響應(yīng)面法優(yōu)化桑寄生總黃酮提取工藝及其抗氧化活性研究

何春玫 李綠霞 覃曉

（廣西農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)大學(xué)，廣西 南寧 530007）

在廣東、廣西地區(qū)，人們有將采摘的寄生枝?；蜓咳~煮成涼茶飲用的習(xí)慣，其中有廣西梧州的桑寄生茶曾于1992年被列為中華傳統(tǒng)食品保健茶類。［1］桑寄生的主要有效成分是黃酮類化合物，具有較強的抗氧化活性，具有補肝腎、強筋骨、祛風(fēng)濕、安胎元等功效，被廣泛用于中醫(yī)各類處方。［2，3］桑寄生主要分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)，朱開昕等［4］在開展廣西桑寄生的分布及其寄主的調(diào)查時發(fā)現(xiàn)，廣西桑寄生在桂南、桂東、桂中等區(qū)域分布普遍，且廣西桑寄生具有廣寄性，寄主植物有36個科150多種，桑寄生寄主植物和采摘部位不同，其黃酮的含量也不相同，藥用功能存在差異。［5，6］

本研究以廣西農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)大學(xué)內(nèi)桂花樹寄主的桑寄生為原材料，采用超聲波輔助乙醇提取桑寄生黃酮，為廣西桑寄生的開發(fā)利用和文化傳承提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與儀器

1.1 材料和試劑

桑寄生茶葉：采摘于廣西農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)大學(xué)，寄主為桂花樹，陰干。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%，生產(chǎn)批號LC220726，CAS#153-18-4，合肥博美生物科技有限責(zé)任公司）；無水乙醇、氯化鋁、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、抗壞血酸（Vc）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）等，均為國產(chǎn)分析純；純化水（自制）。

1.2 儀器設(shè)備

JP-1000 B型高速多功能粉碎機(jī)（永康市久品工貿(mào)有限公司），KQ-300 DB型數(shù)控親水性超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），EL204型電子天平［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］，V-1800型分光光度計［翱藝儀器（上海）有限公司］，UPT-II-20 T型優(yōu)普系列超純水機(jī)（四川優(yōu)普超純科技有限公司）。

2 試驗方法

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

儲備液配制：精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0．02 g于小燒杯中，加60%乙醇20～30 mL，水浴加熱使其完全溶解，冷卻至室溫后，完全轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，以60%乙醇定容，搖勻，該儲備液蘆丁含量為0．2 mg/mL。

標(biāo)準(zhǔn)工作液配制：精密移取上述儲備液0 mL、1．0 mL、2．0 mL、3．0 mL、4．0 mL、5．0 mL、6．0 mL分別置于25 mL比色管中，各加水至6 mL，各加5%NaNO2溶液1 mL，搖勻，靜置反應(yīng)6 min。各加10%AlCl3溶液1 mL，搖勻，靜置反應(yīng)6 min。各加4%NaOH溶液10 mL，定容至刻度線，搖勻，靜置反應(yīng)15 min。以蘆丁空白液為參比液，在510 nm下測定各溶液的吸光度值A(chǔ)。以吸光度A510為縱坐標(biāo)（y）、測定液蘆丁的質(zhì)量（x）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并擬合得到回歸方程（1）。

式中，y為溶液的吸光度A510，x為溶液中總黃酮質(zhì)量（mg）。

2.2 桑寄生黃酮的提取工藝和提取量的計算

2.2.1 提取工藝

將陰干的桑寄生茶葉去梗除雜質(zhì)后粉碎，過60目篩，混勻后密封避光保存，備用。

精密稱取一定質(zhì)量桑寄生茶葉細(xì)粉于小錐形瓶中，加入一定量的一定濃度乙醇，搖勻。塞上膠塞，設(shè)置一定的時間和溫度進(jìn)行超聲提取，過濾，取適當(dāng)濾液按2．1進(jìn)行顯色，在510 nm下測定吸光度A510。根據(jù)回歸方程（1）和公式（2）計算總黃酮質(zhì)量C和總黃酮提取量。

式中，C為測定液中總黃酮質(zhì)量（g），V為提取液體積（mL），n為稀釋倍數(shù)，m為桑寄生茶葉細(xì)粉質(zhì)量（g）。

2.2.2 穩(wěn)定性實驗

按2．2．1，隨機(jī)選取進(jìn)行三份不同提取參數(shù)的桑寄生黃酮提取液，顯色后，在510 nm波長下測定60 min內(nèi)的吸光度值。每隔5分鐘測量一次，結(jié)果如圖1所示。結(jié)果表明，在60 min內(nèi)，吸光度值呈緩慢下降趨勢，20 min內(nèi)三個濃度溶液的吸光度均為最大值的99%以上，60 min時的吸光度占最大值的97%左右，為減少顯色時間引起的誤差，后續(xù)實驗均在顯色后20 min內(nèi)完成吸光度的測定。

圖1 不同工藝條件顯色液穩(wěn)定試驗結(jié)果

2.3 單因素對桑寄生黃酮提取的影響實驗

根據(jù)參考文獻(xiàn)選擇合適的影響因素進(jìn)行單因素實驗。［7-10］

2.3.1 超聲時間的影響

選擇乙醇濃度50%，液料比50∶1，提取溫度60 ℃，超聲功率150 W為固定參數(shù)，設(shè)置自變量超聲時間為10 min、20 min、30 min、40 min、50 min，按2．2．1測定吸光度A510，計算黃酮提取量。

2.3.2 提取溫度的影響

選擇乙醇濃度50%，液料比50∶1，超聲功率150 W，超聲時間30 min為固定參數(shù)，設(shè)置自變量

提取溫度為20℃、30℃、40℃、50℃、60℃，按2．2．1測定吸光度A510，計算黃酮提取量。

2.3.3 超聲功率的影響

選擇乙醇濃度50%，液料比50∶1，提取溫度60 ℃，超聲時間30 min 為固定參數(shù)，設(shè)置自變量超聲功率為120 W、150 W、180 W、210 W、240 W，按2．2．1測定吸光度A510，計算黃酮提取量。

2.3.4 乙醇濃度的影響

選擇超聲功率150 W，液料比50∶1，提取溫度60 ℃，超聲時間30 min為固定參數(shù)，設(shè)置自變量乙醇濃度為30%、40%、50%、60%、70%，按2．2．1測定吸光度A510，計算黃酮提取量。

2.3.5 液料比的影響

選擇超聲功率150 W，乙醇濃度50%，提取溫度60 ℃，超聲時間30 min為固定參數(shù)，設(shè)置自變量液料比為40∶1、50∶1、60∶1、70∶1、80∶1，按2．2．1測定吸光度A510，計算黃酮提取量。

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化實驗

基于單因素對桑寄生黃酮提取的實驗結(jié)果及分析，選擇超聲功率、超聲時間、乙醇濃度等影響較顯著的3個因素，并以它們?yōu)樽宰兞?，桑寄生黃酮提取量為響應(yīng)值，應(yīng)用Design Expert 10．0．4軟件設(shè)計的Box-Behnken試驗因素及水平表［11-14］見表1。

表1 Box-Behnken試驗因素及水平表［11-14］

2.5 驗證優(yōu)化條件

按響應(yīng)面優(yōu)化試驗方案模型擬合獲得的最佳工藝條件，進(jìn)行3次重復(fù)性實驗，計算黃酮提取量，并將結(jié)果取平均值后，與模型給出的理論最佳數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，驗證該模型的可靠性。

2.6 抗氧化性實驗

以抗壞血酸作為陽性對照，擬采用桑寄生茶葉的乙醇提取物對1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基的清除試驗結(jié)果來評估其體外抗氧化活性。

根據(jù)參考文獻(xiàn)的方法［15-18］進(jìn)行實驗操作，精密稱取0．016 g DPPH，以無水乙醇完全溶解后，于100 mL容量瓶中定容，搖勻。該DPPH溶液濃度為0．4 mmol/L。

按2．4最佳工藝提取桑寄生黃酮，測定提取量。精密移取提取濾液0．1 mL、0．2 mL、0．3 mL、0．4 mL、0．5 mL、0．6 mL、0．7 mL、0．8 mL、0．9 mL、1 mL于比色管中，分別用無水乙醇定容至10 mL，再移取稀釋液2．0 mL 2份，分別加入上述 DPPH溶液2．0 mL和無水乙醇2．0 mL，混合搖勻，室溫下避光反應(yīng)30 min，以無水乙醇為參比液，于510 nm處分別測得吸光度A1和A2。移取 2．0 mL 蒸餾水代替樣品溶液，加入上述 DPPH溶液，室溫下避光反應(yīng)30 min，測得吸光度值A(chǔ)0。根據(jù)公式（3）計算DPPH自由基清除率，并計算IC50。IC50越小，說明該物質(zhì)體外抗氧化性越強。計算物質(zhì)對DPPH清除率公式：

式中，A1為稀釋樣液加DPPH后測得的吸光度，A2為稀釋樣液加無水乙醇后測得的吸光度，A0為蒸餾水加DPPH后測得的吸光度。

對照試驗：精密稱取抗壞血酸 0．0764 g，以無水乙醇完全溶解后，定容于100 mL容量瓶中。其余操作步驟與2．6相同。根據(jù)公式（3）計算DPPH自由基清除率，并利用Excel 2019的FORECAST命令計算IC50。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素實驗結(jié)果與分析

3.1.1 超聲時間對桑寄生黃酮提取量的影響

選擇乙醇濃度50%，液料比50∶1，提取溫度60 ℃，超聲功率150 W，考察超聲時間對桑寄生黃酮提取量的影響，結(jié)果如圖2所示。在超聲時間10～50 min內(nèi)，桑寄生黃酮的提取量為先略有起伏波動，再快速上升，當(dāng)30 min時提取量達(dá)到最大值，之后提取量降低，可能在30 min內(nèi)，隨著超聲時間的延長，桑寄生茶粉細(xì)胞在超聲波的空化作用下破碎并釋放能量，細(xì)胞內(nèi)各種成分溶出較快，但30 min后隨著超聲處理時間的延長，細(xì)胞破碎程度加大，細(xì)胞的各種碎片面積增大，反而對有效成分形成表面吸附而導(dǎo)致檢測量下降。因此設(shè)置超聲時間為30 min，并選擇為響應(yīng)面試驗因素之一。

圖2 超聲時間對桑寄生黃酮提取量的影響

3.1.2 提取溫度對桑寄生黃酮提取量的影響

選擇乙醇濃度50%，液料比50∶1，超聲功率150 W，超聲時間30 min，考察提取溫度對桑寄生黃酮提取量的影響，結(jié)果如圖3所示。溫度越高，黃酮提取量也越高。隨著提取溫度的升高，分子的運動不斷加快，植物細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)滲透到溶劑中的速度也加快，當(dāng)溫度達(dá)到60 ℃時，黃酮提取量達(dá)到峰值，此時提取溶劑乙醇沒有出現(xiàn)沸騰現(xiàn)象，提取完成后溶劑未出現(xiàn)明顯的揮發(fā)減少。但在實驗中發(fā)現(xiàn)，由于高頻超聲波的影響，在開始實驗的10 min內(nèi)溫度會出現(xiàn)±5 ℃波動，且環(huán)境溫度越高波動的時間越長。當(dāng)超聲溫度達(dá)到70 ℃時，導(dǎo)致提取溶劑出現(xiàn)沸騰現(xiàn)象，乙醇揮發(fā)，甚至錐形瓶很容易出現(xiàn)破裂的現(xiàn)象，因此不記錄70 ℃的實驗結(jié)果，后續(xù)實驗設(shè)置提取溫度為60 ℃，且不將提取溫度作為響應(yīng)面試驗因素之一。

圖3 提取溫度對桑寄生黃酮提取量的影響

3.1.3 超聲功率對桑寄生黃酮提取量的影響

選擇乙醇濃度50%，液料比50∶1，提取溫度60 ℃，超聲時間30 min，考察超聲功率對桑寄生黃酮提取量的影響，結(jié)果如圖4所示。超聲功率對桑寄生黃酮提取量有較大的影響，在超聲功率

圖4 超聲功率對桑寄生黃酮提取量的影響

120～240 W范圍內(nèi)，黃酮提取量呈現(xiàn)先升后降的趨勢，在超聲功率為150 W時，黃酮提取量達(dá)到峰值。這是由于超聲波的空化效應(yīng)和攪拌作用，使桑寄生茶粉的細(xì)胞被破壞，加快了桑寄生藥材中的有效成分溶解于提取溶劑中。但隨著超聲功率的逐漸增大，藥材的粉碎程度加大，細(xì)胞內(nèi)的雜質(zhì)也溶解并與黃酮競爭提取溶劑，從而對黃酮的提取產(chǎn)生一定的影響，導(dǎo)致黃酮提取量下降。因此設(shè)置超聲功率為150 W，并選擇為響應(yīng)面試驗因素之一。

3.1.4 乙醇濃度對桑寄生黃酮提取量的影響

選擇超聲功率150 W，液料比50∶1，提取溫度60 ℃，超聲時間30 min，考察乙醇濃度對桑寄生黃酮提取量的影響，結(jié)果如圖5所示。乙醇濃度對桑寄生黃酮提取量的影響呈現(xiàn)先升后降的趨勢。在實驗過程中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)乙醇濃度低于40%時，超聲后過濾非常緩慢，可能是低濃度的乙醇溶液中含水量大，溶出了淀粉、蛋白質(zhì)等水溶性大分子，嚴(yán)重影響過濾速度。50%～70%乙醇提取液的過濾速度較快，當(dāng)乙醇濃度達(dá)50%時，桑寄生黃酮提取量達(dá)最大值，再增加乙醇濃度黃酮提取量反而快速下降，張心壯、胡嘉琳等［19，20］在研究桑葉的黃酮提取時也發(fā)現(xiàn)同樣的趨勢。因此設(shè)置乙醇濃度為50%，并選擇為響應(yīng)面試驗因素之一。

圖5 乙醇濃度對桑寄生黃酮提取量的影響

3.1.5 液料比對桑寄生黃酮提取量的影響

選擇超聲功率150 W，乙醇濃度50%，提取溫度60℃，超聲時間30 min，考察液料比對桑寄生黃酮提取量的影響，結(jié)果如圖6所示。液料比對桑寄生黃酮提取有一定的影響，但影響很不穩(wěn)定，經(jīng)對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，P=0．38＞0．05，說明液料比對黃酮提取影響并不顯著，因此從節(jié)約資源的角度考慮，后續(xù)實驗設(shè)置液料比為50∶1，且不將液料比作為響應(yīng)面試驗因素之一。

圖6 液料比對桑寄生黃酮提取量的影響

3.2 響應(yīng)面實驗結(jié)果與分析

Box-Behnken響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果見表2。根據(jù)單因素實驗結(jié)果，選擇超聲功率（A）、超聲時間（B）以及乙醇濃度（C）為自變量，以桑寄生黃酮提取量（Y）為響應(yīng)值。應(yīng)用Design Expert 10．0．4軟件進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化試驗方案設(shè)計三因素三水平實驗，為減少實驗誤差，設(shè)計了5個中心點由軟件隨機(jī)分布。

表2 Box-Behnken響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果

續(xù)表

經(jīng)軟件對表2進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合，可建立自變量A、B、C對響應(yīng)值桑寄生黃酮提取量（Y）的回歸方程為：

ANOVA方差分析結(jié)果如表3所示。該模型F=15．9974，P＜0．01，可判斷該模型極顯著。模型的失擬項P=0．9342＞0．05，擬合度R2=0．9536，校正擬合度R0dj=0．8940，變異系數(shù)%=0．95＜5，精密度值=11．27＞4，可判斷該模型的擬合程度高，穩(wěn)定性強，可信度較高，模型合理。因此，可應(yīng)用該模型來預(yù)測和分析桑寄生黃酮的提取工藝和結(jié)果。根據(jù)各因素F值可判斷對桑寄生黃酮提取量的影響大小順序為：超聲時間＞超聲功率＞乙醇濃度，其中超聲時間因素的影響為極顯著（P＜0．01），超聲功率因素的影響為顯著（0．01＜P＜0．05）。

表3 ANOVA方差分析結(jié)果

3.3 各因素間交互作用分析

根據(jù)表3方差分析結(jié)果，在實驗設(shè)定的因素水平下，B（超聲時間）-C（乙醇濃度）間有顯著的交互影響（0．01＜P＜0．05），A（超聲功率）-C（乙醇濃度）間有極顯著的交互影響（P＜0．01），A（超聲功率）-B（超聲時間）間的交互作用不顯著。兩兩因素間交互影響的響應(yīng)面圖和等高線圖如圖7所示。各因素間交互影響的響應(yīng)面圖均呈傘形，說明曲面有最大響應(yīng)值，但綜合觀察等高線圖發(fā)現(xiàn)，超聲功率-乙醇濃度、超聲時間-乙醇濃度的等高線圖呈橢圓形，說明它們兩兩因素間存在顯著的交互作用，其中超聲功率與乙醇濃度間形成的橢圓更狹長，說明兩者間交互作用更顯著，與表3方差分析的計算結(jié)果相一致。而且在各等高線圖中，沿超聲時間B方向的曲線更密集，說明超聲時間B對桑寄生黃酮提取的影響較其他因素大。

圖7 兩兩因素間交互影響的響應(yīng)面圖和等高線圖

3.4 最優(yōu)工藝條件驗證

采用Design Expert 10．0．4軟件對表3的數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得出提取桑寄生黃酮的最優(yōu)工藝條件為超聲功率143．71 W，超聲時間31．96 min，乙醇濃度48．05 %，預(yù)測黃酮的提取量為49．1279 mg/g。根據(jù)實驗室實際條件，將最佳工藝條件調(diào)整為超聲功率150 W，超聲時間32 min，乙醇濃度50 %，重復(fù)試驗3次，測得黃酮提取量為49．36 ± 0．39 mg/g，與預(yù)測值相對誤差為0．47%，可見該工藝條件應(yīng)用于桑寄生黃酮提取是合理的。

3.5 抗氧化性實驗結(jié)果與分析

桑寄生乙醇提取液DPPH自由基清除活性的結(jié)果如圖8所示。以抗壞血酸為陽性對照。由圖8可見，對于0．4 mmol/L DPPH溶液，在1．7～25．6 μg/ mL濃度范圍內(nèi)，桑寄生乙醇提取液有非常優(yōu)秀的清除能力，溶液濃度越大，清除DPPH自由基的活性越強，濃度大于25．6 μg/mL后DPPH 清除活性達(dá)到最大值91．60%并基本穩(wěn)定不降。與抗壞血酸對比，桑寄生乙醇提取液的DPPH自由基清除活性強于抗壞血酸，采用Excel 2019進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合，桑寄生乙醇提取液和抗壞血酸 對 DPPH 自由基清除率的回歸方程分別為：y= 0．01x+ 0．7856（R2= 0．9892）、y=0．0081x+ 0．8974 （R2= 0．9992），經(jīng)計算，IC50分別為6．24 μg/ mL和20．02 μg/mL，桑寄生乙醇提取液的活性是抗壞血酸的3．33倍?？梢娚＜纳囊掖继崛∫壕哂辛己玫目寡趸钚?，可作為天然抗氧化劑加以利用。

圖8 DPPH自由基清除活性試驗結(jié)果

4 結(jié)論

本研究采用桂花樹桑寄生茶為研究對象，以超聲波輔助乙醇提取桑寄生黃酮。在單因素實驗基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面法設(shè)計試驗優(yōu)化了提取工藝，并研究了其桑寄生乙醇提取液的體外抗氧化活性。研究結(jié)果表明，各因素對桑寄生黃酮提取量的影響大小順序為：超聲時間＞超聲功率＞乙醇濃度，其中超聲時間的影響極顯著（P＜0．01），超聲功率的影響顯著（0．01＜P＜0．05）。在實驗設(shè)定的因素水平下，B（超聲時間）-C（乙醇濃度）有顯著的交互影響（0．01＜P＜0．05），A（超聲功率）-C（乙醇濃度）有極顯著的交互影響（P＜0．01）。經(jīng)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，桑寄生黃酮提取的最優(yōu)工藝條件為超聲功率143．71 W，超聲時間31．96 min，乙醇濃度48．05 %，預(yù)測黃酮的提取量為49．1279 mg/g。在體外抗氧化活性試驗中，桑寄生乙醇提取液對DPPH自由基有良好的清除能力，其IC50為6．24 μg/ mL，是抗壞血酸活性的3．33倍，可見桑寄生的乙醇提取液具有良好的抗氧化活性，可作為天然抗氧化劑加以利用。