藥品水分測定方法的選擇及策略

周 浩，王慧潔，趙媛媛，王 歡，張士博

（正大天晴藥業(yè)集團股份有限公司，南京 211100）

藥品中的水分包括結晶水和吸附水，水分含量對藥品的合成、理化性質、制劑工藝、儲藏條件和療效均有影響，控制藥品的水分可預防藥品吸潮、霉變、水解、氧化等［1］334。在化學藥的合成過程中，反應體系的水分控制對反應結果和產品質量的影響至關重要［2］。由于化學結構和晶型的特殊性，一些原料藥的穩(wěn)定性受水分影響較大，在生產和制備過程中需控制環(huán)境濕度并盡量避免水分的影響。鮑興嘉等［3］通過引濕性試驗、影響因素試驗和長期/加速穩(wěn)定性試驗研究了濕度對達比加群酯甲磺酸鹽無定形轉晶的影響。很多藥用輔料及原料藥均含有結晶水，結晶水的比例直接影響藥品的理化性質、溶出和藥效等，測定結晶水的含量對化學藥的結構確證和晶型表征有重要作用。水分對青霉素類抗生素的穩(wěn)定性影響也很大，含水量越高，青霉素越易降解，越易失效。國內外藥典對幾種常用青霉素類抗生素含水量均作出規(guī)定：《歐洲藥典》青霉素鈉干燥失重限度為1. 0%、青霉素V鉀及苯氧甲基青霉素水分限度分別為1. 0%、0. 5%［4］1958-3534；《中華人民共和國藥典》青霉素V 鉀水分限度為1. 5%、青霉素鈉及其注射劑干燥失重限度分別為0. 5%、1. 0%［5］730-737。因此，在藥物研發(fā)階段，需開發(fā)可靠的水分測試方法對起始物料、中間體、原料藥和制劑產品進行水分檢查并結合藥品自身特點、生產工藝、包裝形式、儲存和使用方式制訂合理的限度，以保證藥品質量。

由表1 和表2 可知，藥典收載的水分測試方法可以歸納為4類，即費休氏法、重量分析法（包括常壓干燥法、減壓干燥法和熱重分析法）、甲苯法和氣相色譜法，各通則均對方法測試原理、試液、溶劑、方法適用性、供試品含水量和取樣量等進行了詳細闡述。與其他方法相比，費休氏法是唯一基于化學定量反應的水分測試方法，具有專屬性強、重復性好、準確度高和適用范圍廣等優(yōu)點，是國際上通用的水分測試方法。雖然費休氏法水分測試方法有諸多優(yōu)點，但應用此法進行藥品水分測試依舊存在很多問題。這些問題主要包括：（1）反應性問題；（2）溶解度問題；（3）供試品處理問題。針對以上問題，本文重點介紹費休氏法，并結合供試品的理化性質和藥典實例總結藥品水分測試方法的選擇與研究思路。

表1 各國藥典收載的水分測試方法

表2 各種水分測試方法對比[1]334-343

1 費休氏法水分測試方法

費休氏法是Karl Fischer 在1935 年提出的水分測試方法，根據碘的來源，分為容量滴定法和庫侖滴定法，二者均以卡爾費休氏反應為基礎。本法是根據碘和二氧化硫在合適的醇和堿的存在下與水定量反應來測定水分，碘和水的化學計量比為1∶1，反應通式如下［1］334-335：

容量滴定法中，碘是作為滴定劑通過滴定管加入，從消耗碘的量可測定水分含量，計量原理為體積計量。庫侖滴定法中，碘是由含有碘離子的陽極電解液電解產生，根據法拉第定律，產生碘的量與通過的電量成正比，從消耗的總電量可測定水分含量，計量原理為電量計量。

容量滴定法根據滴定方式分為直接滴定法和剩余滴定法（返滴定法）。根據供試品處理方法分為直接投樣法、外部溶解法、外部萃取法和卡式爐水分測定法。有大量文獻報道使用費休氏法進行藥品水分測試并對測試方法進行了優(yōu)化和改進［9-14］。因此，采用費休氏法進行水分測試時，需結合供試品特性、測試環(huán)境及水分含量選擇合理的供試品處理方法，以獲得準確的測試結果。

1. 1 費休氏法-直接投樣法

直接投樣法是最常用的測試方法，常用溶劑為無水甲醇，可添加合適的助溶劑進行增溶，此法適用于溶解性好、無副反應或采取合適的措施可抑制相關副反應發(fā)生的供試品水分測試，各國藥典收錄的大部分品種均采用此法進行水分檢查。

1. 2 費休氏法-外部溶解法

外部溶解法采用無水甲醇或混合溶劑將供試品溶解后進行水分測試，適用于水分含量不均勻、黏度大、稱量困難、水分釋放緩慢和吸水性極強的供試品水分測試。使用本法進行水分測試時，空白溶劑的選擇至關重要，首先空白溶劑不與供試品和費休氏試劑發(fā)生反應，其次空白溶劑的含水量必須遠小于供試品。應用此法需關注環(huán)境溫濕度對測試結果的影響并做空白校正，各國藥典收錄的外部溶解法水分測試大部分采用庫侖滴定法。張才煜等［15］報道葉酸在甲醇中不溶，測定時水分釋放緩慢，測定時間較長，《中華人民共和國藥典》收錄的葉酸水分測試方法為容量法外部溶解法，溶劑為三氯甲烷-無水甲醇（4∶1）的混合溶液［5］232。格列美脲在甲醇中極微溶解，《美國藥典》收錄的格列美脲用二甲基甲酰胺為溶劑，采用庫侖法外部溶解法進行水分測試［16］。

1. 3 費休氏法-外部萃取法

外部萃取法是通過無水甲醇或混合溶劑將供試品中的水分萃取出來，適用于溶解性較差、水分分布不均勻和輔料有干擾的供試品水分測試。本法對空白溶劑及溫濕度的要求同外部溶解法，推薦使用庫侖滴定法測試。富馬酸喹硫平在甲醇中微溶，《日本藥典》收錄其水分測試用甲醇4 mL 溶解供試品約0. 1 g，劇烈振搖1 min，2 000 r/min 離心5 min，精密量取上清液1 mL 用庫侖滴定法測試，同法制備空白溶液并校正［8］1493。固體制劑由于輔料眾多，直接投樣很難保證完全溶解且不發(fā)生副反應，外部萃取法是其最合適的水分測試方法。例如《美國藥典》收錄的奧比沙星片水分測試：取供試品5 片，置50 mL 離心管中，精密加入無水甲醇25 mL 并密封，振搖16 h，離心，取一定體積的上清液（含水量約為1 000 ~ 1 500 μg）用庫侖滴定法測試，并做空白校正［17］。

1. 4 費休氏法-剩余滴定法（返滴定法）

剩余滴定法通過向供試品中加入過量已標定的費休氏滴定液，利用已標定的水-甲醇標準溶液中微量水分對過量部分的費休氏滴定液進行返滴定。剩余滴定法適用于儀器響應精度不佳的情況下測定結晶水釋放緩慢和含水量較低的供試品?！睹绹幍洹肥珍浀钠咸烟撬徭V［18］和《日本藥典》收錄的硫酸小諾霉素［8］1251都因結晶水釋放緩慢，采用剩余滴定法進行水分測試。

1. 5 費休氏法-卡式爐法

卡式爐法是在適宜的溫度下加熱供試品，通過一定流速的氮氣，將蒸發(fā)出來的水分導入滴定杯中進行測試。本法適用于溶解性較差、成分復雜、存在副反應、水分釋放緩慢和吸濕性較強的供試品水分測試。該方法的準確度主要取決于系統(tǒng)排除大氣水分的程度，必須監(jiān)控基線漂移值，并對氣體轉移造成的誤差進行校正。測試參數應慎重選擇，需考察氣體流速、稱樣量、加熱溫度及加熱時間對測試結果的影響，防止供試品水分蒸發(fā)不完全或分解產生水?！稓W洲藥典》收錄的阿托伐醌采用卡式爐法進行水分測試，加熱溫度為160 ℃、加熱時間為3 min、氣體流量為50 mL/min［4］1601。

2 供試品理化性質分析

2. 1 供試品反應性分析

供試品可能會與費休氏試劑及測試過程生成的氫碘酸發(fā)生各種反應，為了獲得準確的測試結果，應避免或盡量減少這些副反應。常見副反應有羥醛縮合反應、酯化反應、氧化還原反應、中和反應和復分解反應等，反應類型、反應方程式及反應方式詳見表3。

表3 費休氏法水分測試過程常見副反應

與甲醇反應：部分醛、酮、強酸、硅醇基團和硼化合物可以與甲醇發(fā)生反應并生成水，生成水的速率取決于所使用的試劑和供試品。此類供試品水分測試可以使用醛酮專用試劑或鹵化醇作為溶劑?！睹绹幍洹肥珍浀鸟R來酸吡格列酮的水分測試中注明馬來酸與甲醇反應產生水，滴定劑和溶劑都必須不含甲醇［19］。

與碘反應：還原劑和氧化劑會直接或間接與費休氏試劑中的碘發(fā)生反應，影響供試品的原始含水量，例如硫醇、苯酚、抗壞血酸、青霉素副產物等。此類供試品水分測試可在測試體系中加入水楊酸抑制碘的氧化或采用快速費休氏試劑減少副反應的發(fā)生［20］。Sherman 等［21］提出在非水介質中使用一種由碘、碘化鉀和醋酸鈉組成的新試劑，可準確測試維生素C片劑的水分。

與滴定反應生成的弱酸反應：含有碳酸鹽、氫氧化物、氧化物、羰基和過氧化物的供試品易與反應生成的氫碘酸和亞硫酸氫鹽反應。此類供試品可通過卡式爐進行水分測試或在溶劑中加入適量的堿（咪唑、吡啶）消除副反應。Cachet等［22］報道采用10% 咪唑無水甲醇溶液可有效抑制紅霉素酸降解生成紅霉素烯醇醚和水的副反應?！吨腥A人民共和國藥典》收錄的紅霉素，采用10% 咪唑無水甲醇溶液溶解供試品后進行水分測試［5］521。

藥品研發(fā)過程中涉及水分測試的樣品眾多，由于結構和成分的復雜性，部分副反應的機制暫未明確。根據理論知識和藥品水分測試經驗，總結出以下副反應判斷依據：（1）測試體系溶液的顏色（供試品溶解后呈無色），正常測試結束時溶液呈淡黃色，若呈深紅棕色或其他顏色，則可能存在副反應；（2）測試體系是否有氣泡、煙霧或沉淀產生；（3）測試過程滴定曲線的變化，正常滴定曲線呈S型；（4）正常滴定時間內是否出現滴定終點（與預期含水量對比），部分副反應消耗碘或產生水使滴定時間延長。

2. 2 供試品的酸堿性

卡爾費休氏反應是pH 依賴的可逆反應，最佳pH 范圍為5. 5 ~ 8. 0。pH 過低，會使反應常數降低，反應速度減緩；pH過高，會加速反應，影響反應的化學計量值。此類供試品水分測試可添加弱堿（咪唑）或弱酸（水楊酸）緩沖系統(tǒng)pH。《中華人民共和國藥典》收錄的紫杉醇注射液水分測試，規(guī)定供試品的pH為5. 4 ~ 7. 4［5］1627。

2. 3 供試品的引濕性

部分供試品含有吸濕官能團，吸濕官能團可能包括氨基、羥基、羧基、鈉鹽、鉀鹽、銨鹽、硅酸鋁、寡糖等20種，藥物吸濕后在低相對濕度環(huán)境中會發(fā)生不放濕、部分放濕、完全放濕等現象［23］。此類供試品測試，需嚴格控制環(huán)境的相對濕度與溫度，避免供試品引濕或放濕。必要時可在手套箱中操作，或采用外部溶解法、外部萃取法、剩余滴定法和卡式爐法。

2. 4 供試品溶解性分析

部分供試品在甲醇中溶解度有限，需要添加合適的助溶劑進行增溶，保證測試結果的準確性。助溶劑的選擇應遵循以下原則：（1）助溶劑不參與卡爾費休氏反應且不影響反應活性；（2）最大程度地增加樣品的溶解性；（3）助溶劑的添加量不能超過儀器公司推薦的限值。應避免使用以下會產生副反應或減緩卡爾費休氏反應的助溶劑，例如DMSO、二元醇和三元醇等。目前存在多種市售的含有助溶劑及緩沖介質的費休氏試劑，常用助溶劑及其比例推薦見表4。

表4 常用助溶劑比例

2. 5 供試品含水量分析

水分測試需要結合供試品的含水量選擇合適的測試方法和取樣量。容量法適用于常量和半微量水分測試（含水量約為0. 1% ~ 100%），對于水分含量低于1% 的供試品，優(yōu)選滴定度小于2. 0 的費休氏試劑。庫侖法（直接投樣法）適用于微量水分測試（含水量約為0. 000 1% ~ 0. 1%），尤其是液體和氣體的水分測定。如表5所示，各國藥典均規(guī)定了最佳供試品稱樣量，《美國藥典》詳細介紹了供試品最少取樣量計算公式。此外，《美國藥典》還對膠囊和片劑的取樣做了如下規(guī)定：（1）如果供試品是膠囊，取至少4 顆內容物的混合物進行檢測；（2）如果供試品為片劑，則在已知不會影響結果的溫度和相對濕度的條件下，取不少于4 片研磨后測試［7］。

表5 各國藥典水分測試供試品稱樣量要求

3 水分測試方法的選擇

每種水分測試方法均有優(yōu)缺點和適用性，充分了解供試品的理化性質是合理選擇水分測試方法及獲得準確測試結果的必要前提?；趯Ψ椒ㄌ禺愋浴⑺Y合類型、樣品性質和測試效率的綜合考慮，直接加樣法和卡式爐水分測定法的對比分析是測定化學性質和熱穩(wěn)定性不明供試品水分含量的最佳方法，外部溶解法和外部萃取法是測定難溶性、吸濕性較強、稱量困難、水分分布不均及釋放緩慢等供試品水分的首選方法?；趯嶋H研發(fā)經驗，本文將藥品研發(fā)過程中的水分測試總結為4類，即黏性固體、多組分固體、粉末狀固體和液體水分測試，根據供試品的性狀可參考圖1 ~ 圖4流程進行水分測試方法的選擇。方法開發(fā)過程可參考《歐洲藥典》通則“2. 5. 12 半微量水分測試”適用性驗證和“2. 5. 32 微量水分測試”準確度驗證進行方法確認。

圖1 黏性固體水分測試方法選擇流程圖

圖2 多組分固體水分測試方法選擇流程圖

圖3 粉末狀固體水分測試方法選擇流程圖

圖4 液體水分測試方法選擇流程圖

4 結 論

水分含量不僅是藥物研發(fā)階段的重要研究內容，也是與仿制藥一致性評價緊密相關的關鍵質量屬性，必須建立合理準確的水分測定標準保證藥品的穩(wěn)定性。水分質量標準的制訂需以各國藥典為基礎，并結合供試品特性合理評估方法的適用性，選擇專屬性強、重現性佳、準確度高的水分測試方法。本文重點介紹了費休氏法水分測試方法和供試品的理化性質分析，并在此基礎上提供了水分測試方法選擇的新思路。建議研究人員根據供試品特性和水分含量控制要求，逐步完善水分測試方法和限度標準，合理細化水分測試標準操作規(guī)程，更好地保證測試結果的準確性。