液體活檢在胰腺癌診療中的應用

李洪禎 沈珊珊

南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院消化內(nèi)科，南京 210008

【提要】 液體活檢是一類新興和熱門的無創(chuàng)腫瘤檢測技術(shù)，主要包括循環(huán)腫瘤細胞(CTCs)、循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)、循環(huán)腫瘤RNA(ctRNA)、外泌體等的檢測。除外周血以外，內(nèi)鏡技術(shù)的進步使得對胰液、門靜脈血等體液來源進行液體活檢成為可能。近年來液體活檢在胰腺癌的早期篩查、早期診斷、腫瘤分層、腫瘤復發(fā)檢測以及治療反應預測等方面顯示出無可比擬的優(yōu)勢。本文重點討論液體活檢在胰腺癌診治中的應用現(xiàn)狀及未來的機遇和挑戰(zhàn)。

胰腺癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，5年生存率僅為10%[1]，早期診斷和個體化治療對提高胰腺癌患者生存期至關重要。液體活檢作為一種無創(chuàng)腫瘤檢測技術(shù)，通過檢測人體體液中存在的循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumor cells, CTCs)、循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)、循環(huán)腫瘤RNA(circulating tumor RNA, ctRNA)、外泌體等成分，在胰腺癌的早期篩查、診斷、腫瘤分層以及治療反應監(jiān)測中具有極大的應用前景。借助液體活檢，有望實現(xiàn)對胰腺癌進行更加精準的分子診斷，從而指導治療決策和預后。隨著EUS、ERCP等內(nèi)鏡技術(shù)的發(fā)展，人們更容易獲取胰液、門靜脈血等替代的體液來源用于分析；但受限于現(xiàn)有研究結(jié)果的敏感性不高、可重復性差，目前仍沒有一種有效的液體活檢手段應用于胰腺癌的臨床診療流程。要實現(xiàn)液體活檢從科研探索到臨床應用的轉(zhuǎn)化，需要科研人員和臨床醫(yī)師對檢測手段的可行性、可重復性和成本效益等方面進行綜合評估。本文著重討論液體活檢在胰腺癌診療中的應用。

一、液體活檢的技術(shù)手段

1.ctDNA檢測：既往對胰腺癌組織進行DNA測序明確了胰腺癌的4個驅(qū)動基因，即Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物(kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog, KRAS)、p53腫瘤蛋白(tumor protein p53, TP53)、細胞周期依賴激酶抑制劑2A(cyclin dependent kinase inhibitor 2A, CDKN2A)和SMAD同源蛋白4(SMAD family member 4, SMAD4)，這些基因突變可在胰腺癌發(fā)生的不同階段被檢測到[2]，其中90%以上的胰腺癌患者腫瘤組織可檢出KRAS突變。人體液中包含由凋亡或者壞死的細胞釋放的游離DNA(cell-free DNA, cfDNA)，其中包括來源于原發(fā)和(或)轉(zhuǎn)移病灶脫落的ctDNA，可以檢測到腫瘤特征性的突變。ctDNA的檢測技術(shù)一般可分為靶向測序技術(shù)和非靶向測序技術(shù)，前者基于微滴數(shù)字PCR(droplet digital PCR, ddPCR)技術(shù)，具有更高的靈敏度和特異度，但僅能檢測特定的已知突變；后者基于二代測序技術(shù)，具有更高通量，可以檢測未知的突變、結(jié)構(gòu)變異和拷貝數(shù)變異，但靈敏度略低。ctDNA片段在循環(huán)中的半衰期很短，從16 min到數(shù)小時不等[3]，這也給ctDNA突變的檢測帶來了挑戰(zhàn)。

在胰腺癌相關的研究中，KRAS突變最常應用于ctDNA的檢測，其靈敏度在50%～70%不等[4-5]。近年來ctDNA分析技術(shù)取得了飛速進展，通過改進ctDNA檢測方法，例如基于單鏈建庫和測序方法，較傳統(tǒng)的二代測序和ddPCR技術(shù)，可以使早期胰腺癌患者中KRAS突變的檢出率提高20%[6]。但由于體液中ctDNA豐度受多種因素的影響，以及小部分不攜帶KRAS突變胰腺癌患者的存在，這一比例很難再有所突破。筆者所在課題組最新研究發(fā)現(xiàn)，中國人群不攜帶 KRAS突變的胰腺癌患者比例更高，可達到20%左右，且早期胰腺癌患者的外周血中KRAS突變的檢出率較低(30%～68%)，使得外周血的KRAS突變檢測很難用于胰腺癌的早期篩查。

ctDNA還可以用于對胰腺癌患者治療反應的預測。體液中ctDNA比蛋白標志物變化更迅速，治療期間突變KRAS ctDNA水平的變化是治療反應的早期指標[7-8]。此外，ctDNA還可用于檢測微小殘留病灶和預測腫瘤復發(fā)，術(shù)后檢測到KRAS ctDNA突變的患者，腫瘤復發(fā)率更高[4]。

2.外泌體檢測：外泌體是由多種機體細胞或腫瘤細胞分泌并釋放到各種體液中的一種細胞外囊泡,直徑40～100 nm，具有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)，并攜帶細胞特異的蛋白、脂質(zhì)和核酸[9]。研究發(fā)現(xiàn)，通過蛋白質(zhì)組學對血漿來源的外泌體進行分析可以識別特定的癌癥類型和腫瘤[10]。外泌體的提取有多種方法，包括超速離心法、密度梯度離心法、聚合物沉淀法、超濾法，以及特定抗體免疫親和捕獲法。外泌體的分析主要是對外泌體組成成分包括DNA、RNA和蛋白質(zhì)的檢測，其優(yōu)勢在于外泌體結(jié)構(gòu)的循環(huán)穩(wěn)定性。研究發(fā)現(xiàn)外泌體內(nèi)RNA類物質(zhì)如miR-10b[11]、蛋白質(zhì)類如磷脂酰肌醇蛋白聚糖1(glypican 1, GPC1)[12]等標志物對鑒別胰腺癌具有較高的靈敏度和特異度。利用多種外泌體來源的生物標志物的組合可以進一步提高診斷胰腺癌的靈敏度和特異度[13]。

3.CTCs檢測：CTCs是指腫瘤原發(fā)灶或者轉(zhuǎn)移灶脫落的腫瘤細胞進入循環(huán)系統(tǒng)，其在外周血有核細胞中占有量極少，每106～8個白細胞中僅含10～100個CTCs。理論上CTCs可以來源于多個腫瘤區(qū)域以及遠處轉(zhuǎn)移灶，相較于單一位點的組織活檢，CTCs更能反映腫瘤的全貌和一致性，使得CTCs檢測在腫瘤早期診斷、殘留病灶檢出、治療反應監(jiān)測等方面具有廣闊的應用前景。CTCs的檢測可以通過RT-PCR手段或基于抗原抗體捕獲技術(shù)，隨著技術(shù)的發(fā)展，CTCs富集手段不斷進步。目前最常應用的CellSearch是唯一被美國食品藥品監(jiān)督管理局批準用于檢測血液中CTCs的標準技術(shù)，該技術(shù)利用包被上皮細胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule, EpCAM)抗體的免疫納米顆粒捕獲CTCs[14]。

在胰腺癌領域，研究者發(fā)現(xiàn)約42%的患者在外周血中可以檢測到至少1個CTCs，但CTCs陽性通常預示著進展期病變和更短的生存期，因此對于早期胰腺癌患者或交界可切除的胰腺癌患者，CTCs的檢測價值可能不高[15]。在一項納入75例局部晚期胰腺癌患者的多中心研究中，僅有5%的患者可以檢測到CTCs[16]。

二、液體活檢的體液來源

作為消化器官，胰腺相關的液體活檢取材來源廣泛。由于侵入性極小，獲取方便，外周血是液體活檢來源的首選。然而，在胰腺惡性腫瘤中，盡管腫瘤物質(zhì)富集技術(shù)取得了進展，但外周血分析仍然依賴于腫瘤負荷的程度。在胰腺癌廣泛轉(zhuǎn)移之前，外周血中腫瘤來源的成分一直非常低，因此尋找可替代的含有腫瘤特異性物質(zhì)更多的體液來源是拓展液體活檢在胰腺癌中應用的重要途經(jīng)。除常規(guī)利用的外周血、尿液和唾液外，還可以利用胰液、門靜脈血以及囊液等進行液體活檢，但這些液體的獲取具有一定的侵入性和操作難度。

1.胰液：胰液是由胰腺分泌的消化液，是胰腺癌相關的液體活檢最好的體液，理論上包含更多腫瘤細胞來源的DNA、RNA、蛋白質(zhì)和外泌體，對其檢測有可能提高這些生物標志物的靈敏度和特異度[17]。國外報道常用的胰液獲取的方式是通過ERCP技術(shù)插入造影劑導管負壓抽吸胰液，同時應用促胰液素可獲取更多的胰液，但目前促胰液素在我國尚未應用，且考慮到ERCP術(shù)后有1%～25%的患者有胰腺炎的并發(fā)癥，因此ERCP手段收集胰液具有一定的風險性。內(nèi)鏡下鼻胰管引流(endoscopic nasopancreatic drainage, ENPD)是另外一種在臨床上收集胰液的方法，ENPD管可以在主胰管放置3 d，這種方式可以持續(xù)引流大量胰液用于后續(xù)分析[18]。與其他液體活檢類似，胰液可以進行CTCs、ctDNA、ctRNA和外泌體分析。由于胰液中富含消化酶，因此需要關注樣本收集的時效性[19]，警惕降解的可能，收集后立刻放在深低溫冰箱儲存，并且加入蛋白酶抑制劑或RNA穩(wěn)定劑以防止待測物質(zhì)降解。

胰液中KRAS突變檢測診斷胰腺癌的靈敏度在66%～100%，診斷胰腺導管內(nèi)乳頭狀黏液腫瘤(intraductal papillary mucinous neoplasm，IPMN)的靈敏度為60%～92%[18]。部分蛋白質(zhì)標志物如S100鈣結(jié)合蛋白P(S100 calcium binding protein P, S100P)、黏蛋白1(mucin1, MUC1)、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen, CEA)、白介素8(interleukin 8, IL8)，中性粒細胞明膠酶相關脂質(zhì)運載蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin, NGAL)和黏蛋白5AC(mucin 5AC, MUC5AC)等在胰腺癌患者來源的胰液中的水平增加[20-21]。此外，胰液外泌體中包含的核酸和蛋白質(zhì)類物質(zhì)較為穩(wěn)定，因此分離胰液中外泌體進行檢測理論上具有更高的價值[22]。筆者所在課題組通過ENPD方式收集的胰液可以成功地提取外泌體，發(fā)現(xiàn)胰腺癌患者胰液中的外泌體蛋白含量較胰腺良性腫瘤患者明顯增多。

2.門靜脈血：門靜脈血是另外一種可行的胰腺癌液體活檢的樣本來源。由于肝臟是胃腸道靜脈經(jīng)門靜脈系統(tǒng)引流血液的首個器官，臨床上大多數(shù)胃腸道惡性腫瘤(胰、膽、結(jié)腸)遠處轉(zhuǎn)移擴散最常見的部位是肝臟。由于胰腺靜脈血液首先流入肝臟，在肝臟的過濾作用后進入外周，使得更靠近胰腺的門靜脈血中富含更多的胰腺癌來源的物質(zhì)。門靜脈血的獲取主要依賴術(shù)中或者EUS引導下細針穿刺活檢(EUS-guided fine needle aspiration, EUS-FNA)技術(shù)，目前技術(shù)成熟，安全可靠，但操作難度相對較高。

門靜脈血在CTCs檢測中具有較大的優(yōu)勢，平均每7.5 ml血液可以獲取(118.4±36.8)個CTC，是外周血含量的100多倍[23]。在可切除或交界可切除胰腺癌患者中，門靜脈血CTCs數(shù)值略低，約83.2個/7.5 ml[24]。即便如此，多項研究發(fā)現(xiàn)門靜脈血CTCs在96%～100%的胰腺癌患者中均可以檢測到[23,25]。門靜脈血CTCs數(shù)值更高的患者發(fā)生肝轉(zhuǎn)移的風險更高[26]。筆者所在課題組的一項新近研究發(fā)現(xiàn)，31例胰腺癌患者有30例可以在門靜脈血中檢測到CTCs，27例在外周血中檢測到CTCs，且門靜脈血中CTCs數(shù)量較外周血明顯增加。TWIST陽性的間質(zhì)型CTCs較EpCAM陽性的上皮型CTCs與患者的腫瘤負荷和預后顯著相關[27]。Kawamura等[28]報道，胰腺癌患者門靜脈血的外泌體內(nèi)的某些miRNA如miR-4525、miR-451a和miR-21較外周血更高，可作為胰腺癌患者預后的標志物。

三、液體活檢在胰腺癌診療中的應用

1.胰腺癌的篩查：近期由南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院消化科牽頭的《中國胰腺癌高危人群早期篩查和監(jiān)測共識意見》[29]指出，對具有遺傳性胰腺癌家族史的高危個體，例如Peutz-Jeghers綜合征的患者[種系絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶11(serine-threonine kinase 11, STK11)基因突變攜帶者]、CDKN2A基因突變攜帶者以及陽離子胰蛋白酶原基因(cationic trypsinogen gene, PRSS1)突變的常染色體顯性遺傳性胰腺炎患者，應進行胰腺癌早期篩查?；谕庵苎獦颖镜亩鷾y序技術(shù)對于明確是否攜帶上述基因突變至關重要，有助于篩選和富集胰腺癌高危人群，納入后續(xù)篩查流程。

2.胰腺癌的診斷：臨床上胰腺癌的診斷依賴于影像學檢查和EUS-FNA獲取組織進行腫瘤活檢，但EUS-FNA面臨假陰性的問題，有時即使重復活檢，仍然難以獲取腫瘤細胞用于診斷。液體活檢是胰腺癌診斷的重要補充手段。但目前為止，回顧大量胰腺癌液體活檢相關的研究，即便是同一種標志物，在胰腺癌診斷中的效能在不同的研究中差異很大，結(jié)果一致性低。為了提高液體活檢在胰腺癌診斷中的檢出率，其中一種策略是將不同類型的液體活檢手段比如DNA、RNA、蛋白等結(jié)合起來，以捕獲更多腫瘤的生物學特征。一項研究中聯(lián)合兩種外泌體來源的蛋白(GPC1和CD63)在區(qū)分胰腺癌和健康人群的靈敏度和特異度可以達到99%和82%[30]。另一項納入501例患者的研究中，作者開發(fā)了一種含有8個來自血漿外泌體的長鏈非編碼RNA組合能夠識別可切除的Ⅰ期和Ⅱ期胰腺癌患者(AUC=0.949)[31]。

3.胰腺癌手術(shù)和復發(fā)監(jiān)測及治療應答：胰腺癌治療決策選擇的關鍵是對可切除性的判斷，主要取決于局部血管受累程度和有無遠處轉(zhuǎn)移。影像學是用于評估患者能否切除的最佳手段，但部分微小轉(zhuǎn)移灶很難通過影像學發(fā)現(xiàn)[32-33]。在可切除胰腺癌患者中，約有60%的胰腺癌患者術(shù)后3年內(nèi)復發(fā)，這可能提示這些患者在手術(shù)切除之前已發(fā)生微小轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn)液體活檢有助于發(fā)現(xiàn)這些隱匿性轉(zhuǎn)移性病灶的潛力，從而使患者避免不必要的手術(shù)帶來的并發(fā)癥。相對于原發(fā)灶，ctDNA被證實與遠端轉(zhuǎn)移灶突變一致性更高[33]。很多研究探究了液體活檢手段在胰腺癌術(shù)后復發(fā)檢測中的價值。據(jù)報道，術(shù)前檢測到KRAS突變的可切除胰腺癌患者術(shù)后復發(fā)風險更高，若術(shù)后突變KRAS ctDNA轉(zhuǎn)陰，復發(fā)風險也相應下降[4]。與之類似，術(shù)后CTCs陽性患者發(fā)生轉(zhuǎn)移風險也更高[34]。此外，也有報道，一些miRNA(如miR-373-3p、miR-744、miR-415a)[35]、蛋白標志物(如GPC1)[36]等也可用于胰腺癌復發(fā)檢測。

僅有局部病變但伴有周圍大血管浸潤的胰腺癌患者可進一步根據(jù)受累程度分為交界性可切除胰腺癌和局部晚期胰腺癌，這一類患者有可能經(jīng)過術(shù)前新輔助放化療增加根治性切除的概率。目前新輔助化療后治療反應的檢測手段有限，主要依據(jù)影像學和CA19-9，難以準確評估。研究發(fā)現(xiàn)CTCs和ctDNA可以有效預測新輔助化療患者的治療反應和復發(fā)[37]，新輔助化療后仍檢測到ctDNA的患者提示疾病發(fā)生進展[8,38]。此外，有研究還利用液體活檢手段進行化療敏感度的驗證。在不可切除的胰腺癌患者中，通過分離CTCs細胞和構(gòu)建藥物基因組學模型預測不同化療方案的療效，可以顯著提高患者的生存期[38]。在一項納入38例接受FOLFIRINOX一線化療的晚期胰腺癌患者的研究中，ctDNA檢出的增加與患者化療耐藥和病情進展有關[39]。

四、液體活檢的多種標志物聯(lián)合和評分系統(tǒng)

多項胰腺癌的液體活檢研究數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)單一的標志物很難滿足臨床上對胰腺癌診治的要求，因此開發(fā)多種標志物聯(lián)合的液體活檢是目前液體活檢研究的方向之一。有研究利用外周血的蛋白標志物和ctDNA開發(fā)了一種工具“CancerSEEK”，對包含胰腺癌在內(nèi)的5種癌癥的早期診斷特異性為69%～90%[40]。另外一項研究利用包含29種蛋白的微陣列可以有效將Ⅰ期和Ⅱ期胰腺癌患者與健康對照組區(qū)分開來(AUC=0.96)[41]。CA19-9作為一種臨床上廣泛應用的糖類抗原標志物，臨床價值有限。現(xiàn)有研究探討了CA19-9聯(lián)合血清學或胰液中其他標志物，如代謝標志物[42]、DNA甲基化[43]、miRNAs[13]、蛋白[21]等，可以實現(xiàn)更高的準確性和靈敏度。有研究通過患者尿液中的3種蛋白標志物建立胰腺癌風險評分“PancRISK”，可將早期胰腺癌檢測的靈敏度和特異度提高到85%以上[44]。此外，機器學習是近年來腫瘤早期診斷的熱門研究領域，通過多種類型的生物學標志物，包括CA19-9、KRAS突變聯(lián)合部分蛋白、RNA等，利用機器學習建立預測模型，準確性高達92%[45]。

綜上所述，未來提高胰腺癌生存期的有效策略是更早地發(fā)現(xiàn)病變，更加精準的治療決策以及動態(tài)化的腫瘤檢測。液體活檢具備實時動態(tài)檢測、克服腫瘤異質(zhì)性、提供全面檢測信息等獨特優(yōu)勢，在未來極有可能被納入胰腺癌的綜合診療過程，為達到上述目標提供有價值的信息，實現(xiàn)更加精準的“分子診斷”。遺憾的是，截至目前仍沒有一種液體活檢手段應用于臨床。筆者認為，如何克服當前液體活檢手段的敏感度差、規(guī)范性和可重復性不佳、經(jīng)濟效益低等瓶頸是胰腺癌液體活檢未來研究中需考慮的重要問題，后續(xù)仍需要大樣本量的前瞻性研究，以嚴格評估液體活檢在胰腺癌診療中的價值。

利益沖突所有作者聲明無利益沖突