黑蘿卜胞質(zhì)類型的分子鑒定與育種利用

李曉梅 楊峰 雍曉平 冉茂林

摘 ? ?要：蘿卜胞質(zhì)類型鑒定是雜種優(yōu)勢(shì)利用的前提。以NWB/DCGMS CMS及Ogura CMS兩個(gè)蘿卜細(xì)胞質(zhì)雄性不育特異基因設(shè)計(jì)引物，對(duì)3份黑蘿卜材料進(jìn)行胞質(zhì)類型鑒定。結(jié)果表明，3份可育黑蘿卜資源均含有NWB/DCGMS CMS不育主控基因orf463，利用3份黑蘿卜為母本與其他蘿卜構(gòu)建的F2代遺傳群體表現(xiàn)出育性分離現(xiàn)象，根據(jù)育性分離比發(fā)現(xiàn)黑蘿卜R3、R4含2對(duì)恢復(fù)基因，黑蘿卜R5含3對(duì)恢復(fù)基因。同時(shí)，利用黑蘿卜含有NWB/DCGMS CMS線粒體不育主控基因及細(xì)胞核恢復(fù)基因的特性，進(jìn)行了不育系及恢復(fù)系的創(chuàng)制選育，為蘿卜NWB/DCGMS CMS雜交品種的選育利用提供了技術(shù)支撐。

關(guān)鍵詞：黑蘿卜;細(xì)胞質(zhì)雄性不育;育種利用

中圖分類號(hào)：S631.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1673-2871（2022）02-007-05

Molecular identification of cytoplasm types of black radish（Raphanus sativus L. var. niger）and the breeding utilization

LI Xiaomei1，2，3， YANG Feng1，3， YONG Xiaoping1， RAN Maolin1，3

（1. Rice and Sorghum Research Institute， Sichuan Academy of Agricultural Sciences， Deyang 618000， Sichuan， China; 2. College of Horticulture， Sichuan Agricultural University， Chengdu 611130， Sichuan， China; 3. Vegetable Germplasm Innovation and Variety Improvement Key Laboratory of Sichuan， Chengdu 610300， Sichuan ， China）

Abstract：The identification of radish cytoplasm is the prerequisite for the utilization of heterosis. We used NWB/DCGMS and Ogura CMS gene specific primers to identify the cytoplasm types of three black radish lines. The result showed that all three fertile black radishes had NWB/DCGMS CMS major gene orf463. The segregation of F2’s using the three black radishes as female parents and other radish as male parents suggest that black radish R3， R4 carried 2 pairs of restorer genes， and black radish R5 carried 3 pairs of restorer genes. Taking advantage of black radish having both NWB/DCGMS CMS mitochondrial sterility gene and nuclear restorer gene， we carried out the breeding of sterile lines and restorer lines to provide resources for breeding and utilization of NWB/DCGMS CMS hybrids.

Key words： Black radish; Cytoplasmic male sterility; Breeding utilization

黑蘿卜（Raphanus sativus L.var.niger）是蘿卜屬普通種的一個(gè)變種，其根皮黑色，圓形或圓柱形[1-2]。黑蘿卜主要分布在歐洲，不僅是當(dāng)?shù)氐母愂卟?，也是重要的藥用化合物?lái)源，許多研究表明其內(nèi)部主要活性物質(zhì)為硫代葡萄糖苷，可被用于治療肝、尿、膽、胃腸、心血管和癌癥等疾病[3-6]。中國(guó)地區(qū)以消費(fèi)各類大根類型蘿卜（Raphanus sativus L.var. hortensis）為主，至今國(guó)內(nèi)只有一例關(guān)于黑蘿卜品種選育的報(bào)道[7]。

Yamagishi和Terachi[8]在對(duì)已測(cè)序的8個(gè)蘿卜線粒體基因組進(jìn)行比對(duì)研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，黑蘿卜線粒體含有DCGMS CMS不育主控基因orf463。DCGMS CMS是韓國(guó)學(xué)者Lee等[9]從一份引自于烏茲別克斯坦的蘿卜材料中發(fā)現(xiàn)，該胞質(zhì)不育類型花藥上有少量無(wú)功能花粉，敗育發(fā)生在單核小孢子時(shí)期，且在蘿卜品種中存在廣泛的保持源，此特征與Nahm等[10]報(bào)道的NWB CMS相似，但與Ogura CMS差異較大，是一類新的蘿卜胞質(zhì)不育類型。Park等[11]通過(guò)線粒體基因組測(cè)序推測(cè)orf463為DCGMS CMS不育主控基因。隨后，Yamagishi等[12]發(fā)現(xiàn)orf463基因廣泛存在于黑蘿卜中，且同一黑蘿卜線粒體中DCGMS CMS線粒體結(jié)構(gòu)類型與已測(cè)序日本黑蘿卜線粒體結(jié)構(gòu)類型并存，只是不同材料2種類型的亞計(jì)量不同。Wang等[13]通過(guò)對(duì)NWB CMS線粒體基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)，NWB CMS與日本黑蘿卜線粒體基因組序列與結(jié)構(gòu)完全一致，與DCGMS CMS僅存在結(jié)構(gòu)上的差異，是同分異構(gòu)型，以上兩項(xiàng)研究從分子與線粒體基因組水平證實(shí)NWB CMS與DCGMS CMS屬于同一不育胞質(zhì)類型，且廣泛存在于黑蘿卜中。

NWB/DCGMS CMS在蘿卜種質(zhì)資源中具有廣泛的保持源[9-10]，因此極易選育出不育的F1代雜交品種，可很好保護(hù)育種者的知識(shí)產(chǎn)權(quán)，近年來(lái)該類型品種日益增多，如韓國(guó)世農(nóng)種業(yè)的“301”“501”系列等。但與此同時(shí)，恢復(fù)材料的缺乏導(dǎo)致此類品種的優(yōu)良性狀難以利用，長(zhǎng)此以往將導(dǎo)致大量蘿卜種質(zhì)資源的丟失。雖然黑蘿卜不適合國(guó)內(nèi)消費(fèi)習(xí)慣，但其內(nèi)含有NWB/DCGMS CMS不育主控基因與相應(yīng)恢復(fù)基因，因此育種利用價(jià)值較大。四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻高粱研究所蘿卜課題組2016年從國(guó)外引進(jìn)了3份黑蘿卜資源，隨后對(duì)其胞質(zhì)進(jìn)行了鑒定，并以其開展了NWB/DCGMS CMS不育系與恢復(fù)系的選育研究，可為國(guó)內(nèi)研究者對(duì)NWB/DCGMS CMS胞質(zhì)及其恢復(fù)基因的深入研究與育種應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

參試的10份蘿卜材料均為四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻高粱研究所蘿卜課題組選育或引進(jìn)，其中Ogura CMS及NWB CMS不育系各1份（不育胞質(zhì)對(duì)照組）、黑蘿卜3份（圖1）、其他不同類型蘿卜品種（品系）5個(gè)，材料詳情見表1。所有材料于2016年9月至2021年5月種植于四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻高粱研究所德陽(yáng)市大同試驗(yàn)基地，每年秋冬季進(jìn)行根、葉性狀評(píng)價(jià)，春季進(jìn)行育性鑒定與材料創(chuàng)制。

1.2 蘿卜胞質(zhì)類型的鑒定

根據(jù)DCGMS CMS線粒體基因組（Genebank ID：KC193578.1）中orf463序列設(shè)計(jì)特異引物orf463-F/R，同時(shí)以O(shè)gura CMS特異引物[14]對(duì)試驗(yàn)材料胞質(zhì)類型進(jìn)行鑒定，各引物序列見表2。植物DNA提取按照TIANGEN公司通用型植物DNA提取試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明進(jìn)行，PCR反應(yīng)體系為25 μL，含40 ng DNA，2.5 μL 10×Taq Plus Buffer（含Mg2+），2 μL 2.5 mmol·L-1 Super pure dNTPs，0.5 μL 10 μmol·L-1正向引物，0.5 μL 10 μmol·L-1反向引物，0.5 μL 2.5 U·μL-1 Taq Plus，用ddH2O補(bǔ)齊25 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30次循環(huán);最后72 ℃延伸10 min。 PCR產(chǎn)物于1.2%瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)。

1.3 黑蘿卜的育種利用

1.3.1 ? ?NWB CMS不育源的創(chuàng)制與不育系的選育 ? ?以可擴(kuò)增出orf463特異基因的3份黑蘿卜為母本，以試驗(yàn)材料中的R8為父本，構(gòu)建F1、F2群體，并對(duì)遺傳群體進(jìn)行育性分析，然后對(duì)育性調(diào)查結(jié)果進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，分析黑蘿卜內(nèi)恢復(fù)基因?qū)?shù)。同時(shí)以上述不育株為母本，以R6～R10為回交父本，進(jìn)行不育系的選育。

1.3.2 ? ?NWB CMS恢復(fù)系的創(chuàng)制 ? ?以黑蘿卜R4為母本，白長(zhǎng)根蘿卜材料R8為父本，獲得F1代材料，然后以F1為母本，R8為輪回父本，每代選擇可育回交后代為母本，回交3代性狀基本與輪回親本一致后，進(jìn)行自交，選擇自交后代育性不分離的材料，即可獲得含NWB CMS純合恢復(fù)基因的材料。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘿卜胞質(zhì)類型分子標(biāo)記鑒定結(jié)果

利用DCGMS CMS與Ogura CMS特異引物對(duì)試驗(yàn)材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果可知，3份黑蘿卜可擴(kuò)增出orf463特異基因片段（圖2-a），證實(shí)其含有NWB/DCGMS CMS不育主控基因，但所有黑蘿卜材料均可育，說(shuō)明其細(xì)胞核攜帶恢復(fù)基因R8材料可擴(kuò)增出orf138特異片段（圖2-b），其為Ogura CMS的雜交品種。R6、R7、R9、R10未能擴(kuò)增出兩類不育胞質(zhì)特異片段，為普通胞質(zhì)類型。

2.2 不育源的創(chuàng)制與不育系的選育

以3份不同來(lái)源的黑蘿卜為母本，以R8為父本構(gòu)建F1、F2群體，各群體育性情況見表2。由表2可知，F(xiàn)1群體全部可育，F(xiàn)2呈現(xiàn)不同的育性分離比例，說(shuō)明其細(xì)胞核內(nèi)所含恢復(fù)基因?qū)?shù)不同。以黑蘿卜R3、R4構(gòu)建的F2群體可育株與不育株分離比經(jīng)χ2檢驗(yàn)符合2對(duì)完全顯性基因遺傳特性，而以R5構(gòu)建的F2群體育性分離比為65.4∶1，經(jīng)χ2檢驗(yàn)符合3對(duì)完全顯性基因遺傳特性，這與筆者團(tuán)隊(duì)以黑蘿卜為父本的檢驗(yàn)結(jié)果一致[15]。

試驗(yàn)以黑蘿卜創(chuàng)制的不育株為母本，以R6～R10為回交父本，進(jìn)行不育系的選育，現(xiàn)已選育回交BC4代的NWB/DCGMS CMS各類蘿卜不育系5份（圖3）。

2.3 NWB/DCGMS CMS恢復(fù)系的創(chuàng)制與利用

以黑蘿卜R4為母本，R8為回交父本進(jìn)行NWB/DCGMS CMS恢復(fù)系的創(chuàng)制，由圖4-a可知，其F1代黑蘿卜的皮色除根頸部少量黑色，其余根皮均白色，由此說(shuō)明，黑蘿卜的皮色容易改良。后續(xù)每代選擇可育株做母本（說(shuō)明其內(nèi)含恢復(fù)基因），R8為回交父本，回交3代后其基本性狀即與回交父本相似，再進(jìn)行自交，選擇自交育性不分離材料即為含NWB/DCGMS CMS純合恢復(fù)基因的材料（圖4-b）。

3 討論與結(jié)論

蘿卜為典型的異花授粉植物，其雜交優(yōu)勢(shì)明顯，利用細(xì)胞質(zhì)雄性不育系做母本進(jìn)行雜交制種是當(dāng)前蘿卜雜種優(yōu)勢(shì)利用的主要途徑。因此，開展蘿卜雄性不育胞質(zhì)類型分類鑒定是蘿卜雜交品種選育的前提?，F(xiàn)今，已報(bào)道的蘿卜胞質(zhì)類型主要有Ogura CMS及NWB/DCGMS CMS，其線粒體不育主控基因分別為orf138與orf463，根據(jù)不育主控基因設(shè)計(jì)引物即可對(duì)蘿卜胞質(zhì)類型進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。筆者以兩個(gè)胞質(zhì)不育基因設(shè)計(jì)特異引物篩選到3份黑蘿卜資源含有NWB/DCGMS CMS不育基因，這與YAMAGISHI等的研究結(jié)果一致[12]。

前人研究表明，NWB/DCGMS CMS在蘿卜中恢復(fù)材料極少，只有少量歐洲蘿卜材料含有該不育胞質(zhì)恢復(fù)基因[8]。蘿卜以根為收獲器官，在育種過(guò)程中不需要特定恢復(fù)系即可進(jìn)行雜交品種選育。NWB/DCGMS CMS相比Ogura CMS在蘿卜中具有廣泛的保持源，因此極易用該胞質(zhì)配制F1代不育的雜交品種，可很好地保護(hù)育種者知識(shí)產(chǎn)權(quán)[15]。然而，如果缺乏恢復(fù)系的該類胞質(zhì)品種大面積應(yīng)用會(huì)導(dǎo)致育種資源逐漸丟失。本試驗(yàn)鑒定到的3份黑蘿卜資源全部可育，說(shuō)明其含有NWB/DCGMS CMS恢復(fù)基因，后續(xù)利用3份黑蘿卜為母本，以不含恢復(fù)基因的材料為父本，分析F2代育性分離情況，發(fā)現(xiàn)2份黑蘿卜含有2對(duì)恢復(fù)基因，1份黑蘿卜含有3對(duì)恢復(fù)基因，這一結(jié)果與前人研究結(jié)果相似[8，12]。

本課題應(yīng)用黑蘿卜創(chuàng)制的不育源，開展了NWB/DCGMS CMS不育系的選育，轉(zhuǎn)育各種蘿卜類型不育系5份。同時(shí)，利用黑蘿卜材料含有NWB/DCGMS CMS恢復(fù)基因的特性，創(chuàng)制了含純合恢復(fù)基因的白長(zhǎng)根蘿卜1份，該恢復(fù)材料可用于市場(chǎng)上含orf463特異基因的不育雜交品種優(yōu)良性狀的“固定”，可擴(kuò)大育種者資源利用范圍。本課題組正在開展黑蘿卜NWB/DCGMS CMS恢復(fù)基因的定位與克隆研究，相信后續(xù)研究結(jié)果對(duì)揭示NWB/DCGMS CMS不育與恢復(fù)機(jī)制及提高蘿卜育種應(yīng)用效率具有重要的意義。

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