外泌體多角度調(diào)節(jié)骨平衡治療骨質(zhì)疏松癥的研究進(jìn)展

李 寧，王小強(qiáng)△，謝興文，徐世紅，姜朝陽，李 輝，張旭明

（1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省第二人民醫(yī)院，甘肅 蘭州 730030；3.西北民族大學(xué)附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730030；4.甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050）

“骨質(zhì)疏松癥”一詞的意思是“多孔骨”，實(shí)際上是一種世界性的高發(fā)性代謝性骨病。其特點(diǎn)是骨量減少，骨脆性增加，微結(jié)構(gòu)骨組織惡化。它的發(fā)生是由于骨形成和骨吸收之間的不平衡。雖然在所有種族、性別和年齡群體中都有發(fā)現(xiàn)，但多見于女性和老年人。直至提出這是一種由于輕微中風(fēng)導(dǎo)致的骨折的疾病之后，才有了骨質(zhì)疏松這一解釋。它被認(rèn)為是與骨折和其他嚴(yán)重的次要健康問題有關(guān)的最常見的人類疾病之一。根據(jù)國家骨質(zhì)疏松癥基金會（NOF）最近的報告，全世界50歲以上的人群中，每2名女性和1/4的男性在他們的余生中會因骨質(zhì)疏松癥而發(fā)生骨折。目前治療骨質(zhì)疏松癥癥狀主要是藥物治療，如六味地黃丸、補(bǔ)骨脂素等。雖然這些藥物治療取得了一定的效果，但沒有一種治療方法是完全令人滿意的，迫切需要一種新的高效、快速的治療技術(shù)。為了彌補(bǔ)這一不足，目前的研究引入了基因靶向治療，主要集中于靶向骨骼干細(xì)胞和成骨細(xì)胞的功能，已證實(shí)其能有效促進(jìn)骨形成[1]。間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）的成骨分化和外泌體對于骨質(zhì)疏松癥的治療具有重要意義。

1 間充質(zhì)干細(xì)胞及其外泌體的現(xiàn)代研究

間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal Stem Cells,MSCs）是一種多功能的基質(zhì)細(xì)胞，具有在體內(nèi)外分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞的能力；是一種具有多種功能的干細(xì)胞，具有多分化潛能和免疫調(diào)節(jié)作用，可有效延長移植物的生存時間，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，從而促進(jìn)組織修復(fù)[2-3]。間充質(zhì)干細(xì)胞向成熟成骨細(xì)胞的募集、增殖和分化受到多種因素的調(diào)控，包括細(xì)胞因子、全身激素、生長因子和其他調(diào)節(jié)因子。自噬可促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的產(chǎn)生，是一種必要的細(xì)胞代謝途徑，在饑餓或氧化應(yīng)激刺激下，通過清除受損的大分子和細(xì)胞器來維持細(xì)胞質(zhì)內(nèi)穩(wěn)態(tài)，維持細(xì)胞的生存和生長[4-5]。自噬在惡劣條件下通過清除活性氧（ROS），幫助細(xì)胞成分循環(huán)，促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨，維持骨重塑[6-7]。SATB2是一種特異的成骨細(xì)胞分化的免疫組化生物標(biāo)志物，已被證明對骨和軟組織腫瘤[8]都有用。有證據(jù)表明SATB2與間充質(zhì)干細(xì)胞功能、成骨活性和骨質(zhì)疏松癥密切相關(guān)[9-11]。這就意味著可通過SATB2調(diào)節(jié)間充質(zhì)干細(xì)胞功能、成骨活性，從而治療骨質(zhì)疏松。最近，人們發(fā)現(xiàn)MSCs通過分泌生長因子等小顆粒介導(dǎo)的旁分泌作用發(fā)揮其治療作用。MSCs釋放的胞外囊泡（Extracellular vesicles,EVs）參與了組織再生，并參與了MSCs的旁分泌作用。

外泌體是大多數(shù)細(xì)胞類型（如MSCs、樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞、B細(xì)胞、T細(xì)胞等）分泌的EVs中最小的亞群。它們也可以在大多數(shù)體液中被識別，包括血液、尿液、羊水、血清等。和細(xì)胞一樣，外泌體由脂質(zhì)雙分子層組成，可以包含許多細(xì)胞的分子成分，如蛋白質(zhì)、miRNAs、DNA等。目前，分離外泌體最常用的方法包括超離心法和免疫珠分離。通過電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)外泌體是囊泡，呈球形或特殊的杯狀形態(tài)[12-13]。EV是包膜的囊泡，有幾種不同的囊泡形式。哺乳動物細(xì)胞可以釋放不同類型的EV。主要類型包括凋亡小體、微泡和外泌體。外泌體是EV的主要亞類之一，具有內(nèi)泌體起源。外泌體是小的（301 00 nm）細(xì)胞外納米大小的囊泡，起源于多種細(xì)胞類型中多囊體的內(nèi)部囊泡，如腫瘤細(xì)胞、t細(xì)胞、肥大細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等。最近的研究發(fā)現(xiàn)，外泌體在一些疾病如炎癥性疾病、心血管疾病、代謝性和神經(jīng)退行性疾病等方面具有多種多樣的治療應(yīng)用。外泌體作為特化的膜囊，保護(hù)miRNA不被降解，并將其在細(xì)胞間轉(zhuǎn)移以調(diào)節(jié)細(xì)胞間的信息傳遞。

2 骨質(zhì)疏松癥病因及其與MSCs衍生外泌體的聯(lián)系

骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機(jī)制是骨形成的功能損害，這是一個比較傳統(tǒng)的說法。然而，骨質(zhì)疏松癥的病因復(fù)雜，并不單一：破骨細(xì)胞骨吸收和成骨細(xì)胞骨形成之間的不平衡;成骨分化減少；脂肪分化增加等因素皆可引起該病。骨質(zhì)疏松癥與血管生成也密切相關(guān)。從動物、細(xì)胞和患者的研究中積累的證據(jù)表明，局部血供或血管生成的減少有助于骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生。此外，miRNAs介導(dǎo)機(jī)制的解除也成為骨質(zhì)疏松癥[14]等骨相關(guān)疾病的重要病理因素。骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機(jī)制與成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞活性失衡有關(guān)。由于成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞具有共同的前體，在衰老過程中，MSCs的細(xì)胞系向骨髓中的脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥。

MSCs的數(shù)量多少決定著所分化的子細(xì)胞的數(shù)目，而MSCs分化是一個復(fù)雜的過程;許多因素影響間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞或脂肪細(xì)胞的分化，以及骨質(zhì)疏松條件下的骨形成。所謂骨質(zhì)疏松癥與血管生成密切相關(guān)，筆者認(rèn)為其本質(zhì)是MSCs衍生的外泌體對血管生成起著決定性作用。此外，MSCs衍生外泌體還可通過調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞間接治療骨質(zhì)疏松。

3 多角度調(diào)節(jié)骨穩(wěn)態(tài)

3.1 外泌體的成骨與破骨作用

Ma等[15]的研究表明，從生物結(jié)構(gòu)上講，間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化是骨質(zhì)疏松癥治療的關(guān)鍵。MSCs對于骨質(zhì)疏松癥患者可起到直接或間接的作用。Yang[16]等研究發(fā)現(xiàn)LncRNA MALAT1由骨髓源間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌體穿梭，通過介導(dǎo)microRNA-34c/SATB2軸減輕骨質(zhì)疏松癥；Corrado等研究的一項關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)表明，BMSCs-derived的外泌體轉(zhuǎn)移相關(guān)肺腺癌轉(zhuǎn)錄本1（MALAT1）可能促進(jìn)成骨細(xì)胞活性。外泌體能夠主動地在miRNAs、蛋白質(zhì)和mRNA之間運(yùn)輸和傳遞信息到靶細(xì)胞，從而影響其行為，強(qiáng)烈地改變整個微環(huán)境。Sun等[17]的研究表明來自破骨細(xì)胞的含miRNA的外泌體選擇性地抑制成骨細(xì)胞活性，使得成骨細(xì)胞數(shù)目大于破骨細(xì)胞。研究表明[18-19]，成骨細(xì)胞來源的外泌體調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞活性，外泌體在骨微環(huán)境和骨代謝中發(fā)揮作用。

有研究結(jié)果表明，來自骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的外泌體miR-31a-5p通過靶向RhoA的30UTR并抑制其活性來促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化，由外泌體包裝的BMSC來源的miR-31a-5p不僅影響成骨分化，而且通過外泌體在細(xì)胞之間的穿梭影響破骨分化。這一雙重調(diào)控表明，miR-31a-5p在衰老過程中的骨形成和骨吸收中起著重要的調(diào)節(jié)作用。MSCs來源的外泌體在骨質(zhì)疏松癥治療中的作用骨形成是骨質(zhì)疏松癥發(fā)病的關(guān)鍵過程，促進(jìn)骨形成對骨質(zhì)疏松癥的治療具有重要意義。MSCs來源的外泌體可增強(qiáng)體外rBMSCs-OVX成骨細(xì)胞ALP活性，上調(diào)成骨細(xì)胞基因mRNA和蛋白表達(dá)。同時，MSCs衍生的外泌體也可以刺激去卵巢大鼠中臨界大小顱骨缺損的骨再生。此外，間充質(zhì)干細(xì)胞衍生的外泌體可與I型膠原、纖維連接蛋白等基質(zhì)蛋白結(jié)合，并誘導(dǎo)體外和體內(nèi)的成骨細(xì)胞分化。有趣的是，除了MSCs來源的外泌體外，當(dāng)與-TCP支架結(jié)合時，TCP的成骨活性可以通過激活PI3K/Akt信號通路而增強(qiáng)。考慮到MSCs來源的外泌體在體內(nèi)和體外的成骨能力，來自MSCs的外泌體可能是有希望改善骨骼疾病如骨質(zhì)疏松癥的骨形成的囊泡。

3.2 外泌體促血管生成繼而促進(jìn)骨再生

血管生成是從原有的血管中萌發(fā)出新的血管的過程。越來越多的證據(jù)表明，局部血供或血管生成減少在骨質(zhì)疏松中起重要作用。因此，促進(jìn)血管生成是促進(jìn)骨質(zhì)疏松性骨再生的基本策略。各種研究已經(jīng)證明了MSCs衍生的外泌體對血管生成關(guān)鍵步驟的影響。有發(fā)現(xiàn)hiPSC-MSCs來源的外泌體可直接促進(jìn)HUVECs成纖維細(xì)胞的血管生成和膠原合成。同樣，另一項研究得出結(jié)論，MSCs衍生的外泌體可以激活血管生成相關(guān)的分子表達(dá)（如PGF），促進(jìn)HUVECs遷移和管形成。此外，血管生成在許多生理過程中起著至關(guān)重要的作用，它需要內(nèi)皮細(xì)胞與周圍環(huán)境的緊密相互作用。MSCs來源的外泌體可能通過靶向治療。MSCs來源的外泌體可以通過促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞尖端細(xì)胞的形成來調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成?？傊?，MSCs來源的外泌體作為促血管生成因子可能是治療骨質(zhì)疏松癥的一個有希望的候選因子。

3.3 MSCs源性脂肪細(xì)胞調(diào)節(jié)骨關(guān)系

在骨髓中，成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞有一個共同的前體細(xì)胞MSCs。積累的信息表明，骨質(zhì)疏松癥使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的命運(yùn)偏向于脂肪細(xì)胞而不是成骨細(xì)胞，并隨著骨髓脂肪的堆積而減少骨量。Martin等人發(fā)現(xiàn)，人間充質(zhì)干細(xì)胞（HMSCs）來源的脂肪細(xì)胞可以分泌包含成脂特異性mRNA（如瘦素、ppparg、CEBPa和CEBPd轉(zhuǎn)錄本）和抗成骨miRNAs（miR30c,miR-31,miR125a,miR-125b,miR-138）的外泌體，并可轉(zhuǎn)移到MSCs來源的成骨細(xì)胞。MiR-30c和miR-31靶向成骨轉(zhuǎn)錄本RUNX2和Osterix，調(diào)節(jié)成骨分化。miR-125a和miR125b在人脂肪源性干細(xì)胞成骨分化過程中顯著下調(diào)。miR-138調(diào)節(jié)hMSCs的成骨分化，過表達(dá)miR-138減少骨形成[20]。由于miR-30c、miR-31、miR-125a、miR-125b和miR-138具有抑制成骨細(xì)胞基因表達(dá)的能力，本研究中miR-30c、miR-31、miR-125a、miR-125b和miR-138的表達(dá)均有所增加。這些結(jié)果可能暗示外泌體中的miRNA可能抑制成骨分化。這些發(fā)現(xiàn)表明，MSCs來源的外泌體可能是骨質(zhì)疏松癥治療中調(diào)控成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞之間關(guān)系的靶成分。

3.4 外泌體調(diào)節(jié)免疫達(dá)到骨穩(wěn)態(tài)

骨修復(fù)的過程需要炎癥反應(yīng)，因為免疫系統(tǒng)會對多種細(xì)胞因子做出反應(yīng)，這些細(xì)胞因子招募并激活多種類型的細(xì)胞，如MSCs，以促進(jìn)骨形成。據(jù)報道，MSCs分泌的外泌體有助于免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)。炎癥失調(diào)導(dǎo)致骨吸收增加和骨形成抑制。T細(xì)胞已被確定為不同疾病（如骨質(zhì)疏松癥）中破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞形成及活性的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。MSCs來源的外泌體對T細(xì)胞的分化、增殖和激活具有抑制作用：MSCs來源的外泌體可能調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)并影響骨代謝，提示MSCs來源的外泌體在無細(xì)胞治療骨質(zhì)疏松癥中的潛在臨床應(yīng)用。

4 總結(jié)與展望

人類骨骼是一個代謝活躍的組織，在整個生命過程中經(jīng)歷不斷的更新和重塑。在穩(wěn)態(tài)條件下，成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨再生和破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收之間存在微妙的平衡。這一過程的異?？僧a(chǎn)生多種骨骼疾病。使用MSCs衍生的外泌體有幾個優(yōu)勢。第一，避免了可能導(dǎo)致DNA突變或損壞的細(xì)胞的轉(zhuǎn)移;第二，囊泡較小且易于循環(huán)；第三，外泌體不含MHCI蛋白，可以克服細(xì)胞移植治療的一些缺點(diǎn)；第四，MSCs來源的外泌體不像細(xì)胞那么復(fù)雜，因此它們更容易產(chǎn)生，也有可能避免一些在MSCs中面臨的調(diào)控問題。綜上所述，MSCs衍生的外泌體可能在不久的將來成為治療骨質(zhì)疏松癥等骨骼疾病的理想工具。