2021 年天津市規(guī)模化奶牛場隱孢子蟲病調(diào)查

劉瑩/天津市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 300402

隱孢子蟲（Cryptosporidium sp）是Tyzzer 于上世紀(jì)初（1907 年）在實(shí)驗(yàn)小鼠的胃腸道內(nèi)首先發(fā)現(xiàn)的能引起人和多種動(dòng)物腹瀉的寄生原蟲。隱孢子蟲病是隱孢子蟲感染引起的一種慢性、進(jìn)行性、接觸性傳染病。隱孢子蟲病潛伏期長，一年四季均可發(fā)生，無有效阻斷措施和治療措施，一旦感染往往難以治愈，只有淘汰根除。該病主要感染初生犢牛、哺乳犢牛和斷奶犢牛，部分泌乳牛也可感染。該病在天津地區(qū)關(guān)注度較低，因此，規(guī)模牛場全面的檢測的報(bào)道不多。經(jīng)調(diào)研初步了解，本地區(qū)犢牛腹瀉比較普遍，漸進(jìn)性消耗較大，嚴(yán)重影響后期奶牛的產(chǎn)奶量。嚴(yán)重的導(dǎo)致犢牛死亡，危害嚴(yán)重。基于此，在天津市規(guī)模化牛場開展了該病流行率測量的橫斷面研究，為科學(xué)防控該病提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 目標(biāo)群天津市內(nèi)存欄量1000 頭以上的部分規(guī)模奶牛場。

1.2 抽樣策略

1.3 調(diào)查對象研究類型是基于問卷調(diào)查和電話回訪的橫斷面調(diào)查研究。選取天津市的4 個(gè)區(qū)，每區(qū)選一個(gè)牛場進(jìn)行橫斷面抽樣調(diào)查。

1.4 抽樣策略與樣本量的計(jì)算樣本量計(jì)算公式為n=pq/(d/Zα)2，q=1-p，設(shè)允許誤差d=0.1p，Zα 為顯著性檢驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)量，當(dāng)顯著性水平α=0.05 時(shí)，Zα=1.96。根據(jù)文獻(xiàn)設(shè)定我市奶牛場隱孢子蟲感染率P 為28%，應(yīng)采樣本量約1000 份。

式中：n 為樣本量；z 為置信區(qū)間相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)誤差；p 為總體的估計(jì)差異性；q 為100-p；e 為相對誤差。

1.5 病例定義隱孢子蟲病陽性個(gè)體：經(jīng)實(shí)驗(yàn)室隱孢子蟲抗原ELISA 檢測結(jié)果為陽性的牛只。

1.6 檢測方法使用隱孢子蟲糞便抗原ELISA 方法進(jìn)行檢測，該方法的敏感性(Se=95%)和特異性(Sp=96%)。出于經(jīng)費(fèi)考慮，實(shí)際檢測過程中制作一份檢測樣品，結(jié)果代表樣本結(jié)果，樣品檢測沒有重復(fù)。

2 實(shí)驗(yàn)步驟

2.1 儀器設(shè)備微量可移動(dòng)移液器及配套槍頭；恒溫培養(yǎng)箱；4℃冰箱；-20℃冰箱；計(jì)時(shí)器；記號筆；振蕩器；酶標(biāo)儀（含波長450mm 的濾光片）；去離子水或蒸餾水；洗板機(jī)。

2.2 試劑及樣品制備洗滌工作液使用前，濃縮的洗滌液進(jìn)行室溫平衡（20℃～25℃），并混勻，（若有沉淀，最好在37℃很穩(wěn)培養(yǎng)箱中加熱5～10min，直至沉淀完全溶解），蒸餾水進(jìn)行10 倍稀釋，混勻。稀釋液可4℃存放4 周。

企業(yè)應(yīng)把培訓(xùn)工作納入整體規(guī)劃中，企業(yè)領(lǐng)導(dǎo)者應(yīng)在戰(zhàn)略上高度重視員工培訓(xùn)，“把培訓(xùn)工作當(dāng)作一項(xiàng)長期的基礎(chǔ)工作來抓，并將培訓(xùn)情況作為每個(gè)員工工作考核的重要內(nèi)容”［3］。

樣品處理：在2mL EP 管中加入2g 糞便樣品，做好樣品標(biāo)記。加入1mL 樣品稀釋液，對稀釋后的糞便樣品逐份進(jìn)行震蕩混勻處理。靜置樣品，取上清液待檢測。

2.3 實(shí)驗(yàn)步驟

（1）所有試劑在使用前進(jìn)行室溫平衡，使用渦旋振蕩器對所有的試劑進(jìn)行混勻；

（2）去除密封的抗原包背板，沿包裝袋缺口處死開；

（3）取出所需量的微孔板固定與板架上，其余板條放入密封袋內(nèi)保存。）記錄樣品位置。按照要求加入陽性對照，100μL/孔，陰性對照，100μL/孔，稀釋好的樣品，100μL/孔。每孔加入，100μL/孔 1 號酶結(jié)合物。用移液槍緩慢混勻孔中液體；

（4）蓋上封板膜，室溫孵育30min；

（5）洗板：小心去掉封板摸。洗板機(jī)進(jìn)行3 遍洗板；

（7）每孔加入100μL 底物溶液，封板摸封死，室溫避光孵育15min；

（8）終止液，50μL/孔，震蕩混勻，在酶標(biāo)儀450nm 讀數(shù)，記錄樣品及陰性、陽性對照的吸光光度。

2.4 結(jié)果判定陰性對照OD＜0.2，陽性對照OD＞0.2 時(shí)試驗(yàn)成立。

表1 隱孢子蟲糞便樣品ELISA 檢測結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

2.5 問卷調(diào)查設(shè)計(jì)針對養(yǎng)殖場/戶的結(jié)構(gòu)性問卷，內(nèi)容包括牛場的生產(chǎn)管理、地理信息、歷史疫情、傳播相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)因素等。田間調(diào)查和問卷填寫由經(jīng)培訓(xùn)的獸醫(yī)人員統(tǒng)一進(jìn)行。

3 數(shù)據(jù)處理和分析方法

應(yīng)用Excel 進(jìn)行數(shù)據(jù)匯總，應(yīng)用Spss 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。

4 結(jié)果

4.1 樣本量選取天津市試驗(yàn)高水平較高的分布與不同區(qū)的四個(gè)規(guī)模牛場。四個(gè)場分別位于寶坻區(qū)、靜海區(qū)、寧河區(qū)、濱海新區(qū)。并于抽樣前2 周電話確定抽樣框共4 家。共采集1000 份樣品。由于經(jīng)費(fèi)有限，處理并檢測樣品1000 份。

4.2 個(gè)體流行率隱孢子蟲是一種重要的人畜共患寄生性原蟲。隱孢子蟲感染各階段奶牛，是引起犢牛腹瀉的重要誘因。小牛臨床感染的特征是淡黃色腹瀉伴脫水、厭食和酸中毒。食欲減退、消瘦，易繼發(fā)細(xì)菌感染而死亡。

檢測樣本1000 份，陽性樣本123 份，個(gè)體表觀流行率12.3%。根據(jù)個(gè)體診斷實(shí)驗(yàn)的敏感性(Se=95%) 和特異性(Sp=96%)，計(jì)算個(gè)體真實(shí)流行率為9.1%(CL95%,7.3%～10.9%)。

圖1 真實(shí)流行率圖示

圖2 各場樣品隱孢子蟲檢測陽性率

表2 各場樣品檢測隱孢子蟲陽性率和真實(shí)流行率

圖3 各場哺乳犢牛陽性率

表3 各場哺乳犢牛樣品檢測隱孢子蟲陽性率和真實(shí)流行率

圖4 各場斷奶犢牛陽性率

表4 各場斷奶犢牛樣品檢測隱孢子蟲陽性率和真實(shí)流行率

圖5 各場哺乳犢牛陽性率

表5 各場樣品檢測隱孢子蟲陽性率和真實(shí)流行率

4.3 空間分布抽樣的4 個(gè)區(qū)的規(guī)?；瘓鋈繛殛栃詧鳇c(diǎn)。因經(jīng)費(fèi)和抽樣點(diǎn)數(shù)不足，另有其他區(qū)縣未涉及。因此，本項(xiàng)目未涉及的區(qū)縣也無法排除陽性場點(diǎn)的存在。因此，本次初步調(diào)查無空間分布證據(jù)。

圖6 陽性場群的空間分布

被調(diào)查的四個(gè)規(guī)?；B(yǎng)殖場，經(jīng)檢測全部為隱孢子蟲陽性場。其中，A 場的陽性率最高，D 場的陽性率最低。

4.4 群間分布檢測結(jié)果可見，哺乳犢牛的陽性率為22.33%，陽性率最高。其次為泌乳牛9.66%，斷奶犢牛4.63%，青年牛和干奶牛的檢測陽性率為0 。

圖7 不同階段牛陽性率

表6 不同牛群樣品檢測隱孢子蟲陽性率和真實(shí)流行率

5 分析與討論

本次規(guī)?；膛鲭[孢子蟲病初步調(diào)查，采取分層隨機(jī)抽樣的方法，抽取四個(gè)區(qū)的4 個(gè)規(guī)?；膛?，共采集、處理、檢測樣品1000 份。被檢測場均有奶牛隱孢子蟲陽性樣本?？梢酝茰y隱孢子蟲在我市規(guī)?；膛鲋幸呀?jīng)具有一定的污染面。推測牛群隱孢子蟲感染比較普遍，場群流行率比較高。

根據(jù)個(gè)體表觀流行率12.3%，診斷實(shí)驗(yàn)的敏感性(Se=95%)和特異性(Sp=96%)，規(guī)?；膛龅碾[孢子蟲的陽性率為9.1%(CL95%,7.3%～10.9%)。其中，哺乳犢牛的檢測陽性率最高22.33%，真實(shí)流行率為20.1%(CL95%,16.3%～23.9%)。

根據(jù)初步調(diào)查結(jié)果可見，隱孢子蟲在規(guī)?；龅母腥颈容^普遍，調(diào)查品種均為荷斯坦牛，各年齡段均可發(fā)病，其中以犢牛感染率相對較高，其次為斷乳牛。

結(jié)果提示A 場的哺乳犢牛陽性率遠(yuǎn)高于其他三個(gè)規(guī)模場。根據(jù)問卷調(diào)查結(jié)果，發(fā)現(xiàn)A 場于采樣前2 個(gè)月引進(jìn)一批待產(chǎn)奶牛，來源復(fù)雜。生產(chǎn)犢牛造成隱孢子蟲陽性率顯著高于其他規(guī)模場哺乳犢牛群體。因此，盲目引種混群是A 場犢牛腹瀉嚴(yán)重，且隱孢子蟲感染率高的主要原因。