A型塞內(nèi)卡病毒VP1蛋白的原核表達(dá)及其多克隆抗體的制備

農(nóng)作榮，王 豪，牛晨霞，全東群，曾 悅，任同偉，王玉旭，陳 櫻,歐陽康，黃偉堅，韋祖樟

（廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 動物傳染病與分子免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530005）

A型塞內(nèi)卡病毒（Senecavirus A,SVA）是一種RNA病毒，曾被命名為塞內(nèi)卡山谷病毒（Seneca valley virus,SVV），目前是小RNA病毒科塞內(nèi)卡病毒屬的唯一成員[1]。病毒粒子呈二十面體結(jié)構(gòu)，直徑25～30 nm，無囊膜，衣殼蛋白包裹著基因組RNA組成核衣殼[2]。

2002年，SVA病毒首次在細(xì)胞培養(yǎng)物中被發(fā)現(xiàn)，并被命名為SVV，同時SVV毒株被認(rèn)為沒有致病性[2]。有研究發(fā)現(xiàn)塞內(nèi)卡病毒具有溶瘤的特性，之后在臨床醫(yī)學(xué)上被用做特定癌癥的治療[3-4]。但有研究人員在后來的研究中發(fā)現(xiàn)SVA能引起豬的相關(guān)水泡病的臨床癥狀[5]。隨后在加拿大、美國、巴西等國家均有報道證實(shí)，SVA與豬的特發(fā)性水皰病相關(guān)[6-7]。2015年，在廣東省出現(xiàn)水皰病癥狀的某豬場發(fā)現(xiàn)SVA的存在，并證實(shí)了出現(xiàn)的水皰性疾病的臨床癥狀與SVA相關(guān)[8]。隨后在我國的福建、河南等其他省份豬中相繼出現(xiàn)SVA引起的豬水皰性疾病的相關(guān)癥狀[9]。SVA引起豬的臨床癥狀與經(jīng)典的水皰性疾病類似，如口蹄疫（foot and mouth disease,FMD）、豬傳染性水皰病（swine vesicular disease,SVD）、豬水皰性皮疹（vesicular exanthema of swine,VES）、水皰性口炎（vesicular stomatitis,VS）等，均在皮膚或黏膜處出現(xiàn)水皰等癥狀[10]，在臨床上很難將這些病原與SVA引起的癥狀區(qū)分，塞內(nèi)卡病毒對于養(yǎng)豬業(yè)的危害不容小覷。

對于SVA的確診，需要通過實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)等手段。現(xiàn)階段用于SVA的實(shí)驗(yàn)室檢測方法，主要包括病原學(xué)診斷、血清學(xué)診斷和分子生物學(xué)診斷等[11]。病原學(xué)診斷包括病毒分離鑒定等，主要是指通過細(xì)胞培養(yǎng)方法將病原體從病料中分離出來，并對其進(jìn)行鑒定。血清學(xué)診斷是利用抗原抗體特異性結(jié)合的原理，測定被檢動物血清中的特異性抗體或者被檢材料中的抗原，主要包括病毒中和試驗(yàn)、間接免疫熒光試驗(yàn)（indirect immunofluorescence assay,IFA）、間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）等，如Dvorak等[12]利用純化的VP1、VP2、VP3的重組蛋白包被酶標(biāo)板，通過對臨床樣本的檢測與數(shù)據(jù)的分析，建立了可用于鑒定SVA VP2血清抗體的間接酶聯(lián)免疫吸附方法。分子生物學(xué)診斷主要包括常規(guī)RT-PCR、熒光定量PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）、巢式PCR及核酸分子雜交技術(shù)等，均可有效地檢測SVA[11]，其中RT-PCR與qRT-PCR較為常用。

本實(shí)驗(yàn)室通過對廣西各地區(qū)規(guī)模豬場的臨床病料檢測發(fā)現(xiàn)，臨床樣品中有多個SVA陽性材料，說明廣西豬場存在一定程度的SVA感染。一個切實(shí)可行的SVA血清學(xué)診斷方法的建立對于SVA的監(jiān)控具有重要意義。本研究旨在通過表達(dá)A型塞內(nèi)卡病毒的衣殼蛋白VP1，并制備其多克隆抗體，為后期針對廣西乃至全國A型塞內(nèi)卡病毒血清學(xué)檢測方法的建立提供生物學(xué)材料，同時為SVA抗體診斷試劑盒、疫苗的研發(fā)及結(jié)構(gòu)蛋白VP1的功能研究奠定了良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病毒、細(xì)胞、血清抗體和質(zhì)粒 DH5α感受態(tài)細(xì)胞、BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞購自康為世紀(jì)生物科技有限公司；SVA分離毒株、原核表達(dá)載體pET-32a（+）、PK-15細(xì)胞、Marc-145細(xì)胞、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）、豬偽狂犬病病毒（Porcine pseudorabies virus,PRV）、豬圓環(huán)2型病毒（Porcine circovirus type 2,PCV2）、豬瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）、PRRSV陽性血清抗體、PRV陽性血清抗體、PCV2陽性血清抗體、CSFV陽性血清抗體均由廣西大學(xué)動物傳染病與分子免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試驗(yàn)動物 雌性新西蘭大白兔購自廣西大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.3 主要試劑 T4 DNA連接酶、BstZ17Ⅰ和SbfⅠ限制性內(nèi)切酶購自紐英倫生物技術(shù)（北京）有限公司；異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）購自北京索萊寶科技有限公司；病毒RNA提取試劑盒、DNA片段純化回收試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒均購自TaKaRa公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)及Ni瓊脂糖凝膠均購自北京康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司；r-Protein A、FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG（H+L）購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；HRP-山羊抗兔IgG、FITC標(biāo)記的山羊抗豬IgG購自Abcam公司。

1.4 SVA VP1引物的設(shè)計與合成 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室分離到的SVA-GX01（GenBank登錄號：MK039162）的VP1基因序列設(shè)計一對引物，并在上、下游5′端分別引入限制性內(nèi)切酶BstZ17Ⅰ和SbfⅠ的識別位點(diǎn)，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為792 bp。引物由上海杰李生物技術(shù)有限公司合成。上游引物：5′-cagGTATACtcc accgacaacgctgagac-3′（下劃線為BstZ17Ⅰ的識別位點(diǎn)）；下游引物：5′-ctgCCTGCAGGttgcatcagcttttgct tg-3′（下劃線處SbfⅠ識別位點(diǎn)）。

1.5 SVA VP1基因的擴(kuò)增 利用病毒RNA抽提試劑盒提取SVA-GX01分離株RNA，以提取的SVA RNA為模板，使用設(shè)計的下游引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，然后進(jìn)行VP1基因序列的擴(kuò)增，獲得的PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。RNA反轉(zhuǎn)錄體系（25 μL）：5× Buffer 5 μL，dNTP mix 2 μL，M-MLV Reverse Transcriptase 0.5 μL，下游引物1 μL，RNasin酶抑制劑0.5 μL，RNA模板16 μL。42℃反轉(zhuǎn)錄1 h。PCR反應(yīng)體系（25 μL）：PrimerSTAR Max DNA Polymerase 12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，DNA模版3 μL，ddH2O補(bǔ)至25 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min；98℃變性10 s；53℃退火5 s，72℃延伸10 s，共32個循環(huán)；72℃延伸10 min。利用DNA片段純化回收試劑盒回收目的片段，并進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.6 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 利用BstZ17Ⅰ和SbfⅠ同時酶切PCR純化產(chǎn)物和pET-32a（+）載體，置于37℃水浴鍋中過夜，膠回收酶切產(chǎn)物并使用T4 DNA連接酶將VP1擴(kuò)增產(chǎn)物克隆至原核表達(dá)載體pET-32a（+），構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-32a-VP1。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞并涂布于含氨芐青霉素的LA平板，然后挑取單個菌落進(jìn)行菌液PCR并經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，篩選出陽性表達(dá)菌后再擴(kuò)大培養(yǎng)。利用質(zhì)粒提取試劑盒抽提質(zhì)粒，并對質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，將經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定為陽性的重組質(zhì)粒送公司測序。

1.7 重組SVA VP1蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與可溶性分析 將鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，并涂布于含有氨芐青霉素的LA平板，挑取單個菌落進(jìn)行菌液PCR，篩選陽性菌。將陽性菌接種于LB培養(yǎng)基，并置于200 rpm、37℃搖床中培養(yǎng)12 h后，按1∶100的比例擴(kuò)增培養(yǎng)4 h。加入濃度為0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)劑，16℃誘導(dǎo)12 h[13-14]。最后利用8 mL PBS重懸菌體，超聲破碎菌體（300 W，破碎3 s，間歇4 s，150次），5000 ×g、4℃離心20 min，分別收集上清液和沉淀（包涵體）進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。

1.8 重組SVA VP1蛋白的純化 超聲完成后，4℃、10 000×g離心20 min收集上清液，并利用0.22 μm濾器除去雜質(zhì)。將收集的濾液負(fù)載上柱，使之與Ni-NTA瓊脂糖樹脂充分混勻，先使用15倍柱體積的清洗緩沖液（咪唑濃度依次為20、40和60 mmol/L）沖洗柱子，然后使用5倍柱體積的洗脫緩沖液（咪唑濃度為500 mmol/L）進(jìn)行洗脫，使用2 mL EP管收集純化后的重組蛋白，每管收集1.5 mL，共收集5管。利用BCA蛋白定量試劑盒測定出純化后重組SVA VP1蛋白的濃度。

1.9 多克隆抗體的制備 采集2 mL首次免疫前兔血液并分離血清作為陰性對照，初次免疫按照1 mg/只的劑量將VP1蛋白在非變性條件下與等體積弗氏完全佐劑充分乳化，兩周后加強(qiáng)免疫，蛋白改用弗氏不完全佐劑乳化，一周后進(jìn)行第3次免疫，免疫結(jié)束后第5 d進(jìn)行心臟采血，分離并收集血清。

1.10 多克隆抗體的純化 以4%交聯(lián)瓊脂糖凝膠為基質(zhì)，r-Protein A為基配的親和層析純化多克隆抗體。將2 mL介質(zhì)加入層析柱，室溫靜置10 min。用5倍柱體積的平衡緩沖液（20 mmoL/L PB、0.15moL/L KCl）平衡層析柱，至流出液導(dǎo)電率與pH不變。將血清10 000 ×g，4℃離心10 min，并用0.45 μm濾器除去雜質(zhì)，負(fù)載上柱，使用10倍柱體積的平衡緩沖液洗滌層析柱，收集流出液。用洗脫緩沖液（0.1 mol/L甘氨酸，pH3.0）洗脫，收集洗脫液，洗脫后立即用堿性緩沖液（Tris-HCl，pH9.0）中和收集到的抗體，置于-20℃保存。

1.11 多克隆抗體效價測定 將重組SVA VP1蛋白以0.2 μL/孔4℃過夜包被ELISA板，PBST洗滌3次，每次3 min；每孔加入300 μL含1%的PBST，37℃封閉2 h，PBST洗滌3次，每次3 min；將多克隆抗體（1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000、1∶32 000、1∶64 000稀釋）加入孔中，每孔100 μL，每個稀釋度設(shè)兩個重復(fù)，同時設(shè)同等稀釋倍數(shù)的陰性對照，37℃孵育1 h，PBST洗滌5次，每次3 min；各孔加入100 μL 1∶10 000稀釋的HRP-山羊抗兔IgG，37℃孵育45 min，PBST洗滌5次，每次3 min；向各孔內(nèi)加入100 μL TMB底物溶液，反應(yīng)10 min，加入100 μL 2 mol/L的H2SO4終止反應(yīng)；利用酶標(biāo)儀測定OD450值。

1.12 多克隆抗體Western blot分析 將SVA接種于PK-15細(xì)胞，收取出現(xiàn)病變的病毒液，同時收取沒有接毒的PK-15細(xì)胞液作為陰性對照，5000× g離心5 min，取40 μL上清液加入10 μL 5× Loading buffer混勻，沸水浴中煮10 min。取10 μL進(jìn)行SDS-PAGE電泳，根據(jù)蛋白條帶大小剪取合適的PVDF膜，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜完成后使用現(xiàn)配的TBS洗滌，5%的脫脂奶粉37℃下封閉2 h，TBS洗滌3次，多克隆抗體用1%BSA 1∶1000稀釋，37℃下孵育2 h，TBS洗滌3次，HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG用1%脫脂奶粉1∶10000稀釋，37℃下孵育1 h，TBS洗滌5次。使用現(xiàn)配的DAB工作液顯色3～5 min，使用Western blot蛋白印跡成像儀進(jìn)行拍照。

1.13 多克隆抗體間接免疫熒光分析 將PK-15細(xì)胞、Marc-145細(xì)胞接種6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待形成約80%單層時PK-15細(xì)胞分別接種SVA、CSFV、PRV、PCV2（接種劑量均為MOI=0.1），同時設(shè)置陰性對照細(xì)胞；Marc-145細(xì)胞接種PRRSV，同時設(shè)置陰性對照細(xì)胞，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h；用預(yù)冷無水甲醇4℃固定細(xì)胞30 min；PBS洗滌3次，每次3 min，將多克隆抗體用PBS 1∶100稀釋，500 μL/孔，同時使用相應(yīng)的豬陽性血清抗體（1∶50稀釋）作為陽性對照，37℃孵育2 h；PBS洗滌3次，每次3 min，將FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG（H+L）或者FITC標(biāo)記的山羊抗豬IgG用PBS 1∶400稀釋作為二抗，500 μL/孔，37℃孵育1 h；PBS洗滌5次，每次3 min。置于倒置熒光顯微鏡下觀察、拍照。

2 結(jié)果

2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 以SVA毒株RNA為模板，利用設(shè)計的VP1基因引物RT-PCR擴(kuò)增獲得一條約792 bp的片段（圖1），與預(yù)期大小一致。將獲得的片段克隆至載體pET-32a（+）中，得到的重組質(zhì)粒命名為pET-32a-SVA-VP1。對重組表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行BstZ17Ⅰ和SbfⅠ雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)電泳檢出約792 bp的目的片段和pET-32a（+）載體片段（圖1），與預(yù)期大小一致。測序結(jié)果表明重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 SVA VP1 基因RT-PCR擴(kuò)增和重組質(zhì)粒pET-32a-SVA-VP1的雙酶切鑒定Fig.1 RT-PCR amplification of SVA VP1 gene and identification of pET-32a-SVA-VP1 with double-enzyme digestion

2.2 重組SVA VP1蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與可溶性蛋白純化分析 通過對菌體裂解液的上清液和沉淀SDSPAGE電泳分析發(fā)現(xiàn)，重組VP1蛋白在沉淀與上清液中均有表達(dá)，但上清液中表達(dá)量較少（圖2）。利用Ni-NTA瓊脂糖樹脂對菌體裂解產(chǎn)物上清液中的重組VP1蛋白進(jìn)行了純化，SDS-PAG分析純化后的重組蛋白大小與預(yù)期條帶大小相符，重組蛋白大小為49 KDa，該樣品純度約為90%（圖2），利用BCA蛋白定量試劑盒測定該樣品的濃度為0.74 mg/mL。

圖2 重組SVA VP1蛋白的表達(dá)與純化SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of the expression and purified of recombinant SVA VP1 protein

2.3 多克隆抗體效價測定 利用間接ELISA測定抗體效價結(jié)果表明，多克隆抗體孔OD450值與陰性對照孔的OD450值的比值（P/N）＞2.1時，最高稀釋度為該多克隆抗體的效價，純化后的兔抗SVA VP1蛋白的多克隆抗體效價達(dá)1∶64 000（圖3），表明在非變性條件下，重組SVA VP1蛋白能誘導(dǎo)新西蘭大白兔產(chǎn)生良好的免疫應(yīng)答。

圖3 SVA VP1 蛋白多克隆抗體效價測定Fig.3 Titer determination of the polyclonal antibodies against SVA VP1 protein

2.4 多克隆抗體Western blot 對重組蛋白VP1多克隆抗體進(jìn)行Western blot結(jié)果表明，多克隆抗體能與SVA感染的PK-15細(xì)胞上清液結(jié)合出現(xiàn)條帶，條帶大小與VP1蛋白在病毒中表達(dá)大?。?0 kDa）一致（圖4）。

圖4 Western blot驗(yàn)證多克隆抗體Fig.4 Western blot identification of the polyclonal antibody

2.5 多克隆抗體間接免疫熒光分析 由重組SVA VP1蛋白多克隆抗體的間接免疫熒光檢測結(jié)果可知（圖5），SVA感染的PK-15細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)了特異性的綠色熒光信號，陰性對照細(xì)胞內(nèi)未見熒光信號；并且該多克隆抗體與CSFV、PRV、PCV2感染的PK-15細(xì)胞以及PRRSV感染的Marc-145細(xì)胞無交叉反應(yīng)（圖5），表明該多克隆抗體能特異性識別SVA。

圖5 SVA VP1蛋白多克隆抗體間接免疫熒光分析Fig.5 Indirect immunofluorescence analysis of polyclonal antibodies against SVA VP1 protein

3 討論

SVA與其他小RNA病毒的基因組非常相似，具有典型的L-4-3-4布局[15]。病毒蛋白翻譯過程中，病毒多聚蛋白首先被病毒自身編碼的蛋白水解酶和細(xì)胞蛋白酶裂解成先導(dǎo)蛋白（L）和P1、P2、P3三個蛋白中間體。P1編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白，P2和P3編碼病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白。P1基因區(qū)域主要編碼4個結(jié)構(gòu)蛋白（VP4、VP2、VP3和VP1），形成病毒的外殼，P2和P3基因區(qū)域編碼7個非結(jié)構(gòu)蛋白（2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D）[16]。VP1蛋白作為該病毒重要的結(jié)構(gòu)蛋白，在對SVA-GX01與原性毒株SVV-001的結(jié)構(gòu)蛋白VP1進(jìn)行氨基酸位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，SVA-GX01存在較多的氨基酸位點(diǎn)突變，這些氨基酸位點(diǎn)的突變與該毒株的毒力變化是否相關(guān)值得研究。而本研究中SVA VP1多克隆抗體的制備為后續(xù)研究SVA打下了良好的基礎(chǔ)。有研究者將SVA VP1克隆至原核表達(dá)載體pET-24b并誘導(dǎo)其可溶性表達(dá)[12]。pET-24b載體與pET-32a載體是屬于同一系列載體，最主要的區(qū)別在于酶切位點(diǎn)的不同，載體標(biāo)簽與其他功能基本一致，且本研究的表達(dá)條件與其基本一致，故蛋白表達(dá)結(jié)果基本一致。Houston等[17]通過VP1 ELISA與IFA檢測了美國的SVA流行率，證實(shí)了VP1 ELISA作為檢測臨床血清SVA抗體的可行性，為后續(xù)的塞內(nèi)卡抗體診斷試劑盒的研發(fā)提供了理論依據(jù)與方法指導(dǎo)。

在本研究中VP1重組蛋白以包涵體和可溶性兩種形式表達(dá)，其可溶性的表達(dá)量相對較少，但通過大量表達(dá)純化后獲得了較高濃度的可溶性的重組SVA VP1蛋白，濃度達(dá)到免疫要求。本研究分別嘗試了16℃～37℃不同的溫度梯度及不同的IPTG濃度梯度，在16℃與終濃度0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)條件下可溶性蛋白濃度較高。重組蛋白在低溫與低誘導(dǎo)劑濃度條件下表達(dá)速度較慢，這樣更有利于蛋白的正確折疊，能更好的保留VP1的免疫原性；另外，在純化重組蛋白時優(yōu)化了流穿液的咪唑濃度（咪唑濃度依次為20、40和60 mmol/L），得到了較高純度的重組蛋白，大大提高了多克隆抗體的特異性。

本研究從免疫兔血清中成功純化出抗SVA VP1的多克隆抗體，Western blot結(jié)果顯示，該多克隆抗體能識別SVA抗原，并且不與PRRSV、CSFV、PRV、PCV2這四種常見病毒發(fā)生交叉反應(yīng)。間接免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果也表明多克隆抗體能識別SVA抗原。重組蛋白成功誘導(dǎo)新西蘭大白兔產(chǎn)生了良好的免疫應(yīng)答反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明純化的SVA VP1重組蛋白及其多克隆抗體可用于廣西塞內(nèi)卡病毒的血清學(xué)檢測及后續(xù)對于該病毒的研究。純化SVA VP1重組蛋白并制備及其多克隆抗體，可為廣西乃至全國豬塞內(nèi)卡病毒病血清學(xué)檢測方法的建立提供良好的生物材料，同時為SVA抗體診斷試劑盒、疫苗的研發(fā)及結(jié)構(gòu)蛋白VP1的功能研究奠定良好的基礎(chǔ)。