二氧化硫體內(nèi)衍生物通過(guò)ROS/JNK/AP-1通路誘導(dǎo)大鼠切牙成釉器細(xì)胞AE2蛋白表達(dá)上調(diào)

任洪玥，楊進(jìn)，劉霞，姚杰，林昌虎，涂成龍,3,*

1. 貴州醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與健康學(xué)院，貴陽(yáng) 550025 2. 貴州醫(yī)科大學(xué)環(huán)境污染與疾病監(jiān)控教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽(yáng) 550025 3. 貴州醫(yī)科大學(xué)毒性檢測(cè)中心，貴陽(yáng) 550025

干擾上述牙源性細(xì)胞生理功能及成釉過(guò)程的各種因素，都有可能影響牙齒的正常發(fā)育，產(chǎn)生不良后果。目前認(rèn)為，牙胚發(fā)育過(guò)程中持續(xù)過(guò)量地氟攝入是導(dǎo)致釉質(zhì)發(fā)育障礙引起氟斑牙發(fā)生的根本原因，但具體發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚[4]。自由基學(xué)說(shuō)提出，高生物活性的氟化物對(duì)成釉細(xì)胞抗氧化防御系統(tǒng)的破壞是導(dǎo)致“氟斑牙”呈現(xiàn)釉基質(zhì)蛋白滯留與釉質(zhì)礦化不全的關(guān)鍵機(jī)制之一[5-8]。而值得注意的是，在我國(guó)西南部“燃煤型氟斑牙”病區(qū)環(huán)境中常合并高硫煤系分布，敞爐燃煤致居室內(nèi)空氣污染易出現(xiàn)超國(guó)家限量濃度的SO2與含氟煙氣并存的情況。早前有相關(guān)研究就該現(xiàn)象進(jìn)行了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)相較于二者單獨(dú)染毒，同時(shí)接觸大劑量氟化物與SO2煙氣時(shí)大鼠氟斑牙患病程度更嚴(yán)重，提示SO2對(duì)氟致氟斑牙的過(guò)程可能起到加強(qiáng)作用[9]；再有，SO2與氟化物共同暴露時(shí)將對(duì)雄性大鼠腎及睪丸組織產(chǎn)生更嚴(yán)重的損傷[10-11]，更加說(shuō)明SO2的存在將使氟化物產(chǎn)生更復(fù)雜的毒性效應(yīng)。但以上研究均未就SO2在“氟硫聯(lián)合”過(guò)程中發(fā)揮毒作用所涉及的可能機(jī)制進(jìn)行討論。而除了對(duì)呼吸系統(tǒng)造成損害外，SO2還可影響多臟器的生理功能，是一種具有多種毒作用的全身性毒物。SO2經(jīng)呼吸道吸收入血后在血液微堿性的環(huán)境中即轉(zhuǎn)變?yōu)槠溲苌铩獊喠蛩猁}和亞硫酸氫鹽(物質(zhì)的量比約為3∶1)，以其衍生物的形式隨血液循環(huán)至全身，對(duì)體內(nèi)組織細(xì)胞產(chǎn)生毒作用[12]。降低體內(nèi)抗氧化物質(zhì)水平、削弱體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)是SO2發(fā)揮毒作用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[13]。因此，本研究以氧化應(yīng)激為切入點(diǎn)，探討SO2體內(nèi)衍生物對(duì)大鼠切牙組織抗氧化防御系統(tǒng)及成釉器細(xì)胞絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPKs)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路關(guān)鍵蛋白與AE2蛋白表達(dá)的影響，探究其對(duì)牙齒發(fā)育相關(guān)生理過(guò)程的潛在毒性及可能機(jī)制，為后續(xù)深入“氟硫聯(lián)合”過(guò)程中SO2毒作用的毒理學(xué)研究提供實(shí)驗(yàn)資料。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理

本研究采用SPF級(jí)雄性4周齡Wistar大鼠，體質(zhì)量100～120 g，購(gòu)于長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證編號(hào)：SCXK(湘)2019-0013。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后按體質(zhì)量隨機(jī)分5組，即高、中、低二氧化硫衍生物混合液染毒組、生理鹽水對(duì)照組、高劑量二氧化硫衍生物混合液+抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine, NAC)拮抗組，染毒劑量分別為100 mg·kg-1·d-1(1/10LD50)、50 mg·kg-1·d-1(1/20LD50)和25 mg·kg-1·d-1(1/40LD50)，對(duì)照組予0.9%氯化鈉注射液，高劑量+NAC組每次腹腔注射前30 min予200 mg·kg-1NAC水溶液灌胃，后與高劑量染毒組進(jìn)行相同操作，各染毒組均于每日上午9:00行腹腔注射一次，給藥容積為2 mL·kg-1，連續(xù)4周。飼養(yǎng)期間動(dòng)物自由飲水、攝食，環(huán)境溫度為(22±2) ℃，光照明暗各12 h，相對(duì)濕度為(50±10)%。末次給藥后禁食24 h，取相應(yīng)生物樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要試劑

亞硫酸鈉(Na2SO3)、亞硫酸氫鈉(NaHSO3)分析純，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，N-乙酰半胱氨酸購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)、還原型谷胱甘肽(reduced glutathione, GSH)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物有限公司，大鼠活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)Elisa測(cè)定試劑盒購(gòu)自上海江萊生物科技有限公司，AE2兔抗大鼠多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，p38 MAPK兔抗大鼠單克隆抗體、p-p38 MAPK兔抗大鼠單克隆抗體、SAPK/JNK兔抗大鼠多克隆抗體、p-SAPK/JNK兔抗大鼠單克隆抗體、ERK1/2兔抗大鼠多克隆抗體、p-ERK1/2兔抗大鼠多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司，Histone H3兔抗大鼠單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗購(gòu)自北京愛(ài)必信生物技術(shù)有限公司。

二氧化硫體內(nèi)衍生物混合液的制備。取適量亞硫酸鈉與亞硫酸氫鈉，以3∶1的物質(zhì)的量比溶于0.9%生理鹽水，每日新鮮配制。

1.3 大鼠切牙組織氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)測(cè)定

完整分離大鼠雙側(cè)下頜骨及切牙組織，取其中一側(cè)用紗布仔細(xì)去除包繞的肌肉及結(jié)締組織后置液氮中研磨成骨粉，并于組織破碎儀中進(jìn)一步粉碎。取適量骨粉按1∶9的質(zhì)量體積比加入預(yù)冷的0.9%生理鹽水制成10%組織勻漿，蛋白含量的測(cè)定采用BCA法。按不同測(cè)定指標(biāo)的樣品前處理要求離心后取上清液，依試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)切牙組織中MDA、GSH水平及SOD、GSH-Px活性。

1.4 切牙組織ROS水平測(cè)定

骨粉的制備同1.3，取適量骨粉按1∶9的質(zhì)量體積比加入預(yù)冷的PBS(0.01 mol·L-1, pH=7.4)，冰上充分研磨混勻制成切牙組織勻漿液，5 000×g，離心10 min，取上清液按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定切牙組織ROS水平。

1.5 Western blot法測(cè)定大鼠成釉器細(xì)胞MAPKs/AP-1信號(hào)通路相關(guān)蛋白及AE2蛋白表達(dá)水平

取前述待用的另一側(cè)大鼠切牙組織，參考Houari等[14]的處理方法，仔細(xì)撥開(kāi)包繞切牙根部的下頜骨，分離出成釉細(xì)胞組織，用含PMSF的RIPA裂解液4 ℃勻漿，冰上裂解15 min提取總蛋白，用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量，分子量為30～160 kD與12～60 kD的蛋白分別選用8%或12% SDS-PAGE分離膠進(jìn)行電泳分離，轉(zhuǎn)膜后5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，磷酸化蛋白用5% BSA封閉液封閉1 h，分別加入適量AE2抗體(1∶1 000)、p38 MAPK抗體(1∶1 000)、p-p38 MAPK抗體(1∶1 000)、SAPK/JNK抗體(1∶1 000)、p-SAPK/JNK抗體(1∶1 000)、ERK1/2抗體(1∶1 000)、p-ERK1/2抗體(1∶1 000)及β-actin抗體(1∶2 000) 4 ℃搖床孵育過(guò)夜，TBST洗膜10 min共3次，1∶4 000倍稀釋二抗室溫孵育2 h，TBST洗膜10 min共3次，ECL顯色液顯影，凝膠成像系統(tǒng)掃描并檢測(cè)蛋白條帶密度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果(Results)

2.1 二氧化硫體內(nèi)衍生物混合液對(duì)大鼠切牙組織抗氧化防御系統(tǒng)的影響

與對(duì)照組比較，中、高劑量組大鼠切牙組織SOD、GSH-Px活性和GSH水平下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；MDA、ROS水平升高(P<0.05)。與高劑量組比較，高劑量+NAC組SOD和GSH-Px活性升高，GSH水平上升，MDA、ROS含量下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，如表1所示。

表1 二氧化硫體內(nèi)衍生物對(duì)大鼠切牙組織抗氧化防御系統(tǒng)相關(guān)指標(biāo)的影響Table 1 Effects of sulfur dioxide derivatives on indexes of antioxidant defense system of rat incisor tissue n=6)

2.2 二氧化硫體內(nèi)衍生物對(duì)大鼠成釉器細(xì)胞MAPKs/AP-1信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

如圖1所示，低、中、高劑量組及高劑量+NAC組大鼠成釉器細(xì)胞p-p38 MAPK/p38 MAPK及p-ERK/ERK改變較對(duì)照組均無(wú)顯著差異。而低劑量組大鼠成釉器細(xì)胞JNK磷酸化水平改變較對(duì)照組無(wú)顯著差異，中、高劑量組磷酸化JNK/JNK水平較對(duì)照組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且經(jīng)趨勢(shì)性檢驗(yàn)，JNK磷酸化水平升高趨勢(shì)表現(xiàn)出二氧化硫衍生物染毒劑量依賴性(F=158.58，P<0.05)。與高劑量組比較，高劑量+NAC組磷酸化JNK/JNK水平顯著降低(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 二氧化硫體內(nèi)衍生物對(duì)大鼠切牙成釉器細(xì)胞MAPKs信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響注：(a)MAPKs信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白蛋白免疫印跡條帶；(b)成釉器細(xì)胞MAPKs信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白相對(duì)表達(dá)水平；A對(duì)照組，B高劑量組，C中劑量組，D低劑量組，E高劑量+NAC組；與對(duì)照組比較，# P<0.05；與高劑量組比較，*P<0.05；n=3。Fig. 1 Effects of sulfur dioxide derivatives on expression of key proteins in MAPKs signaling pathway of rat incisor enamel organ cellsNote: (a) Immunoblotting bands of key proteins in MAPKs signaling pathway; (b) Relative expression of key proteins in MAPKs signaling pathway; A means control group, B means high-dose group, C means medium-dose group, D means low-dose group, and E means high dose+NAC group; # P<0.05 vs control group; *P<0.05 vs high-dose group; n=3.

如圖2所示，與對(duì)照組比較，中、高劑量組大鼠成釉器細(xì)胞胞漿中c-Fos、c-Jun蛋白水平較對(duì)照組明顯下降(P<0.05)，核內(nèi)c-Fos、c-Jun蛋白水平明顯上升(P<0.05)，提示高劑量組AP-1蛋白發(fā)生核轉(zhuǎn)位。而高劑量+NAC組AP-1蛋白核轉(zhuǎn)位較高劑量組顯著減少(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。低劑量組較對(duì)照組核內(nèi)c-Fos蛋白水平升高，但總體AP-1蛋白核漿分布改變無(wú)明顯差異。

圖2 二氧化硫體內(nèi)衍生物對(duì)大鼠切牙成釉器細(xì)胞胞質(zhì)及胞核中c-Fos與c-Jun蛋白表達(dá)的影響注：(a)胞質(zhì)中c-Fos與c-Jun蛋白相對(duì)表達(dá)水平；(b)胞核中c-Fos與c-Jun蛋白相對(duì)表達(dá)水平；A對(duì)照組，B高劑量組，C中劑量組，D低劑量組，E高劑量+NAC組；與對(duì)照組比較，# P<0.05；與高劑量組比較，*P<0.05；n=3。Fig. 2 Effects of sulfur dioxide derivatives on expression of c-Fos and c-Jun protein in cytoplasm and nucleus of rat incisor enamel organ cellsNote: (a) Relative expression of c-Fos and c-Jun protein in cytoplasm; (b) Relative expression of c-Fos and c-Jun protein in nucleus; A means control group, B means high-dose group, C means medium-dose group, D means low-dose group, and E means high dose+NAC group; # P<0.05 vs control group; *P<0.05 vs high-dose group; n=3.

2.3 二氧化硫體內(nèi)衍生物對(duì)大鼠成釉器細(xì)胞AE2蛋白表達(dá)水平的影響

如圖3所示，中、高劑量組AE2蛋白表達(dá)較對(duì)照組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且經(jīng)趨勢(shì)性檢驗(yàn)，升高趨勢(shì)表現(xiàn)出二氧化硫衍生物染毒劑量依賴性(F=530.167，P<0.05)。與高劑量組比較，高劑量+NAC組AE2蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論(Discussion)

機(jī)體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)主要由抗氧化酶類和抗氧化劑構(gòu)成，它們之間相互協(xié)同、相互代償共同發(fā)揮維持機(jī)體氧化與抗氧化動(dòng)態(tài)平衡的作用。體內(nèi)氧化與抗氧化之間的平衡狀態(tài)被打破可誘導(dǎo)產(chǎn)生各種自由基引起組織氧化損傷，導(dǎo)致細(xì)胞功能異常甚至凋亡，從而對(duì)多種臟器造成損害[15]。已有多項(xiàng)研究表明，二氧化硫及其衍生物可引起大、小鼠腦、肺、心、肝、脾、腎、胃、腸和睪丸等組織抗氧化物質(zhì)含量減少，SOD、GSH-Px和過(guò)氧化氫酶(catalase, CAT)等抗氧化酶活性改變，脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物含量增加[16-19]?？梢?jiàn)，降低體內(nèi)抗氧化物質(zhì)水平、削弱體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)是二氧化硫及其衍生物發(fā)揮毒作用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。基于此，本研究通過(guò)亞急性腹腔注射二氧化硫體內(nèi)衍生物構(gòu)建動(dòng)物染毒模型，觀察二氧化硫衍生物對(duì)大鼠切牙組織抗氧化防御系統(tǒng)的影響。結(jié)果顯示，相較于對(duì)照組，中、高劑量染毒組大鼠切牙組織GSH含量、SOD活性和GSH-Px活性下降，同時(shí)，脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA、ROS水平顯著上升，而預(yù)先給予活性氧抑制劑NAC再予高劑量二氧化硫衍生物時(shí)，大鼠切牙組織抗氧化防御系統(tǒng)各項(xiàng)指標(biāo)均較單獨(dú)施予高劑量二氧化硫衍生物而言有了明顯改善，表明二氧化硫體內(nèi)衍生物可引起切牙組織細(xì)胞抗氧化防御系統(tǒng)紊亂，活性氧自由基蓄積，這與其他學(xué)者在大鼠心、肝、肺和腎等主要臟器組織中觀察到的結(jié)果類似。

圖3 二氧化硫體內(nèi)衍生物對(duì)大鼠切牙成釉器細(xì)胞AE2蛋白表達(dá)的影響注：A對(duì)照組，B高劑量組，C中劑量組，D低劑量組，E高劑量+NAC組；與對(duì)照組比較，# P<0.05；與高劑量組比較，*P<0.05；n=3。Fig. 3 Effect of sulfur dioxide derivatives on the expression of AE2 protein in incisor enamel organ of ratsNote: A means control group, B means high-dose group, C means medium-dose group, D means low-dose group, and E means high dose+NAC group; # P<0.05 vs control group; *P<0.05 vs high-dose group; n=3.

圖4 二氧化硫體內(nèi)衍生物通過(guò)ROS/JNK/AP-1通路誘導(dǎo)成釉細(xì)胞AE2蛋白表達(dá)潛在機(jī)制示意圖注：CA表示碳酸酐酶。Fig. 4 Schematic diagram of the potential mechanism of internal sulfur dioxide derivatives inducing AE2 protein expression in ameloblasts through ROS/JNK/AP-1 pathwayNote: CA stands for carbonic anhydrase.

綜上，二氧化硫衍生物可激活大鼠切牙組織氧化應(yīng)激并主要通過(guò)ROS/JNK/AP-1信號(hào)通路誘導(dǎo)成釉器細(xì)胞AE2蛋白表達(dá)上調(diào)，具有影響切牙細(xì)胞生理功能進(jìn)而干擾牙齒正常形成與發(fā)育的潛能。這提示我們，在氟合并硫高背景地區(qū)“燃煤型氟斑牙”的產(chǎn)生可能具有更復(fù)雜的影響因素，因此，進(jìn)一步深入探討二氧化硫的這一“潛能”在“燃煤型氟斑牙”的形成過(guò)程中所發(fā)揮的作用，氧化應(yīng)激與AE2在其中扮演了何種角色及此過(guò)程涉及的具體機(jī)制等問(wèn)題將有助于從全新角度推進(jìn)“燃煤型氟斑牙”患病機(jī)制的基礎(chǔ)性研究。