鴨病毒性腸炎的研究進(jìn)展

陳玉珍 永安市動物疫病預(yù)防控制中心 福建永安 366000

鴨病毒性腸炎（DVE）是由鴨瘟病毒（DPV）引起的一種急性發(fā)熱性傳染病，通過接觸傳播，與敗血癥相關(guān)，以血管損傷、組織出血、消化道黏膜損傷和腸黏膜病變?yōu)樘卣鳌鞑パ杆?，發(fā)病率和病死率都很高[1]。全球DP于1923年在荷蘭首次暴發(fā)。隨后DP于1973年在南達(dá)科他州暴發(fā)，43 000羽鴨和鵝陸續(xù)發(fā)病、死亡，流行病學(xué)調(diào)查表明野生鳥類和農(nóng)場家禽不僅攜帶相同DPV，且病毒學(xué)和血清學(xué)均為陽性，荷蘭和南達(dá)科他州DP的暴發(fā)并不是該區(qū)域所特有，在世界范圍內(nèi)皆有發(fā)生，如英國、印度和加拿大等[2]。1957年我國首次DP發(fā)生于廣東省，之后武漢、上海、浙江、江蘇、廣西、湖南和福建等地陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，至20世紀(jì)80年代傳播到東北各省[3]。值得注意的是，除鵝和鴨外，自由放養(yǎng)的水禽也是DPV感染攜帶者，之前的研究對132個野外分離株的分析中發(fā)現(xiàn)，在96羽禽類中存在DPV（72.7%），包括野鴨（Anas platyrhynchos）、疣鼻天鵝（Cygnus olor）、灰背雁（Anser anser）、苔 原 豆 雁（Anser fabalis）和 灰 鷺（Ardea cinerea）[4]。隨著傳染源不斷擴(kuò)增，對DP的防治顯得尤為重要。

1 DPV基因組結(jié)構(gòu)和分子生物學(xué)研究

1.1 DPV基因組結(jié)構(gòu)DVE的病原是DPV或Anatid herpesvirus-1。根據(jù)國際病毒分類委員會（ICTV）最近的分類，DPV被分類為Mardivirus屬，與HSV-1（單純皰疹病毒1型）同屬于皰疹病毒科的a-皰疹亞科[5]。DPV有囊膜，遺傳物質(zhì)為雙股DNA，呈對稱的二十面體，具有典型a-皰疹病毒的特征。病毒基因組大小為158～162 kb，由一個唯一的長獨(dú)特區(qū)（UL）、一個唯一的短獨(dú)特區(qū)（US）和兩個倒置重復(fù)序列（IRS和TRS）[6]組成。共有78個ORF編碼潛在的功能蛋白，在這些ORF中，由10個和68個ORF分別編碼結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白。相對于皰疹病毒科其他成員來說，DNA復(fù)制的持續(xù)時間長是DPV的特征之一，說明它們在宿主細(xì)胞內(nèi)持續(xù)性繁殖。皰疹病毒通過病毒體糖蛋白尖峰附著在宿主細(xì)胞受體上，DPV進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)時，會涉及多種糖蛋白[7]。結(jié)合后，包膜與宿主細(xì)胞的質(zhì)膜融合，核衣殼進(jìn)入宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。DNA和蛋白質(zhì)復(fù)合物從核衣殼中分離出來，進(jìn)入細(xì)胞核。然后它會迅速關(guān)閉宿主細(xì)胞的大分子合成。逐步開始感染，DPV基因組開始三個階段依次表達(dá)，即：即刻早期（IE）、早期和晚期。與DPV同屬的HSV-1的即可早期轉(zhuǎn)錄是由反式作用因子VP16介導(dǎo)的，與即早（IE，α）基因啟動子上游的特定順式作用元件結(jié)合，促進(jìn)IE基因的轉(zhuǎn)錄，即α-TIF。近期發(fā)現(xiàn)其同源物pUL48被確定為DPV的α-TIF。并且pUL46和pUL47顯著促進(jìn)pUL48的轉(zhuǎn)錄激活，從而增強(qiáng)pUL48的轉(zhuǎn)錄激活功能，協(xié)同促進(jìn)病毒基因表達(dá)[8]。之后IE基因在感染時立即轉(zhuǎn)錄。早期基因在病毒DNA復(fù)制之前以IE蛋白依賴的方式轉(zhuǎn)錄，晚期基因的轉(zhuǎn)錄始于DNA和病毒蛋白的合成開始后。病毒DNA的復(fù)制發(fā)生在細(xì)胞核中，新合成的DNA盤繞成預(yù)先形成的未成熟衣殼。病毒粒子DNA的成熟是通過核衣殼和核包膜內(nèi)層的衣殼化發(fā)生。隨后，病毒粒子通過核膜出芽而完全包裹。成熟后，病毒粒子在宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)積聚，并通過細(xì)胞溶解或胞吐作用釋放[9]。

1.2 DPV分子生物學(xué)研究 對DPV的研究相對緩慢，與皰疹病毒科其他成員的研究仍有較大差距。Plummer等[10]用HindⅢ消化DPV，得到一個約1.95 kb的DNA片段，發(fā)現(xiàn)該片段與水痘帶狀皰疹病毒UL6和UL7基因部分同源。隨后，郭霄峰等[11]發(fā)現(xiàn)鴨瘟病毒北京株的UL6和UL7基因在不同的毒株中高度保守。隨著技術(shù)的發(fā)展，多個DPV基因已被成功克隆并進(jìn)行序列分析：張馨月等[12]通過對鴨瘟強(qiáng)弱毒株TK基因及相鄰UL24基因進(jìn)行克隆、測序及分析，發(fā)現(xiàn)鴨瘟病毒強(qiáng)毒株和弱毒株TK基因和UL24基因5′端982 bp核苷酸序列均完全一致，與其他鴨瘟病毒毒株的同源性達(dá)99.4%以上，表明鴨瘟病毒TK基因高度保守，研究結(jié)果為構(gòu)建鴨瘟病毒TK基因缺失的轉(zhuǎn)移載體奠定了基礎(chǔ)，同時也為建立重組DP活載體疫苗創(chuàng)造了條件。程安春等[13]應(yīng)用鳥槍法成功構(gòu)建了DPV基因文庫，獲得大于100 bp的ORF共187個，并初步克隆和鑒定DPV的核衣殼蛋白基因。羅丹丹等[14]利用靶基因步移PCR法獲得DPV部分基因的完整ORF，研究結(jié)果均指向DPV UL47、UL28應(yīng)歸類為a-皰疹病毒亞科的禽類皰疹病毒科。李玉峰等[15]分別用BamHI、EcoRI、HindIII、PstI、SalI 5種限制性內(nèi)切酶消化鴨瘟病毒基因組DNA，獲得5個UL片段基因，分別為UL33、UL34、UL45、UL46和UL47，經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)它們與α-亞科皰疹病毒其他成員相應(yīng)基因具有不同程度的同源性。隨著對DPV基因組的深入研究，對其所發(fā)揮的功能也逐漸完善。張樹棟[16]利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了DPV gB抗原優(yōu)勢區(qū)（N端111-190aa），該重組蛋白質(zhì)具有抗原性，可作為DVE抗體檢測的候選抗原；同時制備了相應(yīng)的兔源多克隆抗體。藺萌[17]發(fā)現(xiàn)DPV gN基因288 bp具有特異性，可以作為區(qū)別DPV與其他病毒的特異基因，同時建立了基于DPV gN基因的PCR擴(kuò)增檢測方法，并應(yīng)用于DVE的臨床診斷（最低可以檢測到0.1 ng/μL）。崔立虹等[18]在對DPV-gC糖蛋白胞外區(qū)的優(yōu)勢抗原表位、對DPV-gC基因進(jìn)行分段克隆并構(gòu)建重組表達(dá)載體，發(fā)現(xiàn)DPV-gC糖蛋白優(yōu)勢抗原表位為第73～88位氨基酸，為DPV-gC糖蛋白具體功能區(qū)的研究、診斷試劑及表位疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。

2 DPV的流行現(xiàn)狀

鴨瘟于1923年在荷蘭首次被發(fā)現(xiàn)，隨后，DP在世界范圍內(nèi)廣泛流行。DPV可感染所有年齡段家鴨，發(fā)病率和病死率在5%～100%。DP的潛伏期為3～8 d，家鴨在感染后的臨床癥狀為抑郁、共濟(jì)失調(diào)、呼吸困難、眼瞼腫脹、頭頸部腫脹、腹瀉、糞便白綠色、泄殖腔黏膜水腫、綠色假膜覆蓋物等。病理組織樣本發(fā)現(xiàn)患鴨頭部和頸部腫脹的皮膚中觀察到淡黃色透明液體，免疫器官有出血點(diǎn)、壞死灶和潰瘍，腦部有血管套等典型特征[19]。DPV傳播能力廣泛，可通過直接和間接途徑傳播，家鴨與野生水禽在傳播DPV上具有雙向性[20]。由于水禽生存在水生環(huán)境中，因此DPV主要通過水傳播；大多數(shù)家鴨的DP暴發(fā)區(qū)域，通常是在野生水禽的開放水域附近，患鴨感染后可經(jīng)糞便和口分泌物長期排毒[21]，從而使得整個環(huán)境受到DPV污染，且DPV難以徹底消滅。威斯康星州一處鴨場暴發(fā)DP四年后，對該鴨場的家鴨泄殖腔拭子進(jìn)行檢測，仍然可以檢測到DPV[22]。不僅如此，自由飛行的鳥類也是DPV的傳播途徑之一，據(jù)調(diào)查，當(dāng)H5N1亞型禽流感病毒向西部傳播時，鳥類在疫情暴發(fā)期間，死亡率14%～81%，成年鳥類死亡率較高，隨即對當(dāng)?shù)氐乃葸M(jìn)行鴨瘟病毒測試，發(fā)現(xiàn)鴨和鵝的器官均分離出皰疹病毒，并被確定為DPV[22]。鴨、鵝康復(fù)后，DPV可潛伏在三叉神經(jīng)節(jié)、外周血淋巴細(xì)胞和淋巴組織中，可攜帶DPV長達(dá)4年，充分說明DP潛伏期持續(xù)時間長，難以根除該病的發(fā)生。近幾年，DP在我國各地起伏性發(fā)生，通過長期監(jiān)測該病一年四季均可發(fā)生，尤其在春秋兩季多發(fā)，說明DP還可通過其他途徑傳播感染。此外，空氣傳播和垂直傳播也是該病的主要傳播方式[23]。

3 DPV與宿主天然免疫應(yīng)答

先天性免疫是以天然免疫的方式抵抗外來病毒的入侵?？煞翘禺愋詫Σ≡淖R別受體（PRR）誘導(dǎo)產(chǎn)生I型干擾素（IFN）和炎性細(xì)胞因子，使機(jī)體在發(fā)育過程中逐漸形成一系列的防御體系。其中，PRR包括Toll樣受體（TLR）、NOD樣受體（NLR）和RIGI樣受體（RLR）等。不同位置PRR所發(fā)揮的功能不同，TLR是跨膜蛋白I家族的成員，位于細(xì)胞表面和內(nèi)膜中，負(fù)責(zé)識別配體；NLRs是PRR家族另一組受體，位于細(xì)胞質(zhì)中，識別直接入侵或者間接進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的病原。RLRs大多位于體內(nèi)的細(xì)胞質(zhì)中，也有研究表明RLR可能位于細(xì)胞核，負(fù)責(zé)識別機(jī)體內(nèi)引起的絕大多數(shù)病毒感染[24]。在鴨中發(fā)現(xiàn)的TLRs，包括TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7和TLR15。體內(nèi)試驗(yàn)表明，DPV感染1 d后，TLR2在大腦中增加了132.6倍，TLR21在脾臟增加100倍以上，激活的TLR21和TLR2募集接頭蛋白，分別誘導(dǎo)MyD88在腦和脾中表達(dá)量升高，激發(fā)下游信號通路，產(chǎn)生Ⅰ型干擾素，抵御DPV感染。此外，TLR21在調(diào)節(jié)宿主對外來入侵的防御起重要作用，是哺乳動物TLR9的功能同源物[25]。TLR21可以識別未甲基化的胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤寡脫氧核苷酸（CpG-ODN），并激活NF-κB免疫信號通路。而TLR9在小鼠中也可以通過由單個CpG基序組成的CpG-ODN激活。綜上所述TLR9和TLR21均在DPV感染的宿主防御中發(fā)揮重要作用。RLR家族的3個成員RIG-I、MDA5和LGP2在大多數(shù)組織中表達(dá)，當(dāng)DPV感染鴨胚成纖維細(xì)胞（DEF）時，DPV感染持續(xù)時間和細(xì)胞內(nèi)病毒DNA不斷增加，與此同時，IFN-β和RIG-I也不斷上調(diào)，體內(nèi)和體外都激活I(lǐng)FN-β和RIG-I[26]。RIG-I抑制了DPV感染，同時在MDA5過度表達(dá)的DEF細(xì)胞中，DPV感染被顯著抑制，而siRNA對MDA5的擊倒顯著增強(qiáng)了DPV的生長。DPV感染后，MDA5的轉(zhuǎn)錄水平在體內(nèi)和體外都受到上調(diào)。在抗病毒信號傳導(dǎo)方面，MDA5與LGP2之間存在聯(lián)系，LGP2在MDA5特異性增強(qiáng)和干擾之間充當(dāng)濃度依賴開關(guān)。這些結(jié)果表明，MDA5限制了DPV復(fù)制，LGP2在MDA5介導(dǎo)的抗DPV活性中起著關(guān)鍵作用[27]。以上研究發(fā)現(xiàn)，RIG-1、MDA5和LGP2參與了宿主對DPV的天然免疫應(yīng)答。MAVS的過度表達(dá)顯著降低DPV的復(fù)制，敲除MAVS，則IFN-β、OAS和IL-2下調(diào)，表明MAVS顯著降低調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的激活[28]，除了TLR和RLR外，其他PRRS在應(yīng)對微生物感染方面也起著至關(guān)重要的作用。

4 DP的診斷與防控

病毒分離與鑒定是診斷病毒性疾病的核心標(biāo)準(zhǔn)，通常采取患鴨血液、肝、脾或腎作為分離病毒的樣品，經(jīng)研磨、離心、過濾后接種到雞胚或鴨胚，或者CEF、MDEF、DEF細(xì)胞系中進(jìn)行培 養(yǎng)。其中，DEF細(xì)胞對鴨病毒性腸炎疫苗株分離率最高[29]。強(qiáng)毒性DPV會產(chǎn)生明顯的細(xì)胞病變，通過電鏡超薄切片檢查細(xì)胞培養(yǎng)物，發(fā)現(xiàn)接種病毒12 h后，在細(xì)胞漿內(nèi)可觀察到帶囊膜的成熟病毒粒子，且染色檢查發(fā)現(xiàn)大量核內(nèi)包涵體[30]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，已開發(fā)出大量的病原學(xué)（ISH、PCR、LAMP和PCRDHPLC技術(shù)等）和血清學(xué)（HCT、IFA、ELISA、GICA等）檢測方法，其中PCR技術(shù)是廣泛應(yīng)用的病原檢測方法，適用于流行病學(xué)調(diào)查和臨床診斷。近幾年，常結(jié)合多種方法檢測DPV，如從DPV基因組中根據(jù)不同目的選擇基因片段，采用原核表達(dá)技術(shù)獲得重組蛋白并制備相應(yīng)抗體，再利用IFA或HCT技術(shù)檢測組織中的DPV[31]，隨著診斷方法不斷完善，鴨瘟也將會得到更好控制。由多殺性巴氏桿菌引起的禽霍亂和鴨瘟病毒引起的鴨瘟，已被認(rèn)識和研究多年，但仍然是影響鴨的重要疾病。對此，疫苗接種是預(yù)防和控制DP的主要手段，疫苗分為滅活苗和弱毒苗兩大類，通常國內(nèi)使用弱毒苗對鴨群進(jìn)行免疫接種。但潛伏期和間歇性排毒是弱毒苗使用中最重要的制約因素之一，完全避免病毒基因組DNA是解決該問題的唯一可能方法。病毒載體疫苗的優(yōu)勢，是能夠區(qū)分受感染與接種疫苗的宿主[32]。gD DNA和蛋白質(zhì)組合的小鼠模型中對DPV攻擊感染后產(chǎn)生中和抗體，誘導(dǎo)了淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)及IL-4、IL-12和IFN-g產(chǎn)生，為DP的低疫苗接種率和減少鴨DP暴發(fā)提供了很好的解決方案。另外，含有多發(fā)性巴氏桿菌菌株X-73重組外膜蛋白H（rOmpH）和鴨瘟減毒活疫苗的組合疫苗，不僅不會影響鴨群的抗體反應(yīng)，同時保護(hù)鴨群免受實(shí)驗(yàn)性多球菌感染[33]。但應(yīng)防止細(xì)菌或病毒基因組不穩(wěn)定，導(dǎo)致難以產(chǎn)生重組病毒。通過NHEJ/CRISPR-Cas9系統(tǒng)對DPV基因組進(jìn)行編輯，以在UL55-LORF11和UL44/44.5中包含和表達(dá)特定的細(xì)菌抗原ompH-V5基因插入且穩(wěn)定該基因，不僅保護(hù)鴨免受病毒和細(xì)菌的侵害，還有一定的預(yù)防其他疾病的防護(hù)作用，有助于控制和防止鴨發(fā)生病毒與細(xì)菌共感染[34]。對于開發(fā)DPV載體重組疫苗，需要進(jìn)一步進(jìn)行動物試驗(yàn)，以評估該重組疫苗的功效和保護(hù)作用。

5 展 望

長期以來，皰疹病毒感染和潛伏期一直是防控DPV感染最重要的問題，隨著DP疫苗的上市，病毒傳染源和傳播途徑得到有力控制。但在全國范圍內(nèi)DPV出現(xiàn)零星性流行并伴隨發(fā)生基因組變異，對DPV毒株全基因組測序分析發(fā)現(xiàn)，臨床上出現(xiàn)多株新的變異毒株。重組DNA會成為DP疫苗研究的新技術(shù)，但對變異毒株是否具有免疫保護(hù)力，還需要進(jìn)一步研究。此外，DPV的潛在宿主可能是長期病毒攜帶者，容易將感染延續(xù)到環(huán)境中，徹底去除傳染源也是要攻克的難題，同時潛伏感染與細(xì)胞凋亡之間是否存在關(guān)聯(lián)也需要進(jìn)一步研究。