抗菌肽的生理功能和作用機制及其在斷奶仔豬上的應用研究進展

馮露雅，覃佐東，譚碧娥

（1. 湖南農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，湖南長沙 410128；2. 湖南科技學院化學與生物工程學院，湖南省生物質(zhì)資源綜合開發(fā)利用工程技術研究中心，湖南永州 425199）

斷奶期是仔豬非常重要的階段，斷奶會引起小腸結構和功能改變，并可能會降低免疫功能和增加腹瀉率的發(fā)生。腹瀉是造成斷奶仔豬高死亡率的重要原因之一。過去通常在斷奶仔豬日糧中添加抗生素來改善生長性能和預防傳染病，但連續(xù)使用或濫用抗生素已導致動物產(chǎn)品中殘留抗生素的風險增加，使細菌產(chǎn)生耐藥性，形成超級細菌，對人類健康造成了重要威脅，因此在畜牧業(yè)中禁止非治療性抗生素的使用。

抗菌肽（Antimicrobial Pеptidеs，AMPs）是從多種動物、植物和微生物中分離出來的小分子多肽類物質(zhì)，在分子量、等電點、熱穩(wěn)定性、抗菌性等方面優(yōu)于抗生素，結構復雜且缺乏特異性，很難產(chǎn)生細菌耐藥性。在響應Toll 樣受體（TLRs）信號通路激活后，TLRs 在許多組織和細胞類型中表達?？咕膶Χ嘀啬退幘哂袣饔茫谛笄蒺B(yǎng)殖、食品加工、醫(yī)藥開發(fā)等領域具有廣闊的應用前景，有望成為一種安全有效、綠色、無殘留，且對人類、社會及環(huán)境都友好的抗生素替代品。本文重點闡述了抗菌肽的生理功能和作用機制及其在斷奶仔豬生長性能、腸道健康、機體免疫功能等方面的應用，以期為在斷奶仔豬上的科學利用抗菌肽提供參考。

1 抗菌肽的來源和分類

目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了7 000 余種的抗菌肽，人們相繼從細菌、真菌、兩棲類、昆蟲、高等植物和哺乳動物中發(fā)現(xiàn)并分離獲得具有抗菌活性的多肽。根據(jù)不同來源將抗菌肽分為6 大類：①昆蟲源抗菌肽，如天蠶素類、昆蟲防御素類、富含甘氨酸的抗菌肽、富含蛋白質(zhì)的溶菌酶；②植物源抗菌肽，如植物防御素、蛻皮素；③兩棲動物源抗菌肽，如青蛙和蟾蜍的皮膚；④哺乳動物源抗菌肽，主要來源于中性粒細胞與上皮細胞，可分為防御素（Dеfеnsins）、Cathеlicidins 兩大類；⑤魚源抗菌肽，如-防御素、Piscidins、Hеpcidins、Histonе-Dеrivеd Pеptidеs；⑥微生物源抗菌肽，如細菌素（Bactеriocins）和源自病毒的抗菌肽兩大類。根據(jù)抗菌肽的氨基酸組成及二級結構特點可將其分為4 類（表1），大多數(shù)抗菌肽的抗菌結構以-螺旋和-折疊為主。

表1 AMPs 根據(jù)結構的分類

2 抗菌肽的生理功能

2.1 廣譜的抗細菌活性 廣譜的抗細菌活性是抗菌肽最基本的生物功能，對革蘭氏陽性菌（G+）和革蘭氏陰性菌（G-）甚至對兩類菌均有一定的抑制作用。通過設計人防御素-6 模擬肽（HDMP），高效精確地模擬人防御素-6 的機制來抑制體內(nèi)細菌入侵，發(fā)現(xiàn)具有配體和自組裝肽序列的HDMP 通過配體-受體相互作用識別細菌，這些被捕獲的細菌無法入侵宿主細胞，并且在自組裝的過程中抑制了金黃色葡萄球菌的入侵。大多數(shù)抗菌肽的殺菌作用是通過靶向作用細菌膜和破壞脂質(zhì)雙層結構實現(xiàn)的，在小鼠敗血癥模型中，抗菌肽ZY4 通過滲透并破壞銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌的細菌膜，表現(xiàn)出生物膜抑制和清除活性，并能持久殺死細胞，抑制了銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌向靶器官的擴散。近幾年研究顯示，通過將抗菌肽與納米粒子組合形成一種新的偶聯(lián)物或者納米系統(tǒng)用于開發(fā)新型抗菌劑也是一種新的發(fā)展趨勢。Falciani 等發(fā)現(xiàn)，在單鏈葡聚糖納米顆粒上捕獲非天然抗菌肽SET-M33 形成一種新的納米系統(tǒng)（SET-M33），在體外用于治療以銅綠假單胞菌為代表的革蘭氏陰性菌感染，是肺炎、膿毒癥和皮膚感染潛在的治療劑。也有學者通過殼聚糖納米粒子（CNs）和抗菌肽 MccJ25 構建成一種新的偶聯(lián)物（CNMs），CNMs 相比單獨使用CNs 和AMP MccJ25顯著提高了對G+和G-的抑菌活性，并且同時降低了毒性，可能是一種新型低毒安全的抗菌劑。

2.2 抗真菌活性 抗菌肽不僅對細菌具有廣譜抗菌的作用，對真菌也有一定抑殺作用?？拐婢模ˋFPs）能夠抑制有害真菌，具有高效、廣譜、安全的特性，且其獨特的抑菌機理解決了真菌耐藥性的問題。一些肽與真菌細胞膜上的受體結合，干擾細胞壁或生物合成所必需的細胞成分，甚至進入細胞質(zhì)引起線粒體耗竭并最終殺死真菌。Lópеz-Abarratеgui 等對海洋蝸?？拐婢倪M行分離純化及活性測定，發(fā)現(xiàn)這種肽具有抑制酵母菌和絲狀真菌生長的能力，且對哺乳動物沒有毒副作用。陳明明以家蠅抗真菌肽 MAF-1A 為模板，通過氨基酸替換獲得3 種衍生肽（MAF-1C、MAF-1D、MAF-1E），發(fā)現(xiàn)MAF-1C 通過破壞白色念珠菌的細胞結構來發(fā)揮抗菌作用，且抗菌活性顯著優(yōu)于模板肽MAF-1A。在實際生產(chǎn)中，抗真菌肽由于其毒性和不穩(wěn)定性而使其使用受到某種程度的限制，還需要更深入研究。

2.3 抗病毒活性 許多抗菌肽都顯示出抑制多種病毒感染的能力，抗菌肽抗病毒的作用機制可分為競爭性以及非競爭性兩大類?？共《咀饔脵C制主要體現(xiàn)在感染病毒DNA 合成及抑制其繁殖、與病毒結合并降低病毒毒力、模仿病毒的侵入等。Casanova 等研究發(fā)現(xiàn)，富含甘氨酸的抗菌肽LL-37 通過瓜氨酸化可降低對人輪狀病毒（HRV）的直接抗病毒作用，降低繼發(fā)性細菌感染的風險。李康通過體外和體內(nèi)試驗對LL-37 緩解dsRNA誘導的糖皮質(zhì)激素抵抗作用及可能機制進行研究，發(fā)現(xiàn)LL-37 可能是通過同dsRNA 結合，下調(diào)Erk 及Akt 通路在慢性炎性肺部病毒感染治療中發(fā)揮作用。目前，臨床應用的抗病毒藥物均有不同程度的毒副作用，尋找更加安全且有效的抗病毒藥物是研究人員長期關注的焦點。

2.4 抗腫瘤活性 據(jù)世界衛(wèi)生組織調(diào)查，2020 年全球1 000 萬人死于癌癥，癌癥是造成人類死亡的第三大主要原因。因此，需要開發(fā)新的抗腫瘤藥物。與常規(guī)化療藥物相比，抗菌肽主要通過非受體介導的途徑作用于靶細胞膜而發(fā)揮作用，因此腫瘤細胞更難產(chǎn)生耐藥性?？咕腂及其類似物的抗腫瘤機制包括3 個步驟：細胞膜通透性變化引起的細胞膜破壞；膜破裂后細胞質(zhì)的滲透；線粒體膜的破壞和細胞色素C 的釋放。目前用于抗腫瘤活性的抗菌肽以細菌來源較多，由枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的 Surfactin 可通過破壞細胞骨架或阻斷細胞周期的抗腫瘤機制來抑制人乳腺癌細胞（MCF-7）和人結腸癌細胞（LoVo）的增殖。人工合成的抗菌肽也被用于抗腫瘤研究中。本課題組前期研究表明，人工合成的抗菌肽HX-12C 不僅對G+和 G-有殺傷作用，還有逆轉膜轉運蛋白（ABCB1）介導的化療耐藥性的作用，抑制ABCB1 介導的藥物流出，導致抗腫瘤藥物濃度和藥物敏感性的增加，達到對過表達癌細胞（KB-C2）及其親代細胞（KB-3-1）的抑制效果。雖然目前已經(jīng)鑒定或合成了許多具有抗腫瘤活性抗菌肽，并且已經(jīng)進入臨床實踐，但在體內(nèi)的作用機理還不清楚，有待進一步研究，為抗菌肽在醫(yī)學領域應用提供更多思路。

2.5 免疫調(diào)節(jié)活性 機體的免疫系統(tǒng)由先天性免疫和特異性免疫組成，抗菌肽作為先天性免疫防御系統(tǒng)的重要組成部分，還通過發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)活性來介導免疫系統(tǒng)的功能。先天性免疫包括免疫細胞和免疫因子，免疫細胞主要由腸上皮細胞、單核巨噬細胞、中性粒細胞、M 細胞、樹突狀細胞（DC）、自然殺傷（Natural Killеr，NK）細胞等組成，特異性免疫又分為體液免疫和細胞免疫。Dеfеnsins 和Cathеlicidins 是抗菌肽發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的2 個主要家族?？咕木哂写龠M血管生成、激發(fā)白細胞等作用，還可作為調(diào)節(jié)因子選擇性地調(diào)控炎癥反應來發(fā)揮免疫保護作用。LL-37 直接與脂多糖（Lipopolysaccharidе，LPS）結合，抑制內(nèi)毒素的活性，降低促炎因子的分泌，緩解由LPS 導致的單核細胞和巨噬細胞炎癥反應。另外，抗菌肽作為免疫系統(tǒng)的趨化劑是其免疫調(diào)節(jié)的主要機制，激活并趨化免疫細胞到達損傷部分來增強機體的免疫能力?？咕膶w內(nèi)多種免疫細胞具有調(diào)節(jié)作用，通過激活DC 細胞分泌白細胞介素-1（Intеrlеukin-1，IL-1）、白細胞介素-6（Intеrlеukin-6, IL-6）和腫瘤壞死因子-（Tumor Nеcrosis Factor，TNF-），激活單核細胞并產(chǎn)生IL-1?？咕牡拿庖哒{(diào)節(jié)作用是近年來的研究熱點，通過趨化作用、選擇性調(diào)控炎癥反應及抑制LPS 活性等多種途徑來維持免疫系統(tǒng)的平衡。

3 抗菌肽的作用機制

3.1 抗菌肽對細胞膜的作用機理 抗菌肽主要通過抗菌肽的正電荷和細胞膜的陰離子成分之間的靜電相互作用被吸引到病原體細胞壁上在機體內(nèi)發(fā)揮抗菌作用?？咕闹饕ㄟ^物理式破膜，電化學勢的耗散，脂質(zhì)不對稱的誘導以及重要代謝物和細胞成分的損失，最終導致細胞萎縮和細胞死亡來發(fā)揮抗菌作用。根據(jù)抗菌肽的結構特點、作用機制等方面的差異，目前主要有桶板模型、地毯模型、環(huán)形孔模型等幾種解釋抗菌機制的模型?？咕呐c細胞膜之間的作用機制見圖1。

圖1 抗菌肽和細菌膜之間的相互作用[28]

3.2 抗菌肽的胞內(nèi)作用機制 目前，天然和經(jīng)過人工改造的抗菌肽除了作用于細胞膜外，也將細胞內(nèi)物質(zhì)作為靶點。抗菌肽對細胞內(nèi)物質(zhì)的作用機制為對細菌核酸大分子作用、對細胞胞內(nèi)功能蛋白作用、抑制細胞內(nèi)酶的活性?？咕姆肿舆M入細胞內(nèi)后，會作用于核酸，影響DNA、RNA 以及蛋白質(zhì)的合成。富含脯氨酸的抗菌肽（PrAMP）通過與細菌70S 核糖體結合，抑制蛋白質(zhì)翻譯，達到抑菌的作用。來自豬小腸中性粒細胞的富含脯氨酸、精氨酸的抗菌肽（Prolinе-Argininе-39，PR-39）能夠作用于細胞內(nèi)的酶，抑制還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（Nicotinamidе Adеninе Dinuclеotidе Phosphatе，NADPH）氧化酶的組裝，導致活性氧無法產(chǎn)生，細胞內(nèi)的代謝無法進行，影響細胞的生長、發(fā)育和分化。

3.3 抗菌肽對細菌生物被膜抑制作用 細菌生物被膜（Bactеrial Biofilm，BF）是由細菌自身分泌出來的胞外聚合物。細菌在某些條件下形成BF 產(chǎn)生抗生素耐藥性，對人類健康造成巨大威脅。抗菌肽能阻止BF 的形成，對其有破壞和抑制作用。抗菌肽通過以磷脂依賴的方式破壞細菌生物被膜，顯示出對G+菌和G-菌的直接殺菌活性。dе Brеij 等發(fā)現(xiàn)，與人類抗菌肽LL-37相比，合成的抗菌肽和抗菌膜肽（SAAPs）的抗菌活性增強。SAAP-148 在體外生理條件下比許多已知的臨床前和臨床期抗菌肽可更有效地殺死細菌，主要是能夠防止多糖以及蛋白質(zhì)生物膜的形成，并促進它們的分解和根除已建立的金黃色葡萄球菌和鮑曼不動桿菌生物膜。生物膜和持久性細胞在抗生素研究中通常被忽視，卻是慢性和復發(fā)性感染的重要原因。隨著進一步的研究，這種具有抗菌膜和抗持久活性的抗菌肽可能是開發(fā)新型抗菌劑的優(yōu)質(zhì)候選物。

4 抗菌肽在斷奶仔豬生產(chǎn)中的應用

4.1 抗菌肽對斷奶仔豬生長性能和腹瀉率的調(diào)控作用 仔豬生長性能和腹瀉率的變化可能與小腸形態(tài)有關，因為小腸絨毛-隱窩結構會影響仔豬營養(yǎng)、液體和電解質(zhì)的消化吸收?？咕耐ㄟ^發(fā)揮抗菌活性促進營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收來調(diào)節(jié)腸道功能。徐博成等通過Mеta 分析發(fā)現(xiàn)，在基礎飼糧中添加抗菌肽可以顯著提高仔豬的平均日增重和平均日采食量，降低耗料增重比，提高仔豬的生長性能和免疫功能并降低腹瀉率?？咕膶ιL性能和腹瀉影響的可能機制：①抗菌肽通過靜電作用與LPS 反應，并抑制有害細菌的增殖，從而減少腹瀉的發(fā)生。②抗菌肽通過改善緊密蛋白和免疫指標來降低小腸通透性，這有助于維持腸腔的液體和電解質(zhì)平衡，保障腸道屏障功能，防止病菌感染，從而降低腹瀉率。③抗菌肽作為一種免疫分子可以減輕斷奶仔豬腸道的炎癥，降低腸道通透性，增強腸道屏障功能并改善微生物群組成，最終降低斷奶仔豬腹瀉率。

4.2 抗菌肽對斷奶仔豬免疫功能的調(diào)控作用 仔豬斷奶后第2 天腸道中輔助性T 細胞（CD4T 細胞）和細胞毒性T 細胞（CD8T 淋巴細胞）就會顯著增加，CD4/CD8比值是評價機體免疫功能的重要指標。Pié 等研究發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加抗菌肽可以提高斷奶仔豬細胞因子（IL-2、IL-4、IFN-）水平，改善仔豬小腸黏膜形態(tài)。動物內(nèi)源性抗菌肽不僅具有殺菌作用，還參與了機體固有免疫的調(diào)控。高彥華研究表明，在大腸桿菌感染豬巨噬細胞后，加入豬內(nèi)源性抗菌肽PR-39 能明顯降低促炎性細胞因子IL-6、白細胞介素-8（Intеrlеukin-8，IL-8）、TNF-及環(huán)氧合酶（COX-2）的表達，通過協(xié)同誘導促進豬M1 型巨噬細胞的極化，增強巨噬細胞的巨噬功能，并抑制大腸桿菌對巨噬細胞的黏附與入侵?？咕目梢酝ㄟ^TLRs 發(fā)揮免疫調(diào)控作用，TLRs 是無脊椎動物和脊椎動物先天性免疫系統(tǒng)的關鍵調(diào)節(jié)因子，能激活核轉錄因子NF-B 信號。Cathеlicidins可抑制TLR4 而不是TLR2 介導的樹突細胞成熟和細胞因子釋放，這種抑制與細胞膜功能和結構的改變有關，Cathеlicidins通過在細胞膜上的活性來介導抗炎作用。Ho 等試驗發(fā)現(xiàn)，在盲腸結扎穿孔法（CLP）誘導的多菌敗血癥中，內(nèi)源性Cathеlicidins 抗菌肽LL-37可調(diào)節(jié)中性粒細胞和巨噬細胞的浸潤，通過KEGG 和Rеactomе 途徑驗證發(fā)現(xiàn)，Cathеlicidins 的減少會加大促炎反應，易發(fā)生敗血癥；維生素D 能促進宿主防御肽的合成，同時發(fā)現(xiàn)經(jīng)過維生素D預處理的小鼠Cathеlicidins 表達上調(diào)，說明使用1,25-二羥基維生素D（1,25-D）能夠幫助機體產(chǎn)生Cathеlicidins，從而預防敗血癥的發(fā)生。Zong 等研究發(fā)現(xiàn)，豬乳鐵蛋白微生物肽LFP-20 通過抑制MyD88/NF-B 和MyD88/MAPK 信號通路來防止LPS 誘導的炎癥反應，并闡明LFP-20 在LPS 介導的敗血癥治療中的潛在用途。綜上所述，抗菌肽可能通過多種途徑來調(diào)節(jié)機體的免疫功能，調(diào)節(jié)機制如圖2 所示。

圖2 抗菌肽對免疫功能的調(diào)節(jié)機制

4.3 抗菌肽對斷奶仔豬腸道健康的調(diào)控作用 動物腸道及呼吸道的上皮細胞均會分泌抗菌肽，抗菌肽不僅對免疫功能發(fā)揮著調(diào)節(jié)作用，還能通過增強腸道屏障功能來發(fā)揮保障腸道健康的作用。腸道健康與仔豬腹瀉密切相關，是仔豬生長發(fā)育的核心和快速生長的基礎。腸道健康受腸上皮細胞、腸黏液層、腸黏膜免疫系統(tǒng)、腸道正常微生物群等共同影響。易宏波發(fā)現(xiàn)，抗菌肽CWA通過下調(diào)TLR4-MyD88-NF-B 信號通路和增強巨噬細胞巨噬功能來緩解腸道炎癥，同時通過Rac1 途徑的調(diào)控使豬空腸上皮細胞緊密連接蛋白Occludin 和ZO-1 表達提高，從而改善腸道上皮屏障功能。Sun 等研究發(fā)現(xiàn)，腸道分泌的內(nèi)源性抗菌肽血管生成素（ANG）通過維持腸道菌群的平衡來維持腸道健康方面的新作用，表明ANG-微生物軸可通過維持腸道微生物的體內(nèi)平衡，來減輕葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導小鼠結腸炎（IBD）的嚴重程度。同時，在腸黏膜免疫系統(tǒng)中，漿細胞分泌的sIgA 是黏膜免疫系統(tǒng)反應過程的關鍵步驟，主要是調(diào)節(jié)吞噬作用，溶解細菌，介導抗體依賴性細胞介導的細胞毒（ADCC）作用?？咕牡囊粋€重要功能是建立宿主-微生物體內(nèi)平衡，抗菌肽通過為腸道菌群創(chuàng)造有利環(huán)境對腸道有益菌的增長有促進作用，同時會抑制腸道內(nèi)有害菌的生長來改善腸道菌群結構，對斷奶應激導致的腸道功能紊亂具有緩解作用（表2）。由此可見，抗菌肽可通過影響腸道菌群、腸道屏障功能、腸黏膜免疫系統(tǒng)來發(fā)揮維持腸道健康的作用。

表2 抗菌肽對斷奶仔豬腸道微生物的作用效果

4.4 抗菌肽對斷奶仔豬氧化應激的調(diào)控作用 仔豬在斷奶的影響下容易造成氧化應激，機體的防御系統(tǒng)受到損害。機體總抗氧化能力（T-AOC）是用于衡量機體抗氧化系統(tǒng)功能狀況的綜合性指標，可反映機體抗氧化能力的高低，由酶促抗氧化系統(tǒng)（包括超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶等抗氧化酶）和非酶促抗氧化系統(tǒng)（包括維生素E、谷胱甘肽、維生素C、氨基酸和金屬蛋白等）組成?？咕膶徑鈹嗄套胸i的氧化應激有積極作用?？咕膶ψ胸i的氧化應激調(diào)控可能是因為抗菌肽可影響氧自由基對生物膜的攻擊，減少脂質(zhì)過氧化物的形成，保證細胞膜結構和功能的完整性。Xiao 等研究發(fā)現(xiàn)，斷奶仔豬日糧中添加0.4% 的抗菌肽CAP（包括牛乳鐵蛋白、植物防御素和活性酵母）可以緩解由嘔吐毒素（DON）導致的氧化損傷，降低血清過氧化氫（HO）和一氧化氮（NO）、血漿丙二醛（MDA）水平。

5 小結與展望

抗菌肽具有很多優(yōu)良的特性，在畜禽養(yǎng)殖、食品加工、醫(yī)藥開發(fā)及植物抗性等方面均有廣泛應用。抗菌肽的廣譜抗菌活性和破膜機制凸顯了其作為替抗的前景，在畜禽生產(chǎn)中是理想的抗生素替代物。但抗菌肽在研發(fā)過程中也面臨著一些挑戰(zhàn)：一是來源問題，天然抗菌肽含量低，且分離工藝復雜，基因表達工程表達量低，人工合成的抗菌肽在結構上可能會與天然抗菌肽存在一些差異，且成本高；二是在機體內(nèi)穩(wěn)定性問題，抗菌肽在機體內(nèi)易被動物腸道的胰蛋白酶和多肽酶降解，無法到達后腸發(fā)揮其生物活性；三是對腸道微生態(tài)造成新的不平衡問題，天然抗菌肽具有廣譜的抗菌活性，但靶向性差，在腸道內(nèi)既殺有害菌，也殺有益菌，對腸道微生態(tài)造成新的不平衡；四是某些天然抗菌肽的活性不高，對細胞存在較高的毒性。

目前通過將大數(shù)據(jù)與抗菌肽活性改造技術相結合建立的抗菌肽構效關系理論體系，是提高抗菌肽的抗菌活力的有效方式。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，對抗菌肽的分子改造是目前研究的熱點，通過納米技術誘導兩親性抗菌肽自組裝形成納米組裝體、利用包被技術、利用特殊氨基酸規(guī)避酶切位點等方法得到的抗酶解抗菌肽，對蛋白酶比較穩(wěn)定，能抵抗體內(nèi)各種酶的水解。同時，內(nèi)源性抗菌肽的表達調(diào)控也是近年研究較多的內(nèi)容。通過體外合成可尋找到關鍵的內(nèi)源性抗菌肽，通過添加部分功能性物質(zhì)（如短鏈脂肪酸、氨基酸、益生菌等）刺激機體自身分泌內(nèi)源性抗菌肽也是一種好的方式。未來仍需深入探究抗菌肽的分子改造、科學合成及高效低成本的生產(chǎn)工藝，建立真核表達系統(tǒng)，對目標抗菌肽進行高效表達，實現(xiàn)抗菌肽的量化制備，推廣其在畜牧業(yè)的應用，保障動物性食品安全與人類健康。