人參皂苷Rg1對大鼠海水淹溺性肺損傷的保護作用及其機制

田 冶，葛帥娜，李 軍，陶天柱

全世界每年因淹溺死亡的人數(shù)達40萬以上，因海水淹溺而死亡的人數(shù)居意外死亡人數(shù)的第三位。人體吸入海水后，可迅速導(dǎo)致劇烈的肺部炎性反應(yīng)，由此產(chǎn)生海水吸入性肺損傷(seawater induced acute lung injure, SW-ALI)，其病情危重，進展快，病死率高。盡管器官保護治療技術(shù)取得不斷進步，但目前臨床上對SW-ALI的救治仍然缺乏有針對性的有效措施，其死亡率仍居高不下。人參皂苷Rg1是從人參中提取的一種主要有效成分，在多種炎性疾病中發(fā)揮抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)細胞凋亡等保護作用。本研究以大鼠建立海水淹溺性肺損傷模型，通過呼吸功能、氧化應(yīng)激和炎性指標(biāo)的測定，探討人參皂苷Rg1對海水淹溺性肺損傷的保護作用及可能的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和材料 健康6周齡雄性SD大鼠，體重200～240 g(解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學(xué)中心實驗動物中心)。實驗海水(海南三亞，東經(jīng)109°，北緯18°)Na310 mmol/L，K7.1 mmol/L，Mg9.16 mmol/L，Ca9.0 mmol/L, Cl365 mmol/L，pH 8.2)Bradford試劑盒和MPO試劑盒(南京建成)，ELISA試劑盒(美國R&D)。

1.2 動物分組和動物模型制備 128只SD大鼠按照隨機數(shù)字表法分為4組，每組32只：空白對照組(C組)、生理鹽水對照組(S組)、低劑量人參皂苷Rg1(20 mg/kg)治療組(L組)、高劑量人參皂苷Rg1(100 mg/kg)治療組(H組)。吸入海水前2 h，L組和H組經(jīng)尾靜脈注射人參皂苷Rg1(20 mg/kg或100 mg/kg)200 μl，S組注射等容生理鹽水200 μl。實驗大鼠禁食水12 h，采用腹腔注射戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉，仰臥位固定。頸前區(qū)暴露氣管后切開，插入氣管導(dǎo)管，分離股動脈插入連接三通的套管針以備取血。以4 ml/kg劑量在氣管內(nèi)滴注海水，4 min內(nèi)完成。灌注后大鼠即刻出現(xiàn)呼吸困難，口唇發(fā)紺，經(jīng)氣管插管噴出粉紅色泡沫樣液體，雙肺滿布濕啰音，動脈血氣PaO<60 mmHg提示造模成功。80只大鼠(每組20只)用于檢測血氣、生化及病理等指標(biāo)，48只(每組12只)大鼠單獨用于觀察生存期。

1.3 觀察指標(biāo) 分別于吸入海水前(T)，吸入海水后30 min(T)、1 h(T)、2 h(T)和4 h(T)抽取股動脈血0.3 ml檢測動脈氧分壓(PaO)、動脈二氧化碳分壓(PaCO)；肺泡灌洗液離心后取上清，蛋白測定按照Bradford試劑盒嚴格操作，髓過氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)測定按照試劑盒說明操作，比色法計算結(jié)果；吸入海水后2 h和4 h每組各取5只大鼠，心臟采血處死后取出肺組織標(biāo)本，用ELISA試劑盒測定血漿中TNF-α、IL-1β、IL-6含量和左肺上葉肺組織勻漿MDA、SOD濃度；左肺下葉經(jīng)甲醛溶液固定48 h后，石蠟包埋后切片，蘇木精-伊紅(HE)染色后在顯微鏡下檢查；取右肺稱重后為濕重，置于70 ℃電熱恒溫干燥箱中烤48 h，稱重為干重，干重與濕重之比為肺干濕重比 (W/D) ；記錄各組大鼠4 h的存活率。

2 結(jié) 果

2.1 海水淹溺大鼠氧合指標(biāo) 與C組相比，海水淹溺大鼠在建模后30 min時PaO顯著降低，PaCO顯著升高，隨后PaO輕度升高且PaCO有所降低。T時3組的動脈血PaO、PaCO差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。T～T時S和L組PaO明顯低于H組(<0.05)，S和L組PaCO明顯高于H組(<0.05，表1)。

表1 海水淹溺組和對照組大鼠不同時間PaO2和PCO2的變化

2.2 肺泡灌洗液蛋白含量和肺組織濕干重比 與對照組相比，海水淹溺組大鼠的肺泡灌洗液蛋白定量(BALF)和肺組織濕干重比明顯增高，2 h和4 h時，H組上述指標(biāo)均明顯低于S組和L組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均<0.05，表2)。

2.3 氧化應(yīng)激反應(yīng)和外周血炎性因子 與對照組相比，海水淹溺組大鼠肺組織中MDA和MPO濃度顯著升高，SOD活性則明顯下降，血清中炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平表達顯著升高，提示肺組織內(nèi)氧化應(yīng)激損傷和全身的炎性反應(yīng)激活。與S組相比，H組肺組織中MDA、MPO和細胞因子的表達水平均明顯降低，而SOD的活性顯著升高(均<0.05，表2)。

表2 各組大鼠肺泡灌洗液蛋白定量、濕/干比、氧化應(yīng)激和外周血炎癥因子指標(biāo)的比較

2.4 大鼠肺組織病理 吸入海水4 h后不同組大鼠肺組織病理切片，可見S組和L組肺間質(zhì)水腫、出血，肺泡塌陷，并有大量炎性細胞浸潤。H組肺組織結(jié)構(gòu)尚清晰，滲出明顯減少，炎性浸潤也較前兩組有明顯減輕(圖1)。

圖1 各組大鼠建模4 h后的肺組織病理表現(xiàn)(HE，×100倍)

2.5 大鼠生存期 C組、S組、L組和H組分別死亡0、9、7、3只，死亡率依次為0、75.0%、58.3%和25.0%(=12只/組)。與S組相比，H組大鼠死亡率明顯降低(<0.05)，L組與S組相比無統(tǒng)計學(xué)差異。

3 討 論

海水由于高滲與堿性的特點，其所造成的肺損傷更容易出現(xiàn)低氧血癥和酸中毒，并可發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)，救治難度極大。海水吸入后可以直接損傷肺泡內(nèi)皮細胞，破壞肺泡毛細血管屏障，導(dǎo)致肺泡和肺間質(zhì)滲出水腫，同時激活炎癥的級聯(lián)放大效應(yīng)，引起局部和全身的炎性反應(yīng)綜合征。目前針對SW-ALI的治療方法主要有肺泡灌洗、糖皮質(zhì)激素、吸入肺泡表面活性物質(zhì)和器官功能支持治療等，但整體的救治存活率仍然較低。本研究發(fā)現(xiàn)，在氣管內(nèi)注入海水后，大鼠很快出現(xiàn)呼吸急促，氣道內(nèi)產(chǎn)生大量泡沫樣痰，血氣結(jié)果提示氧分壓降低，CO分壓明顯升高，其原因可能是海水刺激引起氣道痙攣，同時氣道分泌物阻塞導(dǎo)致通氣功能障礙，出現(xiàn)Ⅱ型呼吸衰竭。隨著氣道分泌物逐漸減少，大鼠通氣功能改善，CO分壓進行性降低而氧分壓逐漸升高。在大鼠肺臟病理檢測中觀察到肺間質(zhì)的水腫、肺泡塌陷、炎性細胞浸潤，提示肺內(nèi)可能存在通氣血流比例失調(diào)和分流存在，這與血氣指標(biāo)中持續(xù)性的低氧血癥結(jié)果一致。

人參皂苷Rg1為四環(huán)三萜類衍生物，具有抗氧化應(yīng)激、抗炎癥反應(yīng)、抗纖維化和神經(jīng)保護作用等功效。Rg1可以清除心臟、腎臟缺血再灌注損傷中產(chǎn)生自由基，保護內(nèi)源性SOD的活性。Rg1還可通過阻斷 TLR4/NF- κB/NLRP3通路減輕脂多糖誘導(dǎo)的新生大鼠心肌細胞和膿毒癥小鼠的炎性反應(yīng)和凋亡，恢復(fù)受損的心功能。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rg1可以減輕小鼠膿毒癥所致的肺組織損傷，抑制機體炎性反應(yīng)，減少淋巴細胞的凋亡，顯著改善膿毒癥小鼠的生存期。在肝缺血再灌注模型中我們發(fā)現(xiàn)，Rg1可以顯著減少肝細胞的壞死和凋亡，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，減輕肝臟局部和全身的炎性反應(yīng)。

本實驗結(jié)果顯示，與對照組比較，高劑量Rg1能顯著提升SOD活性，并降低肺組織內(nèi)MDA濃度和MPO活性，明顯改善海水吸入后 30、60、120 min的氧合功能，提示Rg1能抑制海水對肺組織的氧化應(yīng)激損傷，減輕肺組織內(nèi)滲出水腫，從而改善大鼠的生存期。SOD是一種重要的抗氧化酶，可與過氧化物酶和催化酶一起可消除活性氧(ROS)。MPO屬于血紅素蛋白，富含于中性粒細胞中，在殺滅微生物和調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)發(fā)揮作用。MDA是生物體脂質(zhì)過氧化的代謝產(chǎn)物，也是機體氧化應(yīng)激的重要標(biāo)志物。本研究中模型組內(nèi)大量炎性細胞浸潤與MPO表達升高相吻合，提示中性粒細胞募集活化釋放氧自由基參與肺損傷的發(fā)生。TNF-α、IL-1β和IL-6是重要的促炎性細胞因子，主要由巨噬細胞和中性粒細胞產(chǎn)生。通過Toll樣受體、RIG-1受體或NOD樣受體等模式識別受體，激活胞內(nèi)的炎性反應(yīng)信號通路，使細胞因子分泌增加。促炎性因子進一步活化肺內(nèi)皮細胞、上皮細胞和白細胞，誘導(dǎo)肺內(nèi)瀑布炎性反應(yīng)的發(fā)生，因此抑制炎性因子的表達可以減輕肺組織損傷。與既往研究一致，本研究發(fā)現(xiàn)Rg1呈劑量依賴性抑制炎性因子的表達，從而減輕肺組織損傷，提高海水淹溺大鼠的存活率。

人參皂苷Rg1潛在的分子受體可能包括糖皮質(zhì)激素受體和雌激素受體，抗炎抗氧化功能與Nrf2/HO-1、NF- NF- κB和Ampk等信號通路相關(guān)，具有抗炎抗氧化且不良反應(yīng)小等特點，隨著研究的不斷深入，Rg1的藥物研發(fā)與臨床應(yīng)用將具有廣闊的前景。