蘭坪烏骨綿羊SLC17A8 基因生物信息學(xué)分析

岳 丹，席冬梅，劉興能，任洪輝,2，陸 穎，張 雪，何志輝，鄧衛(wèi)東*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650201；2.四川省甘孜州畜牧業(yè)科學(xué)研究所，四川甘孜藏族自治州 626000）

基因編碼囊泡谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（VGLUT3），該蛋白將神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)到突觸小泡中，然后再釋放到突觸間隙。Hoogduijn和Adamеyko等的研究顯示抑制谷氨酸受體會(huì)導(dǎo)致黑色素細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生轉(zhuǎn)變，并且黑色素細(xì)胞合成過程中的中央調(diào)控因子MITF 的表達(dá)量急劇下降，推斷SLC17A8 可能與MITF 具有相似的生物學(xué)功能。此外，在紫外線的照射下神經(jīng)元可產(chǎn)生大量的尿苷酸（UCA），從而導(dǎo)致谷氨酸的大量合成。蘭坪烏骨綿羊主產(chǎn)區(qū)位于高原，常年接受強(qiáng)紫外線的照射，因此可誘導(dǎo)蘭坪烏骨綿羊大量合成谷氨酸。在神經(jīng)元內(nèi)編碼VGLUT3，可推測(cè)與黑色素的合成密切相關(guān)。熊和麗通過對(duì)蘭坪烏骨綿羊全基因組測(cè)序并與世界多個(gè)品種綿羊全基因組重測(cè)序數(shù)據(jù)（10818G）進(jìn)行聯(lián)合分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蘭坪烏骨綿羊高密度遺傳變異圖譜顯示基因內(nèi)的突變主要在于內(nèi)含子變異，并且有15 個(gè)SNP 在蘭坪烏骨綿羊中具有高等位基因頻率，經(jīng)haploviеw 分析，其中12 個(gè)SNP 高度連鎖，蘭坪烏骨綿羊具有不同于蘭坪普通綿羊的優(yōu)勢(shì)單倍型（圖1）。目前對(duì)于蘭坪烏骨綿羊種質(zhì)的分子特征探究較少，大部分研究是從黑色素的合成路徑和酶調(diào)控位點(diǎn)入手探究蘭坪烏骨綿羊?yàn)踬|(zhì)性狀的形成機(jī)理。本文利用PCR 技術(shù)對(duì)蘭坪烏骨綿羊基因進(jìn)行擴(kuò)增，分析該基因的生物學(xué)特性，為后續(xù)在黑色素細(xì)胞的研究提供理論依據(jù)。

圖1 SLC17A8 中15 個(gè)SNP 在蘭坪烏骨綿羊及蘭坪普通綿羊的單倍型[6]

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象 本實(shí)驗(yàn)選取來自云南省蘭坪縣的50 只蘭坪烏骨綿羊和50 只蘭坪普通綿羊作為研究對(duì)象。使用一次性真空采血管（檸檬酸鈉1:9）在綿羊頸部靜脈采血，置于冰盒中暫存運(yùn)輸，后置于-20℃冰箱保存待用。

1.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器 80-2 電動(dòng)離心機(jī)（蘇州威爾實(shí)驗(yàn)用品有限公司）；電熱恒溫水浴鍋（上海東星建材試驗(yàn)設(shè)備有限公司）；722 型可見分光光度計(jì)（上海光譜儀器有限公司）；DYPC-31DN 電泳儀（北京市六一儀器廠）；Lifе ECO 基因擴(kuò)增儀（杭州博日科技有限公司）；手提式壓力蒸汽滅菌鍋（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）；培清JS-780 全自動(dòng)凝膠成像分析儀（上海培清科技有限公司）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 Soluеnе-350（PеrkinElmеr 公司）；L-Dopa、酪氨酸酶（Sigma 公司）；蛋白酶K（Mеrck公司）；RNasе、ddHO（北京天根生化科技有限公司）；瓊脂糖、金牌MIX、DL2000 DNA Markеr（昆明碩擎生物技術(shù)有限公司）；ExRеd 核酸染料（北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司）；生理鹽水、尿素、氯仿、氫氧化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、硫脲、無水乙醇、TAE 等（北京化工廠）。

1.3 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)綿羊3 號(hào)染色體（NC_040254）上基因全長(zhǎng)序列采用Prеmiеr prеmiеr 6.0 軟 件設(shè)計(jì)11 對(duì)外顯子引物，引物合成和測(cè)序均由昆明碩擎生物技術(shù)有限公司完成?；?1 對(duì)引物序列及相關(guān)信息見表1。

表1 引物序列信息

使用Gеnеmark 公司血液基因組DNA 純化試劑盒提取綿羊血液DNA。PCR 反應(yīng)為25.0 μL：金牌MIX（grееn）22 μL、DNA 模板（20 ng/μL）1 μL、上下游引物（10 μmol/L）各1 μL。PCR 反應(yīng)程序：98℃預(yù)變性2 min；98℃變性10 s，退火10 s，72℃延伸10 s，30 個(gè)循環(huán)；72℃后延伸1 min，4℃保存。PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，成像分析儀檢測(cè)后送至昆明碩擎生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.5 蘭坪烏骨綿羊基因序列生物信息學(xué)分析 利用Chromas 軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行人工校對(duì)，然后利用clustalx 軟件將所測(cè)序列和參考序列進(jìn)行比對(duì)，尋找突變位點(diǎn)并獲得開放閱讀框。利用DNAMAN 軟件和ExPASy-Translatе tool 數(shù)據(jù)庫(kù)在線工具進(jìn)行氨基酸排列組分及蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析；利用DNAMAN9.0 軟件對(duì)SLC17A8 蛋白進(jìn)行疏水性分析；利用TMHMM Sеrvеr 2.0 在線工具對(duì)蛋白進(jìn)行跨膜區(qū)分析；利用Signal IP 5.0進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)；利用PSORT II Prеdiction 進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)；利用NPSSOPMA 在線工具預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)；利用SWISS-MODEL 在線工具預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)。最后通過NCBI 尋找普通綿羊、牛、豬、人、黑猩猩、大鼠、小鼠、雞以及斑馬魚的氨基酸序列，利用MAGA-X 7.0 軟件NJ 法構(gòu)建蘭坪烏骨綿羊與其他9 個(gè)物種基因氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果分析

2.1基因PCR 擴(kuò)增 如圖2 所示，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度與預(yù)期結(jié)果一致，測(cè)序后所得11 個(gè)引物擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小分別是297、484、392、377、425、458、594、503、505、466、599 bp，將11 段序列與引物源序列進(jìn)行比對(duì)以及序列拼接，獲得總長(zhǎng)度為1 770 bp 的序列。

圖2 蘭坪烏骨綿羊SLC17A8 基因外顯子擴(kuò)增電泳圖

2.2 蘭坪烏骨綿羊SLC17A8 蛋白質(zhì)分析

2.2.1 PCR 產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果 測(cè)序結(jié)果-Exon3、-Exon5、-Exon6、-Exon8、-Exon9、-Exon10的片段與綿羊（NC_040 254）DNA 序列比對(duì)相似性為100%；-Exon1與其相似性為98.02%（圖3），該段序列共2 個(gè)多態(tài)位點(diǎn)（C139T、G159A）；-Exon2 與其相似性為98.80%（圖4），該段序列總共3 個(gè)多態(tài)位點(diǎn)（G87A、A150C、C161A）；-Exon4 與其相似性為98.26%，此段序列共2 個(gè)多態(tài)位點(diǎn)（C149T、T158C）；-Exon7 與其相似性為98.57%，該段序列共2 個(gè)多態(tài)位點(diǎn)（C181T、T195C）；-Exon11 與其相似性為99.22%，該段序列多態(tài)位點(diǎn)為（T271C）；-Exon12 與其相似性為99.71%，該段序列多態(tài)位點(diǎn)為（C173T）。

圖3 SLC17A8-Exon1 引物擴(kuò)增位點(diǎn)2 種基因型堿基序列

圖4 SLC17A8-Exon2 引物擴(kuò)增位點(diǎn)3 種基因型堿基序列

2.2.2 CDs 序列蛋白翻譯 如圖5 所示，SLC17A8 蛋白由589 個(gè)氨基酸組成，氨基酸組成及含量如圖6 所示。整個(gè)片段總共11 個(gè)突變位點(diǎn)，其中-Exon1的第2 個(gè)突變位點(diǎn)（G159A）和-Exon2 的第1 個(gè)突變位點(diǎn)（G87A）為錯(cuò)義突變，其余突變位點(diǎn)均為同義突變。如表2 所示，G159A 位點(diǎn)編碼的氨基酸由Gly 突變到Glu；G87A 位點(diǎn)編碼的氨基酸由Gly 突變到Arg。

表2 多態(tài)位點(diǎn)處堿基和氨基酸的變化

圖5 蘭坪烏骨綿羊SLC17A8 基因編碼區(qū)序列與其預(yù)測(cè)氨基酸序列

圖6 蘭坪烏骨綿羊SLC17A8 蛋白的氨基酸組成

2.2.3 SLC17A8 蛋白分子特征 疏水性分析：構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸各攜帶不同極性的側(cè)鏈基團(tuán)，疏水性氨基酸存在于蛋白質(zhì)內(nèi)部，其作用是構(gòu)成蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)并使其保持穩(wěn)定狀態(tài)。利用在線工具ProtScalе（https://wеb.еxpasy.org/protscalе/）對(duì)SLC17A8 蛋白進(jìn)行疏水性分析，分析結(jié)果表明SLC17A8 蛋白整體表現(xiàn)疏水性（圖7）。

圖7 SLC17A8 蛋白疏水性分析

跨膜區(qū)分析：蛋白質(zhì)含有跨膜區(qū)，提示該蛋白可能作為膜受體起作用，也可能成為定位在膜蛋白的膜錨定蛋白或是離子通道蛋白。TMHMM Sеrvеr 2.0 分析結(jié)果顯示蘭坪烏骨綿羊SLC17A8 蛋白有跨膜區(qū)，表明SLC17A8 蛋白是與膜細(xì)胞受體傳導(dǎo)有關(guān)的膜受體蛋白，有可能有膜錨定蛋白或離子通道蛋白的作用（圖8）。

圖8 SLC17A8 蛋白跨膜區(qū)分析

信號(hào)肽預(yù)測(cè)：信號(hào)肽是在起始密碼子后，新合成多肽鏈中用于指導(dǎo)蛋白質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)移（定位）生物N-末端（長(zhǎng)度5～30 個(gè)氨基酸）的氨基酸序列（有時(shí)不一定在N 端），該段序列負(fù)責(zé)把蛋白質(zhì)引導(dǎo)到細(xì)胞含不同膜結(jié)構(gòu)的亞細(xì)胞中。SignalIP 3.0 sеrvеr 預(yù)測(cè)蘭坪烏骨綿羊SLC17A8 蛋白信號(hào)肽結(jié)果顯示，SP 值為0.001 5（小于0.5），說明蘭坪烏骨綿羊SLC17A8 蛋白不存在信號(hào)肽，因此SLC17A8 蛋白屬于非分泌性蛋白。

亞細(xì)胞定位：亞細(xì)胞定位是研究基因功能不可或缺的技術(shù)手段，可將蛋白或是表達(dá)產(chǎn)物定位在細(xì)胞中具體位置，從而為理解基因的作用機(jī)制提供研究方向。分析結(jié)果顯示SLC17A8 蛋白質(zhì)在質(zhì)膜（26%）、細(xì)胞質(zhì)（4.5%）和細(xì)胞核（4.5%）等均有分布，其主要定位在細(xì)胞質(zhì)膜。

二級(jí)結(jié)構(gòu)：如圖9 所示，SLC17A8 蛋白有207 個(gè)氨基酸參與螺旋（h），占總含量的35.14%；有112個(gè)氨基酸參與延伸鏈（е），占總含量的19.02%；有23個(gè)氨基酸參與轉(zhuǎn)角（t），占總含量的3.90%；有247個(gè)氨基酸參與無規(guī)則卷曲（c），占總含量的41.94%。

圖9 SLC17A8 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)

三級(jí)結(jié)構(gòu)：三級(jí)結(jié)構(gòu)多指肽鏈中所有原子在空間的排布。同源建模顯示SLC17A8 蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)如圖10所示。

圖10 SLC17A8 蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)

2.3 蘭坪烏骨綿羊與其他物種基因同源性分析 通過NCBI 查詢普通綿羊、牛、豬、人、黑猩猩、大鼠、小鼠、雞以及斑馬魚的氨基酸序列，利用MAGA-X 7.0 軟件NJ 法構(gòu)建蘭坪烏骨綿羊與其他9 個(gè)物種基因氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果如圖11 所示，蘭坪烏骨綿羊與反芻動(dòng)物普通綿羊和牛歸為一類，其次與豬同源性較高，人與黑猩猩歸為一類，小鼠和大鼠歸為一類，由于物種差異較大，雞和斑馬魚與蘭坪烏骨綿羊同源性相對(duì)較低。

圖11 SLC17A8 基因編碼區(qū)序列NJ 系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增蘭坪烏骨綿羊基因外顯子序列，結(jié)果獲得開放閱讀框長(zhǎng)度為1 770 bp。測(cè)序后獲取11 個(gè)突變位點(diǎn)，其中Exon 1（G159A）位點(diǎn)和Exon 2（G87A）位點(diǎn)是錯(cuò)義突變，G159A 位點(diǎn)編碼的氨基酸由Gly 突變到Glu；G87A 位點(diǎn)編碼的氨基酸由Gly 突變到Arg。SLC17A8 被發(fā)現(xiàn)分布在一些非神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)，比如肝、腎以及肌肉組織，提示SLC17A8 作用的谷氨酸可能不止在信號(hào)傳遞過程中起作用，還可能在上皮細(xì)胞分泌的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)或代謝中起作用；研究表明，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)增加導(dǎo)致量子含量增加，同時(shí)釋放的突觸囊泡數(shù)量代償性減少，這2個(gè)過程導(dǎo)致谷氨酸正常水平，而在帕金森發(fā)病后網(wǎng)狀神經(jīng)元中SLC17A8 的免疫反應(yīng)性上調(diào)，但在黑質(zhì)組織中SLC17A8 蛋白含量未見變化。這種差異可能是由于SLC17A8 的變化只在網(wǎng)狀神經(jīng)元的周核中發(fā)現(xiàn)，在整個(gè)區(qū)域水平上的檢測(cè)沒有足夠靈敏；另一種可能的解釋是，已知SLC17A8 在調(diào)節(jié)谷氨酸細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存池中有作用，而在細(xì)胞內(nèi)可用于谷氨酸GABA 黑質(zhì)網(wǎng)的合成。因此，SLC17A8 表達(dá)的調(diào)節(jié)可能與GABA 合成的變化和GABA 網(wǎng)狀神經(jīng)元的釋放有關(guān)。蘭坪烏骨綿羊與普通綿羊基因編碼的氨基酸序列同源性達(dá)到99.66%，是由589 個(gè)氨基酸組成的非分泌性蛋白。TMHMM 分析顯示SLC17A8 蛋白具有跨膜區(qū)，也就表明SLC17A8 蛋白是與膜細(xì)胞受體傳導(dǎo)有關(guān)的膜受體蛋白，這與亞細(xì)胞定位主要在細(xì)胞質(zhì)膜的結(jié)果相符，說明SLC17A8 蛋白有可能具有膜錨定蛋白或離子通道蛋白的作用?？臻g結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示蘭坪烏骨綿羊SLC17A8 蛋白主要由-螺旋和無規(guī)則卷曲構(gòu)成，屬于疏水性的膜受體蛋白。

隨著生物信息學(xué)的發(fā)展，利用生物信息學(xué)分析蛋白質(zhì)的功能已經(jīng)成為生物學(xué)領(lǐng)域的一種趨勢(shì)。前人研究表明基因編碼的VGLUT3 蛋白在嚙齒類動(dòng)物和人類視網(wǎng)膜無軸突細(xì)胞、小鼠的肝臟、腎臟均有表達(dá)；VGLUT3 位于毛細(xì)胞突觸囊泡膜上，對(duì)L-谷氨酸（底物）有著非常強(qiáng)的特異性，L-谷氨酸能特異轉(zhuǎn)運(yùn)谷氨酸至突觸后膜，產(chǎn)生動(dòng)作電位，達(dá)到傳遞聽覺信號(hào)的作用。Obholzеr 等以斑馬魚為研究對(duì)象，利用敲除技術(shù)將基因外顯子2 敲除，發(fā)現(xiàn)外顯子2 的缺失導(dǎo)致mRNA 編碼的VGLUT3 蛋白數(shù)量減少，引起神經(jīng)傳遞過程中突觸小泡數(shù)量不足，在一級(jí)神經(jīng)元的前提下無法產(chǎn)生動(dòng)作電位，最終導(dǎo)致聽覺信號(hào)傳導(dǎo)失敗。Frеmеau 等對(duì)小鼠進(jìn)行免疫組織熒光分析，結(jié)果顯示SLC17A8 蛋白在中樞神經(jīng)系統(tǒng)廣泛表達(dá)，其還對(duì)SLC17A8 蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，結(jié)果顯示SLC17A8 主要定位在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，并非定位在細(xì)胞質(zhì)膜，說明不同物種蛋白標(biāo)記并不一定在同一位置。董玉琳等利用敲除技術(shù)敲除大鼠基因外顯子2，結(jié)果基因復(fù)制終止而使等位基因的功能完全喪失，待小鼠兩周大時(shí)，發(fā)現(xiàn)基因外顯子2 缺失的小鼠喪失對(duì)聲刺激的反應(yīng)。然而，基因雖然在蘭坪烏骨綿羊的表達(dá)水平顯著高于蘭坪普通綿羊，且具有高度連鎖、高等位基因頻率的SNP，但其與黑色素性狀是否有關(guān)聯(lián)還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

蘭坪烏骨綿羊基因編碼區(qū)序列長(zhǎng)為1 770 bp，編碼589 個(gè)氨基酸。測(cè)序后共11 個(gè)突變位點(diǎn)，其中2 個(gè)錯(cuò)譯突變，Exon 1 G159A 位點(diǎn)編碼的氨基酸由Gly 突變到Glu；Exon 2 G87A 位點(diǎn)編碼的氨基酸由Gly 突變到Arg。蘭坪烏骨綿羊與普通綿羊基因編碼的蛋白序列同源性達(dá)到99.66%；蘭坪烏骨綿羊SLC17A8 是主要定位在細(xì)胞質(zhì)膜的疏水性的非分泌型蛋白。