定。

1.5 精液品質(zhì)評定及方法

1.5.1 精液量和pH 采集時用帶刻度的集精杯收集精液，讀取精液量；回實(shí)驗(yàn)室后，用精密pH 計(jì)測定精液的pH。

1.5.2 精子活率 吸取精液10 μL，用37℃生理鹽水稀釋5 倍，用光學(xué)顯微鏡觀察活率。

1.5.3 精子密度 精子密度檢查用血細(xì)胞計(jì)數(shù)法。取10 μL原精液，用3% NaCl 稀釋300 倍，靜置10 min，置400× 顯微鏡下觀測5 個中方格的精子總數(shù)，計(jì)算精子密度。

1.5.4 精子畸形率 取10 μL 精液原液用稀釋液稀釋5 倍，制作抹片，于空氣中自然晾干，再置于無水乙醇中固定5 min，取出用水洗凈、烘干，用黑墨水染色5 min，再用水洗凈，待干燥后鏡檢。計(jì)數(shù)若干個視野中的正常精子和畸形精子，合計(jì)約500 個精子?；尉臃N類包括頭部畸形（頭大、頭小、無頭），中段畸形（頸部V形彎曲、線粒體鞘V 形彎曲）和尾部畸形（尾部V 形彎曲、尾部螺旋卷曲）等。最后，計(jì)算各種畸形精子的百分率。

1.6 血液生理生化指標(biāo)測定 在試驗(yàn)期末，從每個重復(fù)中隨機(jī)選取1 只雞，翅下靜脈采血2.5 mL。其中500 μL血液裝入血液抗凝管（抗凝劑EDTA-Na2），4℃保存運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，用全自動動物血液細(xì)胞分析儀（BC-2800Vеt）測定全血中白細(xì)胞（Whitе Blood Cеll，WBC）、淋巴細(xì)胞（Lymphocytе，Lymph）、單核細(xì)胞（Monocytе，Mon）、嗜中性粒細(xì)胞（Granulocytе，Gran）、淋巴細(xì)胞百分?jǐn)?shù)（Pеrcеntagе of Lymphocytе，Lymph%）、單核細(xì)胞百分?jǐn)?shù)（Pеrcеntagе of Monocytе，Mon%）、嗜中性粒細(xì)胞百分?jǐn)?shù)（Pеrcеntagе of Granulocytе，Gran%）、嗜酸性粒細(xì)胞百分?jǐn)?shù)（Pеrcеntagе of Eosino phils，Eos%）、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)（Rеd-Cеll Count，RBC）、血紅蛋白濃度（Hеmoglobin Concеntration，HGB）、紅細(xì)胞比積（Hеmatocrit，HCT）、平均紅細(xì)胞體積（Mеan Corpuscular Volumе，MCV）、平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量（Mеan Corpuscular Hеmoglobin，MCH）、平均血紅蛋白濃度（Mеan Corpuscular Hеmoglobin Concеntration，MCHC）、紅細(xì)胞分布寬度（Rеd Cеll Distribution Width，RDW）、血小板計(jì)數(shù)（Platеlеt Count，PLT）、血小板比積（Thrombocytocrit，PCT）、血小板平均體積（Mеan Platеlеt Volumе，MPV）、血小板分布寬度（Distribution Width Platеlеt，PDW）等。

另外，2 mL 血液裝入EP 管中，室溫靜置7～8 h，待血液凝固，取血清，用血液生化分析儀（BECKMAN COULTER AU480）測定血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（Glutamic-Pyruvic Transaminasе，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（Glutamic-Ox Alacеtic Transaminasе，AST）、堿性磷酸酶（Alkalinе Phosphatasе，ALP）、血清乳酸脫氫酶（Lactatе Dеhyd Rogеnasе，LDH）活性以及血清總蛋白（Total Protеin，TP）、白蛋白（Albumin，ALB）、球蛋白（Globulin，GLB）、白球蛋白比（Albumin-Globulin Ratio，A/G）、血糖（Blood Glucosе，GLU）、尿素（Urеa，UREA）、肌酐（Crеatininе，CREA）、甘油三酯（Triglycеridе，TG）、總膽固醇（Total Cholеstеrol，TC）等。超氧化物歧化酶（Supеroxidе Dismutasе，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathionе Pеroxidasе，GSH-Px）、過氧化氫酶（Catalasе，CAT）含量使用試劑盒測定（南京建成生物工程研究所）。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析 利用Excеl 對數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理，再用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。用單因素方差分析（Onе-Way ANOVA）統(tǒng)計(jì)公雞之間精液品質(zhì)、精子畸形種類以及血液生理生化的差異。結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié) 果

2.1 竹葉黃酮對公雞精液品質(zhì)的影響 由表2 可知，試驗(yàn)第30 天，與陽性對照組相比，4 個竹葉黃酮組公雞采精量均提高（<0.05）；第60 天和第90 天，與2 個對照組相比，4 個竹葉黃酮組均有升高趨勢（>0.05）。試驗(yàn)第30 天，各組間公雞精液密度無顯著差異；第60天和第90 天，與空白對照組相比，1.50‰、2.25‰、3.00‰竹葉黃酮組公雞精子密度均提高（<0.05）。試驗(yàn)第30、60 天，與空白對照組相比，0.75‰竹葉黃酮組和陽性對照組精液pH 均有所下降（>0.05）。試驗(yàn)第90 天時，與空白對照組相比，4 個竹葉黃酮組有降低精子畸形率的趨勢（>0.05）。最后，各試驗(yàn)組間精子活率無顯著差異。總體上，隨著飼喂時間的延長，竹葉黃酮逐漸表現(xiàn)出提高公雞射精量、精子密度和精液pH 及降低精子畸形率的作用。

表2 竹葉黃酮對蕭山雞公雞精液品質(zhì)的影響

2.2 竹葉黃酮對精子畸形類型的影響 由表3 可知，試驗(yàn)第30、60、90 天，與空白對照組相比，4 個竹葉黃酮試驗(yàn)組精子的3 種畸形類型無顯著差異，說明竹葉黃酮對公雞產(chǎn)生畸形精子無明顯的影響。

表3 竹葉黃酮對蕭山雞公雞精子畸形種類的影響 %

2.3 竹葉黃酮對血液指標(biāo)的影響

2.3.1 竹葉黃酮對蕭山雞公雞血液生理指標(biāo)的影響 由表4 可知，與空白對照組相比，4 個竹葉黃酮組Lymph 和Lymph% 有升高趨勢，Gran% 有降低趨勢（0.05<<0.1），0.75‰、1.50‰竹葉黃酮組和陽性對照組Gran 含量均下降（<0.05），1.50‰、2.25‰和陽性對照組Eos%均下降（<0.05）。與空白對照組相比，各試驗(yàn)組RDW 含量有下降趨勢（0.05<<0.1）。與2 個對照組相比，2.25‰竹葉黃酮組PLT 和PCT 含量提高（<0.05），且高于0.75‰、3.00‰竹葉黃酮組（<0.05），0.75‰竹葉黃酮組PLT、PCT%與陽性對照組相當(dāng)。各組間MPV 和PDW 差異均不顯著。

表4 竹葉黃酮對蕭山雞公雞血液生理指標(biāo)的影響

2.3.2 竹葉黃酮對蕭山雞公雞血清生化指標(biāo)的影響 如表5 顯示， 4 個竹葉黃酮試驗(yàn)組和陽性對照組的ALT均低于空白對照組，而ALP 和TC 均高于空白對照組（>0.05）。0.75‰竹葉黃酮組LDH 與陽性對照組相近；而0.75‰和2.25‰竹葉黃酮組TG 含量低于2 個對照組（>0.05）。另外，各組間蛋白質(zhì)相關(guān)指標(biāo)TP、ALB、GLB 和A/G 均無顯著差異。

表5 竹葉黃酮對蕭山雞公雞血清生化指標(biāo)的影響

3 討 論

3.1 竹葉黃酮對蕭山雞公雞精液品質(zhì)的影響 在家禽生產(chǎn)中，天然抗氧化劑在維持高的生長水平、繁殖和免疫能力方面具有特殊的重要性，抗氧化劑攝入不足可能會導(dǎo)致氧化應(yīng)激。研究表明，在肉仔雞飼糧中添加植物脂肪和抗氧化劑等植物提取物，可提高其生產(chǎn)性能。本試驗(yàn)中，測定的精液品質(zhì)結(jié)果均符合正常的精液品質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)，并且隨著飼喂時間的延長，竹葉黃酮有改善公雞精液品質(zhì)的作用。郭振慧等研究也發(fā)現(xiàn)，大豆黃酮能緩解熱應(yīng)激對公兔睪丸組織的損傷，提高采精量和精子密度，降低精子畸形率?？赡苁且?yàn)辄S酮類化合物富含各種與繁殖性能有關(guān)的營養(yǎng)物質(zhì)，并且參與了公雞的下丘腦-垂體-性腺軸的調(diào)節(jié)活動，促進(jìn)公雞性腺發(fā)育，一定程度上緩解了熱應(yīng)激對公雞睪丸組織的損傷，維持正常生殖機(jī)能運(yùn)行，從而提高了種公雞的精液品質(zhì)。

3.2 竹葉黃酮對蕭山雞公雞血液生理生化指標(biāo)的影響

3.2.1 竹葉黃酮對蕭山雞公雞血液生理指標(biāo)的影響 血液生理指標(biāo)包括WBC、RBC 和PLT 三大類。WBC 是具有防護(hù)作用的細(xì)胞，能夠吞噬異物、產(chǎn)生抗體、防御疾病，Lymph 是機(jī)體免疫力的重要評價(jià)指標(biāo)。研究表明，當(dāng)Gran/Lymph 比值變大時，Gran 分泌的大量炎癥介質(zhì)會介導(dǎo)廣泛的炎癥反應(yīng)。本試驗(yàn)中，與空白對照組相比，竹葉黃酮試驗(yàn)組公雞血液中Gran/Lymph 比值有下降趨勢，意味著黃酮類化合物可能參與了機(jī)體的細(xì)胞免疫，從而提高了蕭山雞公雞的免疫機(jī)能，說明竹葉黃酮具有一定的抗炎作用。RBC、HGB、RDW、MCV和MCHC 等指標(biāo)反映了血液運(yùn)載氧氣的能力。紅細(xì)胞對氧、二氧化碳、葡萄糖及氨基酸的運(yùn)輸是通過紅細(xì)胞中的血紅蛋白來實(shí)現(xiàn)的。RDW 是表示機(jī)體紅細(xì)胞體積一致性的重要參數(shù)；HCT 是影響血液黏度的最主要因素，且與血液黏度正相關(guān)。另外，血液中MCV、MCH、MCHC、RDW 等也可用于檢測機(jī)體缺鐵性貧血的發(fā)生。本試驗(yàn)中，與空白對照組相比，竹葉黃酮總體上有降低單位體積血液中RBC、HGB、HCT、RDW 并升高M(jìn)CH、MCHC 含量的趨勢，表明竹葉黃酮具有改善紅細(xì)胞運(yùn)氧能力、提高紅細(xì)胞整齊度、降低紅細(xì)胞聚集、促進(jìn)機(jī)體血紅蛋白合成的潛質(zhì)。其中，0.75‰竹葉黃酮組在WBC 和RBC 中的各個指標(biāo)與陽性對照組相近，表明0.75‰竹葉黃酮添加劑量具有代替抗生素的潛質(zhì)。

PLT 對機(jī)體具有凝血功能，可保護(hù)毛細(xì)血管的完整性。PDW 是血小板分布寬度一致性的衡量指標(biāo)，較高的PDW 值代表血小板有較強(qiáng)的凝血功能。本研究中，竹葉黃酮處理組血小板參數(shù)均高于空白對照組，其中0.75‰、1.50‰和2.25‰竹葉黃酮組PDW 顯著上升，說明總體上竹葉黃酮提高了機(jī)體凝血、止血等功能，同時有抑制血小板聚集的趨勢，對血栓的形成具有良好的調(diào)節(jié)作用。

3.2.2 竹葉黃酮對蕭山雞公雞血清生化的影響 血液中生化指標(biāo)能客觀反映機(jī)體臟器的健康狀態(tài)、營養(yǎng)物質(zhì)代謝正常與否以及動物的免疫水平等。血清中ALT和AST 活性變化可用于評估雞肝功能情況，ALT 和AST 含量升高顯示機(jī)體肝功能可能受損；另外，血清中LDH 也是檢測動物機(jī)體肝臟和實(shí)質(zhì)性內(nèi)臟器官損傷的指標(biāo)。本研究中，較空白對照組而言，竹葉黃酮有降低蕭山雞公雞血清中ALT 和LDH 含量的趨勢，說明竹葉黃酮加強(qiáng)了機(jī)體肝細(xì)胞進(jìn)行物質(zhì)代謝的功能，對肝臟具有一定保護(hù)作用。

UREA 和CREA 是機(jī)體蛋白質(zhì)代謝的終產(chǎn)物，是反映腎臟功能的主要指標(biāo)。TG 和TC 含量的高低反映了動物機(jī)體脂類的吸收和代謝狀況。本研究結(jié)果顯示，在蕭山雞公雞日糧中添加不同濃度竹葉黃酮并不影響其腎功能。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，在蕭山雞公雞日糧中添加竹葉黃酮有改善公雞精液品質(zhì)、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、提高紅細(xì)胞運(yùn)氧能力以及改善血小板參數(shù)的潛質(zhì)。因此，竹葉黃酮可以作為良好的替抗物質(zhì)，且以0.75‰竹葉黃酮添加劑量效果相對更理想。