黃顙魚遲緩愛德華氏菌的分離鑒定與藥物敏感實(shí)驗

祝鑌

（廣西岑溪市三堡鎮(zhèn)水產(chǎn)畜牧獸醫(yī)站，廣西 岑溪 543215）

黃顙魚屬于鯰形目鲿科黃顙魚屬，是我國重要的淡水經(jīng)濟(jì)魚類，為廣溫性魚，廣泛分布于我國除西部高原外的國內(nèi)各水域，因其皮光無鱗、肉質(zhì)細(xì)嫩、鮮美回甘、肌間刺少、個體小、營養(yǎng)豐富等原因，受到消費(fèi)者的喜愛。［1］黃顙魚富含多種蛋白質(zhì)和氨基酸，有助于人體鋅、硒等微量元素的補(bǔ)充。［1，2］《醫(yī)林集要》中記載，黃顙魚具有益脾健胃、利尿消腫等功效，還具有抗衰老、促進(jìn)兒童生長發(fā)育等作用。消費(fèi)者的高度認(rèn)可推動了黃顙魚的人工養(yǎng)殖，先后涌現(xiàn)“黃優(yōu)1號”［3］、“全雄1號”［4］等國家級新品種，2020年全國黃顙魚養(yǎng)殖總產(chǎn)量達(dá)56.5萬噸，實(shí)現(xiàn)每667 m2產(chǎn)量近5000 kg，在我國特色淡水魚類養(yǎng)殖產(chǎn)量中排名第一，并逐漸成為我國水產(chǎn)養(yǎng)殖的重要組成部分。［5］

然而隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大、養(yǎng)殖密度和集約化程度的提高，病害逐漸凸顯，尤其細(xì)菌性疾病頻繁暴發(fā)，給黃顙魚養(yǎng)殖業(yè)造成較大的經(jīng)濟(jì)損失。先后出現(xiàn)紅頭病、裂頭病、魚體潰瘍病、腹水病、出血性水腫以及多種寄生蟲病。主要病原有遲緩愛德華氏菌（Edwardsiella tarda）、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌（Yersinia enterocolitica）、鮰愛德華氏菌（Edwardsiella ictaluri）、嗜水氣假單胞菌（Aeromonas hydrophila）、溫和氣單胞菌（Aeromonas sobria）［6］以及車輪蟲、指環(huán)蟲等。［7］

遲緩愛德華氏菌又叫遲鈍愛德華氏菌，是腸桿菌科愛德華菌屬的革蘭氏陰性短桿菌，有鞭毛，無莢膜，不形成芽孢，廣泛存在于溪水、湖泊等淡水和海洋等水環(huán)境中，能感染多種動物，包括魚類、兩棲類、爬行類、鳥類以及哺乳動物，該菌是愛德華氏菌屬中唯一能感染人的致病菌，能引起人的腸胃炎、腹瀉等。［8］學(xué)者們先后在斑馬 魚（Danio rerio）［9］、大 菱 鲆（Scophthalmus maximus）［10］、日 本 鰻 鱺（Anguilla janponica）［11］、羅非魚（Oreochromis mossambicus（Peters,1852）［12］、牙 鲆（Paralichthys olivaceus）［13］、鱖 魚（Siniperca chuatsi）［14］、黃鱔（Monopterus albus）［15］等20多種魚類中發(fā)現(xiàn)了該菌感染的病例。

本研究從廣西多個養(yǎng)殖場死亡的黃顙魚中先后分離到3株致病菌，分別命名為GXLJ20-1、GXLJ20-2、GXLJ20-3。通過形態(tài)學(xué)、生理生化特性、16S rDNA鑒定分析等方法，確定分離菌株為遲緩愛德華氏菌，進(jìn)而通過藥物敏感試驗，成功篩選出具有較好療效的藥物，為黃顙魚遲緩愛德華氏菌的預(yù)防控制提供有力的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 發(fā)病情況

2020年6～8 月間，廣西3個大型黃顙魚養(yǎng)殖場先后出現(xiàn)大量黃顙魚死亡的病例，病程持續(xù)9～15 d，共造成3000尾約170 kg黃顙魚死亡，涉及水域29.5 hm2，其中2個養(yǎng)殖場伴隨同池養(yǎng)殖魚類（青魚、鰱魚、鳙魚、斑點(diǎn)叉尾鮰）的零星死亡。

3個養(yǎng)殖場黃顙魚發(fā)病的臨床癥狀稍有不同，分別表現(xiàn)為：1#養(yǎng)殖場病死魚體表黏液多、頭部發(fā)紅、肛門紅腫、體表有少量紅斑；2#養(yǎng)殖場病死魚除未見頭部發(fā)紅外，其他癥狀與1#養(yǎng)殖場相似；3#養(yǎng)殖場病死魚體表多處發(fā)紅，鰭條邊緣潰爛、黏液多。

上述養(yǎng)殖場養(yǎng)殖密度為3000～4500尾/667 m2。發(fā)病時，水質(zhì)較差，水呈黃綠色或藍(lán)綠色，透明度5～10 cm；水溫29～31℃；pH為7.6～8.8，溶解氧為3.5～5 mg/L，氨氮濃度為0.1～0.25 mg/L，亞硝酸鹽濃度為0.1～0.4 mg/L。

1.2 主要試劑

腦心浸液肉湯培養(yǎng)基（BHI）（購自杭州濱和微生物試劑有限公司），營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司），5%山羊血瓊脂培養(yǎng)基（在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加5%山羊血，由作者無菌配制），新型微生物微量生化鑒定管和藥物敏感紙片（購自杭州濱和微生物試劑有限公司），Premix TaqMix（RR003Q）、DL2000〔購自寶生物工程（大連）有限公司〕。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)菌分離及形態(tài)學(xué)觀察

無菌解剖瀕死黃顙魚，分別采集心、肝、腎等臟器病變組織劃線接種于5%山羊血瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)20 h后，挑取形態(tài)特征一致的優(yōu)勢菌落，進(jìn)行細(xì)菌純化、革蘭氏染色，于1000倍光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)；并將純化的菌株，接種于BHI培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)后，采用甘油保存法，分裝樣品，并凍存于-70 ℃冰箱。［16］

1.3.2 生理生化鑒定

按照常規(guī)方法進(jìn)行糖、醇類等生化試驗，即分別選取3株純化培養(yǎng)的細(xì)菌劃線培養(yǎng)，挑取單菌落接種于微量生化反應(yīng)管中，37 ℃培養(yǎng)24 h后，根據(jù)各生化反應(yīng)管的實(shí)驗結(jié)果及《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》［17］對各菌株進(jìn)行鑒定。

1.3.3 細(xì)菌16S rDNA擴(kuò)增及序列分析

分別取上述純培養(yǎng)細(xì)菌接種于BHI培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)20 h后，按參考文獻(xiàn)［18］擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA。PCR反應(yīng)體系為50μL：Premix Taq預(yù)混液為25μL，菌液5μL，上游引物、下游引物各1μL，ddH2O 18μL。引物序列分別為5 ’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和5 ’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。［2］擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸90 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，進(jìn)行膠回收，由生工生物工程（上海）股份有限公司測序，測序結(jié)果在NCBI上分別進(jìn)行BLAST同源性比對，利用MEGA11.0軟件進(jìn)行多重序列比對分析，采用鄰接法（Neighbor-joining Method）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.4 藥物敏感實(shí)驗

根據(jù)Kirby-Bauer瓊脂擴(kuò)散法測定抑菌圈直徑，即分別取100 μL新鮮培養(yǎng)的3種菌液，均勻涂布在5%山羊血平板上，無菌挑取各種藥物敏感紙片，分別貼在5%山羊血平板上，37 ℃倒置培養(yǎng)24 h，觀察并測定各種藥物的抑菌圈直徑，依據(jù)美國臨床實(shí)驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI）判定分離菌株對藥物的敏感性。［8-11］

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察

分離菌形態(tài)特性如圖1所示。本研究從瀕死黃顙魚內(nèi)臟中分離到3株細(xì)菌，分別命名為GXLJ20-1、GXLJ20-2、GXLJ20-3。該菌在血平板上出現(xiàn)明顯的α溶血，菌落呈圓形、灰白色、表面光滑、邊緣整齊、中間略隆起。通過革蘭氏染色及顯微鏡觀察，顯示該菌為革蘭氏陰性短桿菌。

圖1 分離菌形態(tài)特性

2.2 生理生化試驗結(jié)果

菌株GXLJ20-1、GXLJ20-2、GXLJ20-3的生理生化鑒定結(jié)果見表1，麥芽糖、葡萄糖、H2S、鳥氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶、七葉苷、硝酸鹽還原、D-甘露糖和磷脂酶均為陽性，其他各項均為陰性。該結(jié)果與《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》以及文獻(xiàn)中關(guān)于遲緩愛德華氏菌的生理生化試驗結(jié)果完全一致，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果，初步判斷GXLJ20-1、GXLJ20-2、GXLJ20-3疑似遲緩愛德華氏菌。

表1 菌株生理生化鑒定結(jié)果

2.3 細(xì)菌16S rDNA擴(kuò)增及序列分析

PCR擴(kuò)增菌株GXLJ20-1、GXLJ20-2、GXLJ20-3的16S rDNA基因片段，通過PCR產(chǎn)物電泳，獲得大小約1300bp目的片段。測序后與NCBI中收錄的多種細(xì)菌16S rDNA基因片段進(jìn)行序列比對，并繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖2），由此可見，分離菌株GXLJ20-1、GXLJ20-2、GXLJ20-3與遲緩愛德華氏菌KJ725360、HM222643、HQ852209位于同一分支，同源性為100%，3種菌株間同源性也為100%。因此可以判定菌株GXLJ20-1、GXLJ20-2、GXLJ20-3均為遲緩愛德華氏菌，根據(jù)生化實(shí)驗結(jié)果、16S rDNA基因測序結(jié)果，推測3株分離菌相似性較高，選取菌株GXLJ20-1進(jìn)行藥物敏感試驗。

圖2 16S rDNA系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.4 藥物敏感試驗結(jié)果

選取臨床常用的34種藥物，對菌株GXLJ20-1進(jìn)行藥物敏感試驗，結(jié)果見表2，菌株對恩諾沙星、紅霉素、甲砜霉素、四環(huán)素、強(qiáng)力霉素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、氟甲喹、諾氟沙星、氧氟沙星、依諾沙星、氟苯尼考、哌拉西林、頭孢哌酮、卡那霉素、惡喹酸共16種藥物敏感；對9種藥物中度敏感，對9種藥物表現(xiàn)為耐藥。因此，在生產(chǎn)中，可在16種敏感藥物中，根據(jù)生產(chǎn)實(shí)際進(jìn)行選擇，用于該菌的預(yù)防和治療。

表2 藥物敏感試驗結(jié)果

續(xù)表

3 討論

通過細(xì)菌分離鑒定，從廣西大型養(yǎng)殖場大量死亡的黃顙魚體內(nèi)分離到遲緩愛德華氏菌，確定遲緩愛德華氏菌是致黃顙魚及同池養(yǎng)殖的青魚、鰱魚、羅非魚等魚類死亡的病原。為了更好地預(yù)防和治療該病，通過藥物敏感試驗篩選出恩諾沙星等16種敏感藥物，生產(chǎn)過程中可根據(jù)實(shí)際情況選用敏感藥物對遲緩愛德華氏菌進(jìn)行預(yù)防和治療。

美國、韓國以及我國廣東、湖南、江蘇、山東、廣西、湖北、四川、浙江等地先后報道黃顙魚“紅頭病”或“裂頭病”，該病的主要表現(xiàn)為病魚頭頂部充血、出血、發(fā)紅，顱骨頂部皮膚潰爛，甚至露出顱骨，嚴(yán)重時頭頂穿孔，顱骨裂開，甚至露出腦組織；此外鰓蓋、上下頜可見細(xì)小的出血斑，鰭條出血、腹部可見細(xì)小的出血斑，肛門就生殖孔充血、出血、外突；病魚腹部膨大，有大量淡黃色腹水，腸道充血、發(fā)炎，胃內(nèi)充滿氣體和淡黃色水樣液體，肝臟腫大、有出血點(diǎn)或出血斑，顏色灰白，腎臟腫大充血。［19-23］

遲緩愛德華氏菌或鮰愛德華氏菌均屬愛德華氏菌屬，但遲緩愛德華氏菌毒力更強(qiáng)，廣泛感染淡水河海水養(yǎng)殖魚類。鮰愛德華氏菌主要為害斑點(diǎn)叉尾鮰，病程較快，但目前也有鮰愛德華氏菌感染黃顙魚病例的報道，因此進(jìn)行細(xì)菌的分離鑒定及藥物敏感試驗，才能有針對性地做好防治。［16，24，25］此外，遲緩愛德華氏菌是愛德華氏菌屬唯一能夠感染人的病菌，是一種人魚共患病原，能引發(fā)人的胃腸黏膜及其深層組織的出血性或壞死性炎癥、關(guān)節(jié)炎，甚至腦膜炎和敗血癥等疾病，值得引起重視。［17，26］

魚類遲緩愛德華氏菌于1962年在日本首次發(fā)現(xiàn)，每年3～10月是引起黃顙魚發(fā)病的高發(fā)季節(jié)，發(fā)病適宜水溫多為22～28 ℃。目前對該病需堅持“預(yù)防為主、防重于治”的原則，加強(qiáng)日常管理，做好預(yù)防工作。首先，放養(yǎng)魚前做好消毒，改善池塘底質(zhì)環(huán)境，并加強(qiáng)日常水質(zhì)管理，定期調(diào)控水質(zhì)，避免應(yīng)激；其次，加強(qiáng)引種管理，從源頭控制病原，并控制養(yǎng)殖密度，合理追求產(chǎn)量；再次，科學(xué)投喂優(yōu)質(zhì)飼料，定期添加多種維生素、抗菌藥物，并在水溫不穩(wěn)時控制投喂量，提高魚體自身抵抗力；最后，在發(fā)生病害時，使用六亞甲基胍、聚維酮碘或生石灰等消毒劑，殺滅病原體，同時通過藥物敏感試驗篩選有效藥物，進(jìn)行魚體治療。［6，27］