不同外源調(diào)節(jié)劑對(duì)梅花花香性狀的影響

邱 晨，常 珺，王帥兵，范麗娜，賈浩田，郝瑞杰*

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 城鄉(xiāng)建設(shè)學(xué)院，山西 太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，山西 太谷 030801；3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源環(huán)境學(xué)院，山西 太谷 030801）

花香是觀(guān)賞植物的主要品質(zhì)指標(biāo)，其能有效提高觀(guān)賞植物的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和觀(guān)賞價(jià)值，也能影響人們的情緒、心理狀態(tài)、社交行為等［1］。通過(guò)調(diào)控花香物質(zhì)的組成和用量，可以開(kāi)展靈活的“芳香療法”，從而實(shí)現(xiàn)保障人體健康或緩解疾病痛苦的目標(biāo)［2］。花香是植物重要的次生代謝產(chǎn)物，其由多種小分子化合物組成［3］，國(guó)內(nèi)外已從90個(gè)屬991種植物中鑒定出2000多種花香物質(zhì)［4］，主要包括酯類(lèi)、醇類(lèi)、萜烯類(lèi)、烷烴類(lèi)、芳香烴類(lèi)、醛類(lèi)、酮類(lèi)以及醚類(lèi)等［5-6］?；ㄏ阄镔|(zhì)的釋放由植物自身遺傳特性決定，但生物、環(huán)境等眾多外界因素也會(huì)影響植物花香物質(zhì)的揮發(fā)，如害蟲(chóng)、真菌、溫度、激素、外源調(diào)節(jié)劑等［7-10］。

生產(chǎn)中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種調(diào)節(jié)劑可以影響植物花香物質(zhì)的揮發(fā)［10-11］，如甘草酸是一種兩親性分子，可以自由組裝形成主客體復(fù)合物，從而將客體分子包裹起來(lái)，提高其溶解度，起到抑制次生代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)和揮發(fā)的作用［12］。槲皮素是基于類(lèi)黃酮結(jié)構(gòu)的一類(lèi)具有生物活性的化合物，其與植物多種功能有相關(guān)作用［13］，外源槲皮素處理可以通過(guò)參與ABA信號(hào)通路和降低ATP合酶的活性，從而抑制擬南芥中生長(zhǎng)素等次生代謝產(chǎn)物的運(yùn)輸［14］。釩酸鹽是一種重要的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性抑制劑［15］，在擬南芥中外源添加釩酸鹽可抑制液泡膜對(duì)水楊酸的轉(zhuǎn)運(yùn)［16］。在煙草懸浮細(xì)胞檢測(cè)PhABCG1轉(zhuǎn)運(yùn)苯甲酸甲酯的試驗(yàn)表明，正釩酸鈉可有效抑制矮牽牛關(guān)鍵芳香物質(zhì)的揮發(fā)［11］。目前，利用外源調(diào)節(jié)劑調(diào)控植物花香機(jī)理研究仍未闡明，生產(chǎn)中也缺乏有效的花香調(diào)節(jié)劑，因此繼續(xù)開(kāi)展觀(guān)賞植物花香調(diào)節(jié)劑研究意義重大。

梅花 (Prunus mume Sieb. et Zucc)為薔薇科杏屬落葉觀(guān)花小喬木，是我國(guó)十大傳統(tǒng)名花之一，自古就與國(guó)人的生產(chǎn)、生活和文化結(jié)緣，深受人們喜愛(ài)。前人研究揭示梅花花香的主要特征物質(zhì)是乙酸苯甲酯、苯甲醇、苯甲醛等，梅花已成為研究苯環(huán)類(lèi)物質(zhì)合成與揮發(fā)的模式植物［17-19］，而有關(guān)外源調(diào)節(jié)劑對(duì)梅花花香性狀影響的研究鮮有報(bào)道，其調(diào)控方式和影響機(jī)制尚不清楚。本研究以梅花彩枝舞粉為材料，利用甘草酸、槲皮素、正釩酸鈉這3種外源試劑噴施處理，采用頂空固相微萃取和氣質(zhì)聯(lián)用(HS-SPME-GC-MS)技術(shù)，對(duì)不同處理后盛花花朵進(jìn)行揮發(fā)成分檢測(cè)分析以探究3種花香調(diào)節(jié)劑對(duì)梅花揮發(fā)性狀的影響，以期篩選出有效的花香揮發(fā)調(diào)節(jié)劑，為指導(dǎo)后續(xù)的花香應(yīng)用和花香調(diào)控工作提供實(shí)踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以山西農(nóng)業(yè)大學(xué)校內(nèi)栽培的梅花彩枝舞粉(Prunus mume ‘Caizhiwufen’)為試材，剪切帶有盛花期梅花花朵的枝條插入超純水中，置于20 ℃恒溫光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)（瑞徽電子上海有限公司），光周期為12 L/12 D，光照強(qiáng)度為5000 lx。外源花香調(diào)節(jié)劑為甘草酸、槲皮素、正釩酸鈉，均購(gòu)買(mǎi)自麥克林公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外源調(diào)節(jié)劑處理試驗(yàn)采用2 mmol/L甘草酸、槲皮素和正釩酸鈉3種外源調(diào)節(jié)劑，選擇長(zhǎng)勢(shì)一致的盛花期梅花花朵分別噴施此3種不同的外源試劑，以噴施清水為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2.2 花香采集與分析使用氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀（Trace ISQ型號(hào)，Thermo公司），參考袁穎的研究方法中設(shè)定的SPME-GC-MS工作條件［20］，將不同處理的盛花花朵離體稱(chēng)重后置入20 mL頂空進(jìn)樣瓶中，揮發(fā)成分鑒定采用NIST08譜庫(kù)檢索結(jié)合人工解析圖譜共同確定，揮發(fā)物成分定量分析采用外標(biāo)法［21］。

1.2.3 徒手切片觀(guān)察將梅花花瓣表皮分離后制成徒手切片，選取合適的切片在正置顯微鏡（日本Nikon公司，NI-U）下對(duì)花瓣表皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)及形態(tài)進(jìn)行觀(guān)察并拍照。

1.2.4 FDA染色觀(guān)察稱(chēng)量5 mg FDA溶于1 mL丙酮中，4 ℃保存為貯備液。用20%的蔗糖將貯備液稀釋50倍并混合均勻，配制成濃度為100 μg/mL的FDA測(cè)定液。取不同處理后花瓣表皮制成徒手切片，于室溫下浸泡在FDA測(cè)定液中，黑暗處染色7 min后在顯微鏡（Nikon Ni-U、Nikon C-HGFI熒光發(fā)射源、Nikon-Fi3相機(jī)）上進(jìn)行觀(guān)察和拍照，激發(fā)光為藍(lán)色，目鏡為10倍，物鏡為4倍。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)采用Thermo Xcalibur和Microsoft Excel 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，用The SAS System for Windows V8軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用AVONA進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)（P＜0.05），采用Origin 2019b軟件進(jìn)行圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 花香調(diào)節(jié)劑對(duì)梅花花香主要揮發(fā)物質(zhì)的影響

由不同外源花香調(diào)節(jié)劑處理后梅花彩枝舞粉花香離子流（圖1）所示，與清水處理相比，處理后揮發(fā)物總離子流圖中峰數(shù)量及其相應(yīng)峰面積差異明顯，各處理間也存在明顯差別。但不同處理的梅花花香主要物質(zhì)種類(lèi)未發(fā)生明顯變化，均為乙酸苯甲酯、苯甲醇、苯甲醛、丁香酚等。由不同外源調(diào)節(jié)劑對(duì)彩枝舞粉花香總揮發(fā)量的影響（圖2）可知，與清水對(duì)照相比，各處理的花香揮發(fā)物釋放總量均有所降低，其中經(jīng)甘草酸和正釩酸鈉處理的花香揮發(fā)物總釋放量均顯著降低，且正釩酸鈉處理的下降幅度最明顯，達(dá)到了44.75%；而槲皮素處理的花香揮發(fā)物總釋放量與清水對(duì)照相比差異不顯著。

圖1 不同調(diào)節(jié)劑處理梅花花香離子流

圖2 不同調(diào)節(jié)劑對(duì)梅花花香揮發(fā)物總揮發(fā)量的影響

2.2 花香調(diào)節(jié)劑對(duì)梅花花香揮發(fā)物類(lèi)別的影響

梅花花香揮發(fā)物的歸類(lèi)情況如圖3所示，各處理中共檢測(cè)到的40余種揮發(fā)物，主要分為酯類(lèi)、萜烯類(lèi)、苯環(huán)類(lèi)、烷烴類(lèi)、醇類(lèi)、醛類(lèi)、酸類(lèi)、酮類(lèi)和其他共9個(gè)類(lèi)別，其中數(shù)量最多的是酯類(lèi)，其次是苯環(huán)類(lèi)，兩者共占總類(lèi)別的50%左右。由圖3可知，與清水處理相比，甘草酸處理可有效增加梅花花香揮發(fā)物中酯類(lèi)、苯環(huán)類(lèi)、醇類(lèi)、醛類(lèi)和其他類(lèi)物質(zhì)的數(shù)量，并使得烷烴類(lèi)和酸類(lèi)物質(zhì)數(shù)量減少，而萜烯類(lèi)物質(zhì)并未檢測(cè)到。經(jīng)槲皮素處理后，梅花花香揮發(fā)物中的酯類(lèi)、烷烴類(lèi)、醇類(lèi)和醛類(lèi)物質(zhì)數(shù)量與清水對(duì)照相比保持不變，萜烯類(lèi)物質(zhì)的數(shù)量明顯減少，其他類(lèi)物質(zhì)的數(shù)量明顯增加，而酸類(lèi)物質(zhì)未檢測(cè)到。正釩酸鈉處理對(duì)梅花盛花花朵釋放揮發(fā)物種類(lèi)數(shù)量的影響較大，其揮發(fā)物總種類(lèi)有30種，較清水對(duì)照減少了30.23%，其酯類(lèi)、烷烴類(lèi)物質(zhì)的數(shù)量明顯減少，萜烯類(lèi)物質(zhì)未被檢測(cè)到，其余種類(lèi)物質(zhì)數(shù)量與清水對(duì)照組相比基本保持不變。

圖3 不同調(diào)節(jié)劑對(duì)梅花花香揮發(fā)物種類(lèi)的影響

2.3 花香調(diào)節(jié)劑對(duì)梅花花香不同類(lèi)別揮發(fā)物釋放總量的影響

由各處理中揮發(fā)物質(zhì)中各類(lèi)別釋放量(圖4)可知，花香揮發(fā)物中酯類(lèi)、苯環(huán)類(lèi)和醇類(lèi)物質(zhì)的平均釋放量均相對(duì)較高（圖4），且酯類(lèi)是梅花花香成分中的主要物質(zhì)，至少達(dá)到了205.09 ng/(g·h)，其次是醇類(lèi)，苯環(huán)類(lèi)、醛類(lèi)、烷烴類(lèi)、萜烯類(lèi)、酸類(lèi)、酮類(lèi)和其他類(lèi)物質(zhì)的含量依次減少。與清水對(duì)照相比，經(jīng)不同外源花香調(diào)節(jié)劑處理后，花香成分中酯類(lèi)、萜烯類(lèi)、苯環(huán)類(lèi)、烷烴、酸類(lèi)和酮類(lèi)物質(zhì)的揮發(fā)均受到了明顯抑制。噴施甘草酸溶液后，梅花花香揮發(fā)性成分中醇類(lèi)物質(zhì)的釋放量顯著增加，酯類(lèi)、苯環(huán)類(lèi)、烷烴類(lèi)、酸類(lèi)、酮類(lèi)物質(zhì)的釋放量均顯著減少，萜烯類(lèi)物質(zhì)的釋放量為0；經(jīng)槲皮素處理后，醛類(lèi)物質(zhì)的釋放量顯著增加，酯類(lèi)、萜烯類(lèi)、苯環(huán)類(lèi)、醇類(lèi)、酮類(lèi)物質(zhì)的釋放量顯著減少，而酸類(lèi)物質(zhì)則無(wú)法被檢測(cè)到；正釩酸鈉處理顯著提高了醛類(lèi)物質(zhì)的釋放量，酯類(lèi)、苯環(huán)類(lèi)、烷烴類(lèi)、酸類(lèi)和酮類(lèi)物質(zhì)的揮發(fā)受到了明顯抑制，而萜烯類(lèi)物質(zhì)的揮發(fā)受到了完全抑制。

圖4 花香調(diào)節(jié)劑對(duì)梅花花香不同種類(lèi)揮發(fā)物釋放量的影響

2.4 花香調(diào)節(jié)劑對(duì)梅花花香主要揮發(fā)物釋放量的影響

通過(guò)對(duì)處理后梅花彩枝舞粉的揮發(fā)物進(jìn)行鑒定和統(tǒng)計(jì)，從40多種不同的揮發(fā)物成分中篩選出了9種代表性成分，并對(duì)這9種成分的釋放量進(jìn)行分析。從圖5可以看出，乙酸苯甲酯和苯甲醇是梅花彩枝舞粉主要的花香成分，一些酯類(lèi)和苯環(huán)類(lèi)物質(zhì)的釋放量也相對(duì)較高。經(jīng)不同外源花香調(diào)節(jié)劑處理后，大部分揮發(fā)物質(zhì)釋放量均顯著降低，如乙酸苯甲酯、苯甲醇、丁香酚、乙酸己酯、乙酸異戊酯、正二十一烷、苯酚、乙酸葉醇酯，尤其是乙酸苯甲酯的揮發(fā)量降低了50%以上，在甘草酸處理中的揮發(fā)量?jī)H為107.39 ng/(g·h)。而甘草酸、槲皮素和正釩酸鈉處理均使得正二十一烷消失；噴施甘草酸溶液后，苯酚無(wú)法被檢測(cè)到；正釩酸鈉處理后，苯甲醛的揮發(fā)量顯著提升，達(dá)到了34.07 ng/(g·h)，相當(dāng)于清水對(duì)照的3倍，而乙酸葉醇酯無(wú)法被檢測(cè)到。

圖5 不同調(diào)節(jié)劑對(duì)梅花花香9種主要揮發(fā)物釋放量的影響

2.5 花香調(diào)節(jié)劑處理后梅花花瓣表皮細(xì)胞觀(guān)察

由梅花花瓣徒手切片觀(guān)察結(jié)果（圖6）顯示，各調(diào)節(jié)劑處理下花瓣表皮細(xì)胞整體均呈現(xiàn)淡粉色，細(xì)胞間以鑲嵌結(jié)構(gòu)形式緊密排列，與對(duì)照相比，細(xì)胞形態(tài)未見(jiàn)明顯變化?；ò瓯砥ぜ?xì)胞FDA染色觀(guān)察結(jié)果（圖6）顯示，所有花瓣表皮細(xì)胞均在藍(lán)光下呈現(xiàn)黃綠色熒光，且不同外源調(diào)節(jié)劑處理后的花瓣表皮細(xì)胞較對(duì)照熒光差異不明顯，表明處理后花瓣表皮細(xì)胞膜未被破壞且仍具有完整性，花瓣表皮細(xì)胞活力未見(jiàn)明顯改變。

圖6 花香調(diào)節(jié)劑處理后梅花花瓣表皮徒手切片與FDA染色觀(guān)察

3 討論與結(jié)論

花是植物主要的觀(guān)賞部位，花香也是人們關(guān)注的焦點(diǎn)之一。近年來(lái)，隨著花香揮發(fā)性物質(zhì)提取和檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步與發(fā)展［22］，眾多植物花香成分已被鑒定出來(lái)，且對(duì)花香性狀調(diào)控的研究取得了較大進(jìn)展［23-24］，外源調(diào)節(jié)劑能有效影響植物花香物質(zhì)的揮發(fā)與合成，但各調(diào)節(jié)劑所產(chǎn)生的影響差異較大。外源NO會(huì)抑制牡丹不同花期花瓣揮發(fā)性成分中烷烴類(lèi)、醇類(lèi)和芳香烴類(lèi)物質(zhì)的揮發(fā)，并影響其花期花瓣揮發(fā)性成分的種類(lèi)及含量，但對(duì)萜烯類(lèi)和酮類(lèi)物質(zhì)影響不大［25］。外源乙烯處理可以提高白姜花萜類(lèi)花香物質(zhì)的釋放量［26］，而使香豌豆花主要花香揮發(fā)物芳樟醇大量減少［27］。外源茉莉酸甲酯對(duì)玫瑰花香物質(zhì)的釋放具有明顯促進(jìn)作用［28］，但噴施50 μmoL/L茉莉酸甲酯對(duì)百合花瓣的花香揮發(fā)物釋放產(chǎn)生了抑制作用［29］。而在本研究中，3種外源調(diào)節(jié)劑處理均使梅花彩枝舞粉花香揮發(fā)性物質(zhì)的總揮發(fā)量降低，說(shuō)明不同調(diào)節(jié)劑作用效果不同，對(duì)不同植物花香性狀的影響也不同。清水對(duì)照處理梅花花香主要揮發(fā)物乙酸苯甲酯的揮發(fā)量占總揮發(fā)量的52.63%，甘草酸、槲皮素、正釩酸鈉處理后乙酸苯甲酯的揮發(fā)量分別降低了64.18%、58.01%、45.66%。由此可見(jiàn)，3種外源調(diào)節(jié)劑均能有效抑制乙酸苯甲酯的揮發(fā)，梅花花香總揮發(fā)量的降低也主要?dú)w因于乙酸苯甲酯揮發(fā)量的降低。

植物花香主要來(lái)源于花瓣釋放的多種揮發(fā)性香氣成分，本研究發(fā)現(xiàn)不同外源調(diào)節(jié)劑處理并未破壞梅花花瓣表皮細(xì)胞膜的完整性和影響其細(xì)胞活性，但梅花花香總揮發(fā)量明顯降低，這說(shuō)明外源調(diào)節(jié)劑對(duì)花香性狀的影響不是基于細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞，可能是外源調(diào)節(jié)物質(zhì)干預(yù)了梅花花香物質(zhì)揮發(fā)的進(jìn)程。在矮牽牛中發(fā)現(xiàn)了ABC亞家族的ABCG轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白PhABCG1參與了轉(zhuǎn)運(yùn)苯甲酸甲酯和苯甲醇［11］；Hao等［30］證實(shí)了ABCGs參與薔薇科植物梅、桃、杏中苯甲醛的揮發(fā)。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白利用水解ATP釋放的能量來(lái)特異性轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)產(chǎn)物［31-33］，而正釩酸鈉可以抑制ATP的水解，其已被證實(shí)為一種有效的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑［34］。本試驗(yàn)中，正釩酸鈉處理后大量揮發(fā)物質(zhì)的揮發(fā)量均大幅減少，而苯甲醛的揮發(fā)量顯著增加，這可能與正釩酸鈉處理后，梅花處于逆境環(huán)境中，觸發(fā)了梅花自身的防御機(jī)制，釋放出大量苯甲醛吸引昆蟲(chóng)進(jìn)行授粉有關(guān)［35］。有研究表明，甘草酸與槲皮素能夠抑制ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能從而影響次生代謝產(chǎn)物的運(yùn)輸［36-38］。本研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素與甘草酸的處理也顯著降低了梅花花香物質(zhì)的揮發(fā)量，推測(cè)甘草酸與槲皮素也可能是通過(guò)調(diào)控相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能以減少花香物質(zhì)的揮發(fā)。

植物揮發(fā)性成分種類(lèi)和含量差異對(duì)其獨(dú)特香氣特征的形成起到關(guān)鍵作用。童盼盼等［39］使用特定外源調(diào)節(jié)物質(zhì)噴施庫(kù)爾勒香梨后，果實(shí)主要揮發(fā)性物質(zhì)及特征香氣含量顯著提高，導(dǎo)致果香發(fā)生明顯變化。侯丹［7］研究表明溫度變化對(duì)桂花花香釋放產(chǎn)生顯著影響，烷烴類(lèi)化合物比例增加，使桂花香氣濃淡發(fā)生變化。裴龍英［40］發(fā)現(xiàn)不同處理的哈密瓜汁香氣有明顯改變，特征酯類(lèi)揮發(fā)性物質(zhì)減少以及醛類(lèi)物質(zhì)占比增加導(dǎo)致果汁香氣明顯減弱。本試驗(yàn)中，3種外源調(diào)節(jié)劑在有效抑制梅花花香總揮發(fā)量的同時(shí)，還使其花香成分的種類(lèi)、含量以及特征花香物質(zhì)的比例發(fā)生改變，導(dǎo)致處理前后梅花花香性狀的差異，而不同調(diào)節(jié)劑對(duì)梅花香氣特征的改變起到不同效果。甘草酸、槲皮素處理后梅花主要花香物質(zhì)含量均顯著減少，主要成分為乙酸苯甲酯、苯甲醇、苯甲醛、丁香酚等；正釩酸鈉處理后梅花主要成分為乙酸苯甲酯、苯甲醛、苯甲醇、乙酸己酯等，表現(xiàn)為苯甲醛含量的顯著提高和丁香酚含量明顯減少。因此，可以充分利用特定外源調(diào)節(jié)劑達(dá)到調(diào)控觀(guān)賞植物花香的效果，進(jìn)而改善園林觀(guān)賞植物因花香過(guò)于濃郁引起人體不適的現(xiàn)狀。

綜上所述，使用外源調(diào)節(jié)物質(zhì)噴施梅花彩枝舞粉盛花期花朵，其揮發(fā)物總釋放量受到明顯抑制，并導(dǎo)致?lián)]發(fā)物種類(lèi)以及主要花香物質(zhì)含量減少。不同調(diào)節(jié)劑對(duì)花香總揮發(fā)量的影響程度存在差異，正釩酸鈉的抑制作用強(qiáng)于甘草酸和槲皮素，不同外源調(diào)節(jié)劑對(duì)梅花花香成分中不同物質(zhì)的種類(lèi)和數(shù)量的影響差異可能與ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白被特異性調(diào)控有關(guān)。因此，關(guān)于噴施外源調(diào)節(jié)劑對(duì)植物花香性狀影響的探索，可為人工調(diào)控植物芳香性狀提供了借鑒，也為芳香植物材料的應(yīng)用提供了新的思路，后續(xù)可將關(guān)鍵ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因作為切入點(diǎn)，是今后從基因水平上進(jìn)行花香調(diào)控和香花植物應(yīng)用的有效途徑之一。