月季三倍體育種方法概述

丁艷麗 李珍 付涌玉

摘要：為了培育不結(jié)果或少結(jié)果的藤本月季新品種，降低植株營養(yǎng)消耗，節(jié)約管理成本，促進月季開花，提高其觀賞性，選定適合的月季品種作為父母本，進行雜交試驗。首先對父本花粉生活力和發(fā)芽率的測定和母本開花生物學(xué)特性的觀測，接著開展了有性雜交和播種育苗，最后從形態(tài)和DNA方面對雜種進行鑒定。

關(guān)鍵詞：三倍體;雜交

現(xiàn)代月季通常指薔薇科、薔薇屬中一類四季開花的雜種品種群，主要包括四大類：雜種香水月季、豐花月季、微型月季和藤本月季?，F(xiàn)代月季經(jīng)過200多年的發(fā)展，已逐漸形成了龐大的類群，特別是歐美及日本等月季發(fā)達國家的新品種更是層出不窮，令人矚目?，F(xiàn)代月季的品種群（2n=2x、3x、4x、x、5x、6x、8x），種類繁多，來源廣泛。

國內(nèi)月季育種現(xiàn)狀：月季的育種最早始于中國，其最早記錄是公元960 年把Rosa chinensis 用于月季雜交。北宋時代，我國月季品種廣栽于洛陽、山東、兩淮、蘇州、揚州等地，當時已經(jīng)開展播種天然授粉種子并由實生苗中選育新品種的活動。到宋代，僅洛陽就有41個月季品種，達到了世界水平。但是從明代開始我們落伍了，野生資源、古老品種遭到嚴重破壞和流失，直到不久前我國的月季育種還基本處于停滯或緩慢發(fā)展狀態(tài)。我國月季育種工作開始于新中國成立以后，20世紀50～70年代，我國自育品種‘黑旋風’、‘上海之春’、‘浦江朝霞’相繼問世，上海、北京、杭州等地新品種選育工作開始發(fā)展。1986年中國月季協(xié)會成立后，大力倡導(dǎo)新品種的培育工作，全國許多城市相繼成立了月季協(xié)會，高校、科研機構(gòu)以及月季愛好者開始重視月季的育種工作，我國月季育種和發(fā)展進入了新時代。1957～2016年的60年間，我國自育新品種共計455個。

植物的多倍體情況在植物界里隨處可見，如馬鈴薯、小麥、棉花、無籽西瓜、香蕉、番茄、巨峰葡萄等等。多倍體育種是指通過人工的方法將植物染色體組進行加倍，或是直接從自然界中選育染色體組加倍的突變體，從而獲得新品種的方法。多倍體的特點有巨大性、品質(zhì)與產(chǎn)量提高、生理特性改變、遺傳變異性、不孕性與可孕性等特點。由于多倍體的諸多特點，多倍體育種在植物育種學(xué)和分子生物學(xué)方面早已成為研究熱門。多倍體植物品種的育種方法主要有兩大類，一類是植物在自然界中自然加倍，人們根據(jù)自己的需求，到自然界中去發(fā)現(xiàn)自然加倍的物種，將其直接引種過來;另一類就是通過人工誘導(dǎo)的方法產(chǎn)生。人工誘導(dǎo)多倍體的方法比較多，如使用溫度刺激、機械創(chuàng)傷、嫁接、電離輻射、射線等方法誘使植物加倍的物理方法;如使用秋水仙素等化學(xué)誘變劑誘導(dǎo)植物加倍;如仿效自然加倍的途徑，使用傳統(tǒng)雜交技術(shù)、組織培養(yǎng)技術(shù)、細胞融合技術(shù)進行多倍體育種。

目前國內(nèi)的月季育種目標主要集中在花色育種、花香育種、抗性育種，育種方法主要是雜交育種、誘變育種、分子育種。在國內(nèi)，月季的倍性育種少有報道。北京聯(lián)合大學(xué)特殊教育學(xué)院鮑平秋團隊采用四倍體藤本月季‘多特蒙德’作為母 本 ，二倍體‘北京俏’‘北京紅’作為父本，進行雜交育種，培育出了三倍體雜交新種‘特嬌’、‘特俏’、‘多嬌’、‘多俏’。三倍體月季，一方面可以使結(jié)實率降低;另一方面，可以獲得更好的觀賞效果，同時降低水肥消耗、節(jié)約養(yǎng)護管理成本，提高經(jīng)濟效益。南京農(nóng)業(yè)大學(xué)王康的專業(yè)碩士論文是對古老月季‘月月粉’的四倍體誘導(dǎo)、鑒定和特性研究。

1 確定三倍體育種目標

三倍體月季，一方面可以使結(jié)實率降低;另一方面，可以獲得更好的觀賞效果，同時降低水肥消耗、節(jié)約養(yǎng)護管理成本，提高經(jīng)濟效益。培育三倍體月季，要按照園林植物育種目標多樣性、高效性、季節(jié)性、兼用性等特點，遵循育種目標的預(yù)見性、可操作性、可檢驗性等特點，來選擇適合的父母本，已達到預(yù)訂的育種目標。

2 根據(jù)育種目標，確定父本與母本

2.1 母本的選擇

選擇母本需要考慮到它的開花生物學(xué)特性，包括天然授粉結(jié)實率、自花授粉結(jié)實率、孤雌生殖結(jié)實率、天然授粉果實平均結(jié)子率及種子萌發(fā)率，選擇結(jié)實率高，種子萌發(fā)率高，優(yōu)點突出的二倍體或四倍體月季品種作為母本。

2.2 父本的選擇

在選擇父本時，除要求花粉量大、花粉萌發(fā)率高外，還要兼顧性狀遺傳規(guī)律。根據(jù)育種目標和現(xiàn)有材料，我們選擇適合的二倍體或者四倍體月季品種作為父本。

2.2.1 父本花粉生活力測定

花粉采集：摘取選定的父本植株上含苞待放、花瓣抱合的花蕾，在陰涼干燥的室內(nèi)，用鑷子分別取出的花蕾中的花藥，將花藥放置在硫酸紙上，自然干燥，待花藥開裂散粉后收集花粉，進行花粉生活力的測定。

用解剖針在載玻片上撒少量花粉，滴1滴I-IK溶液，蓋上蓋玻片，用吸水紙將多余藥液吸干，將載波片放在顯微鏡下觀察花粉染色情況。每種花粉觀察3個視野，分別統(tǒng)計花粉染色情況，從而得出各種花粉生活力狀況。

2.2.2 父本花粉發(fā)芽率測定

（1）父本花粉發(fā)芽率測定方法：在500ml容量的燒杯中倒入100ml蒸餾水，放在微波爐中加熱煮開，加入0.4g瓊脂和10mg蔗糖，攪拌均勻后，繼續(xù)加熱煮開，加入0.01g硼酸，用玻璃棒攪拌均勻。

（2）制片：用玻璃棒蘸少許培養(yǎng)基，趁熱滴入凹形載玻片的凹槽內(nèi)，等培養(yǎng)基冷卻后，用解剖針均勻撒上少量花粉粒。

（3）培養(yǎng)：在培養(yǎng)皿下面墊一層濾紙，向濾紙上滴水直至濾紙吸足水，以保持濕度，將制好的載玻片放入培養(yǎng)皿內(nèi)，蓋好培養(yǎng)皿，放在25℃的恒溫箱內(nèi)進行培養(yǎng)。

（4）鏡檢：花粉培養(yǎng)一段時間后，取出載玻片，放在顯微鏡下觀察花粉萌發(fā)情況。每種花粉觀察4個視野，以花粉管長度等于或大于花粉直徑長度為準，分別記錄每個視野花粉的萌發(fā)數(shù)，計算花粉的發(fā)芽率。

3 月季三倍體雜交育種的技術(shù)

3.1 雜交親本選擇

親本應(yīng)具有我們所需要的優(yōu)良性狀和特性，優(yōu)點多缺點少，而且親本的優(yōu)缺點要能互相彌補。親本來源在地理上應(yīng)較遠，生態(tài)類型不同，這樣可以豐富雜種遺傳性，增強雜種優(yōu)勢。

3.2 母株和花朵的選擇

根據(jù)育種目標的要求，選擇生長健壯、發(fā)育良好的作為母株。去雄的花朵以選擇植株中上部和向陽的花為好。每枝保留的花朵數(shù)一般以3～5朵為宜，多余的去掉，以保證雜種種子的營養(yǎng)。

3.3 去雄

去雄時間都應(yīng)在雌雄蕊未成熟時，可先用手輕輕剝開花蕾，用鑷子剔去花中的雄蕊，仔細檢查每片花瓣的基部，以免留有零星散生的雄蕊。小心操作，千萬不要損傷雌蕊。

3.4 套袋

為避免計劃外植物花粉干擾，去雄后立即套上袋子。袋子兩端開口，頂端向下卷折，用回形針夾住，下端應(yīng)縛在老枝上，因為當年生枝脆易斷。套袋后掛上紙牌，用鉛筆寫明去雄日期。

3.5 授粉

待柱頭分泌黏液發(fā)亮?xí)r即可授粉。為確保授粉成功，最好連續(xù)授粉2～3次。授粉工具一般用毛筆、棉花球;特別少的花粉，用圓錐形橡皮頭授粉。授粉后應(yīng)立即封好套袋，并在紙牌上注明雜交組合、雜交日期、授粉數(shù)等。

3.6 雜交后的管理

雜交后，要細心管理，創(chuàng)造良好的、有利于雜交種子發(fā)育的條件，并注意觀察記載，及時防治病蟲害，防止人為的破壞。

4 雜交后代播種、選育

4.1 播種

雜交果實后，逐個剖開，將種子裝入透氣的牛皮紙袋中。再將牛皮紙袋沙藏在用滅菌靈藥液浸泡消毒過的泥瓦盆中沙藏，沙藏用的沙子是新的細河沙。裝好盆后，將瓦盆放在建筑物的北墻根，用草袋覆蓋，經(jīng)常檢查，保證沙子的濕度在60%左右。在第二年春季，將種子取出，進行盆播。

4.2 選育

因為雜交幼苗比較弱，一定要倍加呵護，做好水肥管理，以保證雜交后代的成活率。由于月季是異花授粉，F(xiàn)1就出現(xiàn)了分離，所以選擇在F1進行。雜種植物至少要經(jīng)過3～5年的形狀觀察、比較、分析，最終做出性狀鑒定。

5 雜交后代倍性鑒定

5.1 形態(tài)鑒定

對雜種苗主要從株形、株高、小葉數(shù)、葉色、花期、花色、花瓣數(shù)、花徑、花型、天然授粉結(jié)實率方面進行觀察。將雜種苗與父母本比較它們之間的關(guān)系。

5.2 氣孔觀察

分別取父母本與雜種苗的葉片，用解剖針、眼科鑷在葉背面剝下一層表皮，將撕下的表皮放在載玻片上，滴一滴清水，蓋上蓋玻片，放在顯微鏡下觀察氣孔情況。觀察氣孔大小，氣孔分布密度，并進行比較。

5.3 流式細胞分析儀測定方法

組培苗的獲得：

從父母本和雜交種苗上選取直徑0.5～0.8cm的新生枝條，用洗衣粉溶液輕輕洗滌，再用自來水沖洗干凈，然后放在濾紙上吸干枝條上的自來水。在超凈工作臺上將枝條剪成約2cm左右的帶芽的莖段，每個莖段要帶一個節(jié)。用70%的酒精消毒1min，用消毒過的蒸餾水振蕩沖洗3遍，再用0.1%的升汞溶液消毒2min，然后用消毒過的蒸餾水沖洗3次，再用70%的酒精消毒1min，用消毒過的蒸餾水振蕩沖洗3遍，再用0.1%的升汞溶液消毒2min，然后用消毒過的蒸餾水沖洗5次。消毒后，將莖段放在無菌濾紙上，接種在初代培養(yǎng)基上，3周后等芽長到1cm左右時，將芽切下接種到繼代增殖培養(yǎng)基上進行增殖。增殖30～45d后即可以將無根苗切離接種到生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)。

稱取100mg試管苗嫩莖及幼葉，在滴有2ml提取緩沖液的培養(yǎng)皿中研碎，260目尼龍網(wǎng)過濾，離心（1000r/min）漂洗3次，獲得細胞核懸液。將細胞核懸液離心處理后，去掉上層清液，加入染色緩沖液，暗處常溫下染色30min。500目尼龍網(wǎng)過濾，濾液用標準試管收集，染色緩沖液為提取緩沖液內(nèi)加入3000ml/L的RNA酶A和10ml/L EB（溴化乙錠），通過流式細胞分析儀的激發(fā)光源照射可激發(fā)經(jīng)熒光染色的DNA分子促發(fā)熒光，測定裝置測定熒光強度，與測定裝置相連的計算機分析軟件即可對熒光強度進行分析，觀察細胞核DNA含量明顯增加的情況。隨著植物倍性水平的增高，細胞核DNA含量明顯增加。

5.4 根尖染色體測定

針對三倍體月季的倍性測定，還可以通過根尖染色體制片來進行染色體數(shù)量測定，以確定雜交種倍性。

5.4.1 測定材料選取

選擇雜交種植株的莖段，利用組織培養(yǎng)技術(shù)進行接種培養(yǎng)，直至生根。上午8～9點時，截取生長狀態(tài)良好的組培苗的根尖，長約2cm。

5.4.2 預(yù)處理

將切下的根尖清洗后放入0.002mol/L、8-羥基喹啉溶液中，在室溫下浸泡45min，抑制紡錘絲的形成。

5.4.3 固定

將根尖取出后，用蒸餾水清洗三遍，投入到卡諾固定液中，放置到4℃冰箱中固定1h，迅速殺死細胞。

5.4.4 解離

將固定之后的根尖清洗3次，投放到5mol/L HCL中，在室溫下浸泡10min，使細胞壁軟化，易于壓片。

5.4.5 染色

將根尖取出，蒸餾水清洗3次，投入到卡寶品紅溶液中2～3h，進行染色。

5.4.6 壓片

使用雙面刀片切去根尖部分，長度約1mm，放置在載玻片上，滴加清水，將蓋玻片一側(cè)接觸水滴，輕輕蓋上蓋玻片，用濾紙吸去多余水分。在載玻片下墊上濾紙，使用鑷子輕微敲擊蓋玻片，使根尖細胞分散開。

5.4.7 鏡檢

將根尖壓片制好后，放在顯微鏡下觀察染色體數(shù)，以確定被測雜交種的倍性。

6 結(jié)語

月季的育種方法很多，隨著時間發(fā)展，技術(shù)進步，我國自育的月季新品種越來越多，培育新品種月季的方法也越來越多，而通過常規(guī)雜交育種，培育三倍體月季的研究不多，但是已經(jīng)有培育成功的報道，這足以證明這種月季三倍體育種方法可行，而且這種培育三倍體月季的方法也是月季育種中不可或缺的。

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