鹽馴化對3個辣椒品種的高鹽耐受性研究

杜希寬，李士叢，袁星星，蔡振曄，顧和平，陳 新

（1.江蘇省劍豐農業(yè)實業(yè)有限公司，江蘇 大豐 224100；2.江蘇省農業(yè)科學院 經濟作物研究所，江蘇 南京 210014）

0 前言

土壤鹽漬化是一個世界性的環(huán)境生態(tài)問題和農業(yè)資源問題［1］。環(huán)境脅迫嚴重影響著植物的生長發(fā)育，造成作物產量的逐年下降，因此對植物在各種脅迫下的耐受力和適應性機制的研究一直是學者們關注的熱點［2］。隨著科技的迅猛發(fā)展，城市化進程的不斷加快，人類所擁有的有效耕地面積正在快速減少，盡可能減緩現有土地的鹽漬化、加快開發(fā)和利用原有的鹽堿土［3］、選育耐鹽的農作物品種等，是近年來學者們研究的重點課題［4］。

選育耐鹽作物品種，可以有效提高部分作物的耐鹽性，使一些鹽分含量不算高的土壤能夠適于作物栽培［5］。通過馴化技術，對部分作物在生長早期進行耐鹽性馴化，提高這些作物體內的耐鹽基因表達量，也可以提高部分作物的耐鹽性［6］。尤其是對需要育苗移栽的作物，可以在育苗階段對幼苗進行耐鹽性馴化，并激活其體內耐鹽高表達基因，就有可能將被處理作物的耐鹽性提高到一定比例，進而提高部分中度鹽堿地的利用率［1］。高鹽脅迫下可以通過表型分析初步篩選出耐鹽植株，趙成等［7］研究發(fā)現，擬南芥At5g66070基因純合突變體在高鹽處理下其萌發(fā)率比野生型低，根長比野生型要短，幼苗更易枯萎。郭雁君等［8］研究認為，鹽脅迫下砂糖橘株高生長受到的抑制最明顯，地徑和冠幅生長受到的抑制次之，對植株生物量積累的影響來說，葉生物量受到的影響最明顯，比根生物量積累受到的影響要大。

通過檢測植物在逆境脅迫下葉綠素熒光參數可以判斷植物受脅迫傷害的程度［9］，在水稻的耐鹽性試驗中發(fā)現，最大光能轉化效率(Fv/Fm)、最大熒光產量(Fm)、實際光化學量子產量(Y)和非光化學熒光猝滅系數(NPQ)與水稻鹽脅迫高度相關，NPQ和Fv/Fm在耐鹽品種中具有關鍵作用［10-11］。同低鹽處理相比，高鹽脅迫的茅蒼術光化學猝滅系數(qP)下降，非光化學熒光猝滅系數升高［12］。在鈉鹽(150 mmol/L)處理下，小麥的最大光化學效率等葉綠素熒光參數顯著下降，并且低鹽有效緩解了小麥幼苗的鹽害，高鹽增強了鹽的毒害作用［13］，由此可知，對作物的低脅迫馴化有助于提高作物對非生物脅迫的耐受性，煙草經低溫馴化后與非低溫馴化的煙草相比，受冷脅迫其葉片Y、NPQ顯著降低［14］。

以上研究表明，通過檢測葉片的葉綠素熒光參數可以判別作物的生長發(fā)育以及應對逆境脅迫等生理響應，例如經過殼聚糖處理后的小麥幼苗的Fv/Fo、qP和熒光衰減率(Rfd)值分別增加了11.0%、18.6%和14.7%，而NPQ明顯降低，這可能導致光利用效率的提高和小麥幼苗的顯著快速生長［15］。堿脅迫下，番茄SlSAMS1基因的過表達使轉基因植株的凈光合速率、葉綠素濃度、Fv/Fm和ΦPSⅡ與野生型相比顯著升高［16］。在鹽、干旱和堿脅迫下大麥幼苗的最大光化學效率和光化學猝滅系數均降低,表明以上脅迫都增加了PSⅡ對光抑制的敏感性，通過降低光化學吸收降低了光合活性，增加了PSⅡ反應中心的活性強度［17］。有研究發(fā)現，耐鹽大白菜品種在鹽脅迫下其PSⅡ最大光化學量子產率和非光化學猝滅均無顯著影響［18］，這為進一步研究作物耐鹽品種奠定了基礎。銅脅迫下矮牽?；≒SⅡ的最大光化學效率、非光化學猝滅系數和光化學猝滅系數顯著降低［19］。

本文以辣椒為研究對象，通過對3個鹽敏感程度不同的品種進行不同梯度的鹽馴化，檢測了辣椒的株高、分枝數、開花數和葉綠素熒光參數等指標，旨在篩選出最佳的辣椒鹽馴化濃度，以提高辣椒在大田生長環(huán)境下的抗鹽性。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試品種分別為安徽蕭縣陽光椒業(yè)技術發(fā)展有限公司生產的雜交種天艷008（簡稱1號品種），安徽六安市農百萬種業(yè)有限公司生產的雜交種超級薄皮王和薄皮玉尊（分別簡稱3號品種和5號品種）。試驗前，先對購自市場上的20個辣椒品種進行了預備試驗，遴選出對鹽分具有不同抗性水平的種質。NaCl來自廣東汕頭市西隴科學股份有限公司生產的氯化鈉分析純，有效成分大于99.5%。

1.2 試驗設計

試驗于2022年4—9月在江蘇南京進行。先將種子進行表面殺菌處理，然后在普通塑料大棚內采用普通育苗基質育苗。育苗前，對基質進行反復攪拌，確?；|內含物充分混合，保證試驗過程和方法的一致性。每個品種育苗150株，合計450株，共栽培150盆。每個試驗小區(qū)選取3株幼苗進行最終數據測量，每個處理重復3次，以減少試驗誤差。育苗后20 d，苗高15～16 cm，開始進行鹽分馴化。先將幼苗從穴盤內取出，將根系攜帶的基質全部沖洗干凈，裝入邊長為6.5 cm的臺形育苗塑料缽，每個營養(yǎng)缽裝3株苗，分別置于0、30、60、90和120 mmol/L濃度為0.3%的Hoagland溶液中，進行鹽分馴化處理，處理時間為120 h。然后將所有處理的幼苗根系沖洗干凈，置于濃度為0.3%的Hoagland溶液中恢復生長72 h。最后移栽到蛭石水培箱中，水培箱的溶液為0、100和200 mmol/L高濃度NaCl溶液和濃度為0.3%的Hoagland溶液的混合液，對馴化后的幼苗進行高鹽脅迫處理。

1.3 試驗數據采集

馴化結束后，使用FluorCam多光譜熒光成像儀器（產自捷克）對所有被馴化處理的辣椒幼苗進行葉綠素熒光猝滅分析［20］，先將供試植株放置于暗室內30 min，然后進行葉綠素熒光成像和數據分析，最后使用GraphPad Prism 8軟件進行數據處理。辣椒幼苗的主要表型數據在高濃度鹽脅迫處理結束后立即進行采集。株高測定的是子葉節(jié)到頂部生長點之間的長度；綠色葉片數是指葉片為中等綠色且具有光合能力的葉片的數量；單株鮮重是指植株的全部鮮重，包括根系和植株冠層；株寬測定的是當植株處于正常生長狀態(tài)時，植株冠層最寬處的尺寸；單株干重測定的是將新鮮植株置于烘箱內，120 ℃烘烤2 h，然后將試驗材料在烘箱內自然冷卻10 h后稱取的重量。

2 結果與分析

2.1 高鹽脅迫下受試辣椒品種的表型特征分析

高濃度鹽處理能夠顯著抑制植株的發(fā)育和繁殖，對作物的生長造成不可逆的影響。本研究隨機選取1號品種進行高鹽誘導試驗，在高鹽處理后，受試辣椒表型特征的差異及其顯著性如表1所示。與對照相比，100 mmol/L NaCl濃度處理下，株高、綠色葉片數、單株鮮重、單株干重等非保守性狀分別降低了12.03%、19.26%、17.63%和9.14%，表明該濃度鹽處理下明顯抑制了辣椒的生長；200 mmol/L NaCl濃度處理下，株高、綠色葉片數、單株鮮重、單株干重分別降低了28.78%、27.70%、41.73%和28.20%，表明該濃度鹽處理下生物量的產生受到了更大的抑制。由表1可知，僅單株分枝數和花蕾數2個表型特征在高鹽處理后明顯增加，相關研究表明高鹽處理能夠促進植株的早熟，由此推測高鹽處理有可能縮短辣椒的生育期，促進其分枝和花蕾數的增加。從以上分析結果可以得出，高鹽處理對辣椒植株的表型特征具有極顯著的抑制作用，鹽分濃度越高抑制效果越明顯，尤其是對其生物量的影響，反映了鹽濃度在達到一定閾值后能負調控辣椒的生長。

表1 不同濃度鹽脅迫下對辣椒幼苗主要表型特征的影響

2.2 不同馴化強度下辣椒品種主要表型特征的差異性分析

適度的脅迫誘導對植株能夠起到馴化的作用，可有效提高植株的脅迫耐受性。本試驗對3個辣椒品種進行了鹽馴化處理，表2為鹽馴化處理條件下3個辣椒品種受高鹽脅迫的主要表型特征。由表2可知，辣椒1號品種在NaCl濃度為60 mmol/L時，馴化效果最好，所測定的9種表型性狀指標除了單株分支數、主莖節(jié)數外，大都極顯著地優(yōu)于其他NaCl處理濃度的；低于該濃度，可能不能誘導辣椒幼苗耐鹽基因的激活，或者難以使辣椒幼苗耐鹽基因的表達量獲得較大提升；高于該濃度，可能導致辣椒幼苗傷害過重，不僅在馴化結束期表現不佳，而且在之后的高鹽脅迫期，也沒有良好地抵御高鹽傷害的能力。細胞內Na+/K+平衡對維持植株的生長具有重要作用，本研究認為在60 mmol/L鹽處理下辣椒體內Na+/K+平衡維持達到了一個最佳的狀態(tài)，能夠增強辣椒對鹽的耐受性，同時減少離子毒害對辣椒育苗造成的傷害。

為研究辣椒品種和鹽馴化濃度是否存在某種關聯，本研究分析了辣椒3號品種和5號品種與鹽馴化濃度之間的互作效應（表2）。從表2可知，3號品種和5號品種在不同鹽馴化濃度下，均表現為60 mmol/L NaCl的處理效果最好，進一步說明在這3個辣椒品種之間不存在最佳鹽馴化濃度的差異。

表2 不同鹽馴化條件下3個辣椒品種受高鹽脅迫主要表型特征比較

通過對上述辣椒幼苗進行葉綠素熒光成像分析可知（圖1、圖2），1、3、5號試驗組分別與CK1、CK3、CK5相比，Fv/Fm、Fm、qP、Rfd、NPQ這5個參數值發(fā)生了明顯變化；對照中不同品種間Fv/Fm、Fm、Rfd這3個參數無顯著差異，而不同品種間的qP、NPQ差異較大，表明qP、NPQ的變化不僅與鹽濃度有關，也與辣椒品種有關。通過進一步觀察辣椒不同馴化強度下的葉綠素熒光參數發(fā)現，1、3、5號試驗組在60 mmol/L NaCl脅迫下3個辣椒品種的Fv/Fm、Fm、qP、Rfd參數值都是最高的，NPQ則表現為最低，與其他鹽馴化濃度相比具有顯著差異，這進一步表明60 mmol/L NaCl濃度是提高辣椒耐鹽性最佳的鹽馴化濃度。分析原因可能有以下2點：一是參試材料均為辣椒，3個辣椒品種的差異僅僅是品種上的差異，遺傳組成差異度較?。欢亲魑锏哪望}性可能存在某種閾值，只有達到該閾值，耐鹽基因才能啟動。

2.3 耐鹽處理后不同辣椒品種表型性狀分析

由表2可知，低鹽馴化過的3個辣椒品種，在高鹽處理時，除了單株分枝數和主莖節(jié)數外，3號品種其余性狀大都優(yōu)于1號和5號品種。初步說明，3號品種相比于1號和5號品種而言耐鹽性最好，3號品種對高鹽脅迫具有最好的抗性。通過多光譜熒光成像系統(tǒng)對上述高鹽脅迫下幼苗進行葉綠素熒光檢測，如圖1所示，1號、3號、5號植株的5個葉綠素熒光參數分別與CK1、CK3、CK5相比都發(fā)生了差異性變化，在200 mmol/L NaCl脅迫下3號品種的Fv/Fm、Fm、qP參數值都是最高的，NPQ最低，且與1號、5號相比差異顯著；從圖2也可以看出，3號品種的上述4個葉綠素熒光指數明顯優(yōu)于1號和5號品種。綜合以上分析表明，3號品種在高鹽脅迫下可以通過提高其最大光合效率、光化學猝滅系數，降低非光化學熒光猝滅系數以提高其耐鹽表型。

圖1 不同濃度處理下辣椒幼苗在鹽馴化后葉綠素熒光參數分析

圖2 不同濃度鹽處理下辣椒幼苗在鹽馴化后葉綠素熒光參數表型成像分析

3 討論

3.1 沉默基因的激活和表達的條件性探析

2014年由華大基因和墨西哥生物多樣性基因組學國家重點實驗室等13個單位聯合公布了辣椒品種的全基因測序結果，研究表明：辣椒栽培種的染色體數目為2n=2x=24，在24條染色體中，共有69812個基因，這些基因包括功能基因和結構基因［21］。綜合多種植物的研究報道可知，大多數植物在正常生長環(huán)境下，僅有30%左右的基因在發(fā)揮作用，多數基因處于休眠或沉默狀態(tài)，只有遭遇特殊的環(huán)境或理化因素影響，這些基因的功能才能被激活表達，包括各種生物逆境或非生物逆境，而這些基因的表達一般可以是通過轉錄因子結合相應基因的啟動子激活［22］，這可以被認為是對植物進行有效馴化的基因基礎，例如小麥可以通過苗期的耐冷馴化提高其生長中后期的耐寒性；大豆可以通過耐高溫處理，有限度地提高大豆的耐熱性。在鹽脅迫下，一定的鹽誘導促進了磷脂酸的積累，激活細胞外信號轉導通路及相關耐鹽基因的表達，增強細胞內Na+的外排，從而提高植株的耐鹽性［23］。據此，本研究認為，通過辣椒苗期的耐鹽馴化，可以有限度地提高辣椒的高鹽耐受性。沉默基因的激活，需要滿足一定的條件，不同植物、同類植物的不同種，所需要的激活劑量會有很大差異，這就要根據實際需求進行定量研究，繼而找出符合實際要求的激活劑量和方法。對于鹽處理下辣椒幼苗初期的耐鹽性鑒定可以通過葉綠素熒光參數檢測判別其耐鹽指數，對于尋找合適的鹽馴化濃度具有重要作用。逆境脅迫下植株最大光能轉化效率、最大熒光產量、光化學猝滅系數、熒光衰減率等熒光參數降低，非光化學熒光猝滅系數升高［10，24，25］，本研究發(fā)現在鹽脅迫下60 mmol/L NaCl馴化下辣椒植株抗逆能力最好，PSⅡ熒光產量和PSⅡ反應中心的開放程度增強，光保護能力增強。為了更好地檢測該強度馴化下辣椒抗逆能力，可以進一步對其生理生化物質，包括活性氧、POD酶含量、葉綠素含量以及鹽基因表達量等進行檢測，進一步驗證上述結果。

3.2 馴化技術是作物遺傳改良的有益補充

據統(tǒng)計，到目前為止人類栽培的農作物大約有3000多種，其中大面積栽培的農作物僅有150余種，而這些作物就是當今人類重點進行遺傳改良的對象［26］。經過60多年的科學探索，我國創(chuàng)新和積累了作物遺傳改良的大量技術和手段，主要包括系統(tǒng)育種、雜交育種、分子標記輔助育種、轉基因育種等［27］。馴化作為通過基因突變、基因修復或基因重組引起的新物種的創(chuàng)建技術的補充，在人類活動和經濟發(fā)展中曾發(fā)揮了重要的作用，此外，對擬南芥的研究發(fā)現，50 mmol/L NaCl低鹽馴化后可使野生擬南芥在200 mmol/L NaCl處理下維持正常，而不經低鹽馴化的擬南芥在200 mmol/L NaCl處理下全部白化［28］。結合本研究低鹽馴化以提高辣椒耐鹽的各項生理指標，因此，本研究認為，在低鹽或鹽堿化土地種植經過鹽馴化后的幼苗可能對辣椒產量的提高具有重要作用。再者，由于馴化相比于遺傳改良，后者的基因純合、優(yōu)良家系的選擇和性狀穩(wěn)定需要花費更多的時間、財力和精力。馴化技術投資少、見效快，容易較快地將階段性成果轉化為社會生產力。需要指出的是，為了達到較好的馴化效果，需要對不同馴化對象的閾值進行科學的研究，既要使得沉默基因能夠有效激活，具有較強的基因表達量，并且使得這種表達量在一個生長周期能夠穩(wěn)定地保持。又要防止激活劑量的過大可能帶來的基因和器官的重大傷害。長期的連續(xù)馴化通過基因表達量的不斷積累和獲得性遺傳，使得被馴化性狀可以在遺傳上獲得穩(wěn)定性。通過一定濃度的鹽馴化可以綜合提高植株的脅迫耐受性，前人指出鹽脅迫與干旱、冷害和病害存在交叉作用，適度的鹽處理可以改變植株對這些脅迫的耐受性［29］。綜合以上研究，為了應對現在極端高溫和冷害天氣的頻繁出現對作物產量帶來的影響，也可以通過各種低溫、適度高溫、干旱等提前對作物進行脅迫誘導馴化，可能是一種及時減少作物產量損失的有效方法。

3.3 作物的耐鹽性在不同發(fā)育階段的差異性評價

作物的耐鹽性研究是人們從事非生物逆境研究的重要題材之一。其目的是通過耐鹽性研究了解作物耐鹽的生理機制，尋找耐鹽基因，培育耐鹽品種等，最終提高作物在較高鹽土環(huán)境下的較高生產力。但是，作物的耐鹽性在不同發(fā)育階段具有較大差異，不能將種子萌發(fā)期或者苗期作物的耐鹽水平推斷為該作物整個生命周期的耐性水平。綜合現有的研究報道可知， 20年來，公開發(fā)表的與作物耐鹽性相關的文章大多數是研究萌發(fā)期和苗期的耐鹽性，實際上，從技術運用的角度來看，更需要研究作物全生育期的耐鹽性，尤其是對作物生產力的影響，潘曉飚等［30］關于水稻耐鹽性的研究指出，水稻在盆栽條件下各個生育期耐鹽性差異較大，發(fā)芽期耐鹽性大于幼苗期和全生育期，并且各個生育期耐鹽性沒有顯著關系。本研究鑒于上述分析，在低鹽情況下尋找合適的辣椒幼苗鹽馴化強度，對促進辣椒在鹽堿地生長具有重要作用。為了綜合評價辣椒的耐鹽性，需要對辣椒幼苗和全生育期的耐鹽性做進一步的研究，探討鹽馴化后不同生育期辣椒的耐鹽性。

綜上所述，本研究得出的鹽馴化條件能夠顯著提高3個辣椒品種的耐鹽性，60 mmol/L NaCl濃度為最佳鹽馴化濃度，在高鹽脅迫下3號品種具有最好的耐鹽性。