雙酚A類似物的生殖毒性及人體生殖健康風險研究進展

魏錦博，何正宇，王昌澤，戶業(yè)麗，汪暢，曹慧明，曹夢西,*，梁勇

1. 武漢工程大學環(huán)境生態(tài)與生物工程學院，武漢 430205 2. 江漢大學環(huán)境與健康學院，武漢 430056 3. 上虞新和成生物化工有限公司，紹興 312300

雙酚A(bisphenol A, BPA)于1891年被首次合成，作為聚碳酸酯和環(huán)氧樹脂等高分子材料的合成原料和顯色劑，在工業(yè)生產(chǎn)中被廣泛使用[1-3]，是全球年均生產(chǎn)量最大的化學原料之一[4]。至2013年，BPA全球年產(chǎn)量已超過580萬t，且仍有增長趨勢[5]。塑料或涂層制品中的BPA在長時間的高溫、酸堿或紫外輻射下，可通過水解或氨解遷移至食物、環(huán)境和皮膚[6-8]，進而被人體接觸并攝入。目前已在多種環(huán)境介質(zhì)、人體介質(zhì)中檢出BPA，包括空氣、室內(nèi)灰塵、地表水、廢水和沉積物等環(huán)境樣品[9-11]以及包括人類在內(nèi)多種動物的血液、尿液、唾液、毛發(fā)、母乳和羊水等生物樣本[12-15]，甚至在母體胎盤、臍帶血和新生兒尿液中也有檢出[7, 16]。進入人體的BPA可與多種受體相互作用，如雌激素受體(ER)、雄激素受體(AR)、雌激素相關(guān)受體γ(ERRγ)、甲狀腺激素受體(TR)和芳香烴受體(AHR)等[17-19]，對人體內(nèi)分泌系統(tǒng)產(chǎn)生干擾，甚至會對后代的生長發(fā)育和生殖功能造成危害[7, 20-23]。流行病學調(diào)查顯示性欲減退、生殖障礙、多囊卵巢綜合征、出生缺陷和包括乳腺癌在內(nèi)的多種癌癥發(fā)生等都與BPA的持續(xù)暴露有關(guān)[5, 8, 20, 24-28]。正因如此，BPA于2008年和2017年先后被美國國家毒理學計劃(National Toxicology Program, NTP)和成員國委員會(Member State Committee, MSC)列為環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(environmental endocrine-disrupting chemical, EDC)[8]。

隨著2008年開始各國陸續(xù)發(fā)布法律條令限制BPA在塑料制品中的使用[1, 12]，BPA替代物的開發(fā)成為工業(yè)生產(chǎn)亟待解決的問題，這直接刺激了與BPA結(jié)構(gòu)類似的其他雙酚類化合物(BPs)，如雙酚S(bisphenol S, BPS)、雙酚F(bisphenol F, BPF)、雙酚AF(bisphenol AF, BPAF)、雙酚B(bisphenol B, BPB)、雙酚E(bisphenol E, BPE)、雙酚C(bisphenol C, BPC)、雙酚Z(bisphenol Z, BPZ)、雙酚FL(bisphenol FL, BPFL)、雙酚AP(bisphenol AP, BPAP)、雙酚BP(bisphenol BP, BPBP)、雙酚M(bisphenol M, BPM)和雙酚P(bisphenol P, BPP)等BPA類似物的開發(fā)、生產(chǎn)和工業(yè)應用。隨著BPA類似物的不斷投產(chǎn)和使用，越來越多BPA類似物在食物、空氣、室內(nèi)灰塵、水體和沉積物等環(huán)境樣本和人體尿液、血清等生物樣本中被檢出，人類尿液排泄數(shù)據(jù)表明世界人類BPs日均攝入量為每人0.06～0.68 μg·d-1，而另一項研究表明人類血清中各BPs中位數(shù)水平為0.07～11.94 ng·mL-1，盡管部分BPs可由人體代謝排出，但BPs對人體的持續(xù)暴露仍然增加了體內(nèi)游離BPs風險[9, 29-35]。且實驗表明多種BPA類似物(如BPB、BPF和BPE等)可通過胎盤轉(zhuǎn)移[36]，提示BPA類似物的生物安全性有待進一步研究。研究表明，BPA類似物與BPA具有相似的生殖內(nèi)分泌干擾效應，且部分類似物所展現(xiàn)的生殖毒性比BPA更強[2, 17, 25, 31, 37-39]。

相較于BPA而言，雙酚類似物的生殖毒性及相關(guān)分子機制的研究較少，這阻礙了對BPA及其類似物于環(huán)境安全和人體健康的綜合評價。本文將綜述近年來國內(nèi)外針對BPA類似物的生殖毒性、致毒分子機制和人體生殖健康風險的研究進展、存在的問題及展望。

1 BPA類似物的生殖毒性效應(Reproductive toxic effects of BPA analogues)

針對BPA類似物生殖毒性的探索主要來源于小鼠、大鼠和斑馬魚等模式動物，下文則是在動物研究的基礎上對BPA類似物對雄性及雌性生殖系統(tǒng)的影響做出的統(tǒng)計。

1.1 BPA類似物對雄性生殖系統(tǒng)的影響

BPA類似物對雄性動物生殖系統(tǒng)的危害主要體現(xiàn)在一些生殖毒性指標的改變，包括雄性的性器官及性附器官質(zhì)量、性器官組織學變化、生殖細胞發(fā)生過程、精子產(chǎn)量及活力、體內(nèi)激素含量、類固醇激素合成相關(guān)基因的表達、卵黃蛋白原表達量(斑馬魚)、氧化應激反應、表觀遺傳變化和后代數(shù)量及健康程度(表1)。值得注意的是環(huán)境濃度、低濃度和較高濃度BPs暴露對精子數(shù)量及質(zhì)量均會產(chǎn)生不良影響，以環(huán)境相關(guān)濃度的BPS(10 ng·kg-1·d-1)[40]暴露小鼠后會破壞睪丸組織結(jié)構(gòu)致使精子數(shù)量顯著下降，經(jīng)BPF(25 μg·L-1)[41]、BPAF(25 mg·kg-1·d-1)[42]、BPB(37.5 mg·kg-1·d-1)[43]和BPE(10 mg·kg-1·d-1)[44]暴露的小鼠中觀察到同樣的現(xiàn)象，其會破壞睪丸及附睪組織，而除了致使精子數(shù)降低，BPs還會顯著降低精子活力，最終造成小鼠生育能力下降，這可能與BPs暴露導致雄性生殖系統(tǒng)氧化應激水平的增加有關(guān)[41-43,45-46](表1)。除BPC和BPFL，不同劑量BPA類似物暴露雄性動物后均會提高體內(nèi)雌二醇(E2)水平，顯示出同BPA相似的類雌激素效應[41,46-49]。BPC(0.5 μmol·L-1)暴露青鳉8 h便可引起體內(nèi)雌激素響應生物標記基因的表達水平顯著升高，引起生殖調(diào)控系統(tǒng)紊亂[50]。與其他BPs有所不同的是，BPS(10 mg·kg-1·d-1)和BPE(0.05 mg·kg-1·d-1)暴露后引起小鼠體內(nèi)睪酮(T)水平升高，這可能與不同暴露方式下的BPs在體內(nèi)不同代謝過程所導致的生物體組織濃度差異有關(guān)[44](表1)。除此之外，BPs暴露甚至會引起多代毒性效應，BPS(50 μg·kg-1·d-1)和BPE(50 μg·kg-1·d-1)暴露孕鼠，會對F3代小鼠的生殖系統(tǒng)產(chǎn)生損害，這可能是雄鼠睪丸的表觀遺傳修飾發(fā)生改變所致[51-52]。

表1 雙酚A(BPA)類似物對雄性動物生殖系統(tǒng)的危害Table 1 The effect of bisphenol A (BPA) analogies on male reproductive systems

1.2 BPA類似物對雌性生殖系統(tǒng)的影響

BPs于雌性生殖健康的研究中，子宮和卵巢質(zhì)量(相對質(zhì)量及絕對質(zhì)量，濕質(zhì)量及干質(zhì)量)、性腺體質(zhì)量比、卵巢中各時期卵泡數(shù)量和結(jié)構(gòu)變化、青春期啟動時間、發(fā)情周期和受精時間、懷孕率、體內(nèi)激素水平、類固醇激素生成酶相關(guān)基因表達、分娩情況及后代存活率、氧化應激水平、表觀遺傳修飾變化以及后代生殖健康等方面是主要靶點。在環(huán)境濃度、低濃度和較高濃度下，不同實驗動物中的研究均表明BPA類似物會對雌性動物的生殖系統(tǒng)造成損害，如表2所示。BPS(10 μg·kg-1·d-1)[53-54]、BPF(50 mg·kg-1·d-1)[54]、BPB(5 mg·kg-1·d-1)[54]、BPC(45 mg·kg-1·d-1)[55]、BPZ(30 mg·kg-1·d-1)[56]、BPAP(80 μg·kg-1·d-1)[57]和BPFL(2 mg·kg-1，每3 d給藥1次)[45]暴露后均會顯著改變實驗對象的子宮或卵巢質(zhì)量，并影響卵巢中各時期卵泡的發(fā)育、數(shù)量以及卵母細胞質(zhì)量，表明雌性動物的生殖系統(tǒng)同樣是BPs的主要作用靶點。上述BPs會顯著影響實驗動物體內(nèi)的E2水平，同時改變睪酮(T)、孕酮(P)、黃體生成素(LH)和促卵泡生成素(FSH)等在雌性動物生殖系統(tǒng)發(fā)育及繁殖中起重要作用的激素水平，擾亂激素平衡，嚴重干擾內(nèi)分泌，從而損害生殖健康(表2)。在去除卵巢的SD大鼠暴露于BPAF(50 mg·kg-1·d-1)或BPC(45 mg·kg-1·d-1)后，其子宮出現(xiàn)雌激素樣變化，表明BPAF和BPC具有強雌激素效應[55]。孕期暴露BPS(50 μg·kg-1·d-1)或BPE(50 μg·kg-1·d-1)致使F3代雌性小鼠出現(xiàn)性早熟、發(fā)情周期紊亂、懷孕率降低和幼鼠存活率降低等問題，產(chǎn)生多代毒性效應[58]。

2 BPA類似物生殖毒性的分子機制(Molecular mechanisms of reproductive toxicity of BPA analogues)

研究者已發(fā)現(xiàn)BPs對生殖系統(tǒng)的多種危害(表1和表2)[40-50,52-56,58-59,60-68]。對BPs生殖毒性分子機制的研究一直持續(xù)探索著。對BPs生殖毒性的分子機制研究最早從BPA開始，其化學結(jié)構(gòu)決定了它與雌激素受體(ER)具有一定的親和性。而隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)BPA除了能與E2競爭性結(jié)合ER外還會對雄激素受體(AR)、雌激素相關(guān)受體γ(ERRγ)、甲狀腺激素受體(TR)和芳香烴受體(AHR)等生物體內(nèi)核受體產(chǎn)生干擾作用。除了核受體，BPA與膜相關(guān)雌激素受體——G蛋白偶聯(lián)受體30(G protein-coupled receptor 30, GPR30)也表現(xiàn)出很強的結(jié)合親和力。BPA通過對以上與生物體生殖相關(guān)受體產(chǎn)生干擾，從而擾亂生物體內(nèi)激素的正常功能并最終對生殖功能造成損害。BPA類似物生殖毒性的分子機制研究大多是基于BPA類似物與BPA結(jié)構(gòu)上的相似性，利用細胞、體外競爭性結(jié)合受體和計算機模擬的方法進行研究和探討。

2.1 雌激素受體途徑

BPA可與E2競爭性結(jié)合ER(包括ERα、ERβ)，盡管其對ER的結(jié)合親和力僅有E2的千分之一，但即使是低劑量的BPA也具有生殖毒性[1]。由于BPA與2種ER亞型的配體結(jié)合域結(jié)合后引起的ER構(gòu)象變化的不同使得BPA同E2一樣是ERα的激動劑，而成了ERβ的拮抗劑。BPA與ER的作用方式分為基因組作用模式和非基因組作用模式。經(jīng)典基因組模式為BPA與細胞內(nèi)的ERα和ERβ完全結(jié)合，形成配體-受體復合物，通過與細胞核內(nèi)的雌激素反應元件(estrogen responsive element, ERE)結(jié)合調(diào)控靶基因表達；非基因組作用模式中BPA通過與細胞膜上的ERα和ERβ結(jié)合使其活化并與膜內(nèi)其他信號蛋白(如生長因子受體等)相互作用，從而形成多分子復合物介導快速信號傳導的發(fā)生[69]。非基因組模式下BPA可通過活化ERα介導的核外信號激活ERK/MAPK、PI3K/Akt和Ca2+流(與E2作用模式相同)以及抑制ERβ介導的p38/MAPK信號通路(與E2作用模式相反)發(fā)揮作用[70]，不少研究表明BPA的非基因組雌激素活性與E2相當[71]。

表2 BPA類似物對雌性動物生殖系統(tǒng)的危害Table 2 The effect of BPA analogies on female reproductive systems

體內(nèi)和體外實驗均發(fā)現(xiàn)BPS和BPF具有和BPA類似的雌激素和抗雌激素效應[39]，BPS在低劑量下也可高效激活ERα介導的ERK/MAPK通路；通過離體模型推測BPS和BPF的雌激素受體結(jié)合活性約為BPA的0.32倍和1.07倍。利用cyp19b-GFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚(ER特異性介導E2調(diào)控cyp19b基因的表達)的研究也表明BPF同BPA有相當?shù)拇萍に鼗钚?，而BPS的雌激素活性較弱[72]。在Tox21的比較中，BPAF不僅是BPA類似物中活性最高的ER激動劑，離體研究表明BPAF對ERβ的結(jié)合活性比ERα的更高[2, 73]。BPAF可通過ERα誘導的C-X-C趨化因子配體12的表達而促進ERα陽性乳腺癌細胞(T47D和MCF-7)的增殖，但對ERα陰性細胞的增殖無影響[74]；同時有研究指出BPAF可激活ERβ通路和Ca2+流超載致使維持卵巢顆粒細胞生理特性的KGN細胞出現(xiàn)凋亡[75]。而利用干擾RNA對ER進行沉默的研究也表明BPAF通過經(jīng)典基因組通路和ERK1/2依賴的非基因組通路調(diào)控雌激素活性通路[76]。動物模型和體外研究均表明BPB有與BPA相似甚至更高的雌激素活性效價，可與E2對ER產(chǎn)生競爭性結(jié)合[77]；此外，BPB可通過破壞卵母細胞中ERα的定位模式并誘導其功能障礙而影響卵母細胞的減數(shù)分裂及其細胞質(zhì)量，BPB可能通過胞外ERK1/2信號通路和PI3K/AKT信號通路誘導睪丸間質(zhì)細胞增殖[62, 78]。采用青鳉進行的體內(nèi)實驗以及HELN-ERα和HELN-ERβ熒光素酶報告體系的體外實驗均表明，BPC可結(jié)合ERα和ERβ并激活下游通路最終表現(xiàn)出強雌激素效應，其作用強度與BPAF和BPB在同一水平(均強于BPA)[50, 73, 79]。同時，BPC、BPAF、BPE與BPA類似，均可通過ER介導的ERK1/2信號通路提高細胞內(nèi)Ca2+水平，進一步表明其可通過ER途徑影響生殖[80]。分子動力學(molecular dynamics, MD)模擬聯(lián)合體外的競爭性結(jié)合實驗或細胞實驗的研究結(jié)果也表明BPE、BPZ、BPBP、BPAP和四甲基雙酚A(TMBPA)通過與ERα-LBD結(jié)合這一分子起始事件激活下游通路引發(fā)雌激素效應[81-83]，而BPM、BPP和BPFL這3種BPA類似物在分子對接、MD模擬和體外實驗中被證明為ER的拮抗劑，抑制HELN-ERα/ERβ的轉(zhuǎn)錄活性[79, 84-85]，且Cao等[86]認為hERα中的Thr347是區(qū)分BPs拮抗或激動雌激素效應的關(guān)鍵殘基。

2.2 膜雌激素受體途徑

除了與經(jīng)典的ER結(jié)合，BPA類似物還被證明可通過膜雌激素受體GPR30發(fā)揮內(nèi)分泌干擾效應。GPR30是與ER作用模式不同的一種膜相關(guān)雌激素受體，主要通過激活第二信使環(huán)腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)和表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)等的蛋白激酶途徑介導快速非基因效應和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)[87]。BPA在低濃度時主要是通過激活GPR30介導的非基因組途徑產(chǎn)生毒性效應[88]。環(huán)境相關(guān)劑量下BPA可通過激活GPR30介導的cGMP-PKG信號通路、cAMP-PKA信號通路、EGFR-MAPK通路介導的ERK1/2快速磷酸化等途徑影響精原細胞、精母細胞的增殖和卵母細胞減數(shù)分裂[87, 89-90]。通過SKBR-3細胞熒光競爭結(jié)合實驗，發(fā)現(xiàn)BPS、BPF、BPAF、BPB與BPA類似同樣可與GPR30直接結(jié)合，且BPAF和BPB的結(jié)合親和力比BPA高9倍[91]。除此之外，低劑量的BPF可通過GPR30激活Akt和ERK1/2信號從而誘導細胞增殖，這與E2的作用模式相似[92]。與BPF相同，不同的研究均表明BPAF可通過GPR30單獨(不需要ERα參與)激活ERK1/2和Akt磷酸化等信號通路誘導的細胞增殖，這一結(jié)果也為BPAF在乳腺癌產(chǎn)生和發(fā)展中的作用提供了解釋[93-94]。Li等[62]發(fā)現(xiàn)BPB可能通過GPR30介導的ERK1/2信號級聯(lián)放大反應誘導青春期后期大鼠睪丸間質(zhì)細胞的增殖。BPC同樣被報道為GPR30的激動劑，且其誘導細胞內(nèi)Ca2+水平增加可能同樣與GPR30介導的信號通路有關(guān)[80, 95]。Liu等[96]通過MD模擬發(fā)現(xiàn)，Leu137TM3和Trp272TM6是這幾種BPs識別結(jié)合并激活GPR30的關(guān)鍵殘基，為BPs與GPR30分子識別機制研究提供了理論依據(jù)。

2.3 雄激素受體途徑

與BPs和ER作用會產(chǎn)生類雌激素效應和抗雌激素效應不同，幾乎所有已被報道的在雄激素受體途徑發(fā)生作用的BPs都會產(chǎn)生抗雄激素作用[1-2]。BPA產(chǎn)生抗雄激素效應可能是因為：(1) BPA與AR的結(jié)合干擾了正常雄激素-AR復合物氨基/羧基末端結(jié)構(gòu)域(N/C)之間的分子內(nèi)的二聚化作用，導致AR穩(wěn)定性降低而自然降解[97]；(2) BPA促進AR泛素化而降解；(3) BPA結(jié)合AR-LBD導致受體與其輔助伴侶蛋白——90-kDa熱休克蛋白(Hsp90)穩(wěn)定性增加，而阻止AR與之解離，最終導致AR無法轉(zhuǎn)移至細胞核以介導下游基因的轉(zhuǎn)錄；(4) BPA占用AR-LBD位點后干擾了輔助AR核轉(zhuǎn)位的配體依賴的核定位序列，導致配體-受體復合物介導的基因轉(zhuǎn)錄不會被刺激，從而產(chǎn)生生殖毒害作用[98]。BPS、BPF、BPAF、BPB、BPE、BPC、BPZ、BPAP、TMBPA和BPP也在不同的體外雄激素受體終點檢測中顯示為抗雄激素效應，其中BPAF、TMBPA和BPE可能具有更強的雄激素拮抗效應，而BPS的拮抗效應最弱[2, 99]。Conroy-Ben等[81]通過QSAR的方法對比雄激素拮抗劑——羥基氟他胺和BPs與AR結(jié)合模型發(fā)現(xiàn)BPBP、BPZ、BPB、BPA、BPE、BPF和BPS均通過與AR-LBD的Thr877和Asn705形成氫鍵而結(jié)合(與羥基氟他胺相同)，且QSAR模型研究結(jié)果與酵母報告基因雄激素試驗(YAS)測定的結(jié)果一致。目前，BPs與雄激素受體相互結(jié)合并發(fā)揮生理相關(guān)作用的研究有限，且對其產(chǎn)生抗雄激素效應的相關(guān)機制了解不足，未來應予以關(guān)注。

2.4 雌激素相關(guān)受體途徑

ERRγ是一種孤兒受體，也是人類48個核受體之一，在發(fā)育期哺乳動物大腦以及成年動物大腦和肺等器官中高表達，有研究指出ERRγ在胎兒大腦和胎盤中均有表達，并且ERRγ可能參與前列腺的生長和發(fā)育[100]。而不少體外競爭性結(jié)合ERRγ-LBD的實驗中表明BPA與ERRγ有很強的結(jié)合親和力并且通過保持或鎖定ERRγ-LBD的helix12的活性構(gòu)象而維持ERRγ的高轉(zhuǎn)錄活性[73, 101-102]。BPA可與下丘腦[103]、海馬區(qū)神經(jīng)元[104]和胎盤[105]中的ERRγ結(jié)合而影響下游生殖調(diào)控、棘突發(fā)生(MAPK信號途徑誘導)及BPA在胎盤中的積累。體外實驗表明，BPA以時間依賴性的方式誘導ERRγ核易位并增加BPA/ERRγ靶基因的表達，BPA通過促進Ca2+的內(nèi)流和表皮生長因子(EGF)的分泌，導致EGFR/ERK通路被激活，最終使得BPA通過BPA/ERRγ/EGF/EGFR/ERK信號通路誘導細胞增殖[106]。BPS、BPF、BPAF、BPB、BPC、BPE、BPZ、BPAP、BPP和BPM與ERRγ的體外結(jié)合實驗同樣證明這些BPs具有較高的ERRγ受體親和力，且BPB和BPE的結(jié)合親和力與BPA相當[73]。Okada等[107]在2008年也得到類似的結(jié)果，而且部分BPs的結(jié)合活性與人ERRγ熒光素酶報告基因的測定結(jié)果吻合。低濃度BPA、BPS和BPF暴露小鼠精母細胞GC-2會顯著提高細胞中Errγ的轉(zhuǎn)錄，表明ERRγ也是BPS和BPF對生物體生殖產(chǎn)生影響的靶點之一[108]。而對BPAF和BPC進行分子比較對接的結(jié)果顯示，BPAF和BPC在與ERRγ-LBD結(jié)合時也表現(xiàn)為激動構(gòu)象，發(fā)揮關(guān)鍵作用的可能是ERRγ-LBD的helix7上的N346與BPs形成的氫鍵，且這一計算機預測結(jié)果與HG5LN GAL4-ERRγ細胞暴露的活性檢測結(jié)果相關(guān)聯(lián)[109]。雖然通過體外的配體-受體競爭性結(jié)合實驗和轉(zhuǎn)染細胞活力及基因表達測定研究可知曉大部分BPs都可與ERRγ進行結(jié)合，但是BPs在ERRγ相關(guān)通路上對生物體產(chǎn)生生殖毒性的研究仍然有限，也需要更進一步的探究。

2.5 甲狀腺激素相關(guān)受體途徑

甲狀腺激素(TH，包括T3和T4)是哺乳動物卵巢正常發(fā)育所必需的激素，可改變促性腺激素的釋放進而影響卵泡命運，甲狀腺激素失衡則會導致卵巢質(zhì)量下降，精子發(fā)生、數(shù)量及活力下降，生殖激素合成和分泌紊亂，甚至增加不孕風險[110-111]。在非洲爪蟾[112]、青鳉[113]、嚙齒動物[111-112]和豬顆粒細胞[110]中的實驗均表明BPA可通過干擾TH與TR的結(jié)合影響信號的傳導。BPA暴露促進斑馬魚幼魚體內(nèi)甲狀腺激素運轉(zhuǎn)蛋白(TTR)的表達，且體外熒光競爭實驗也表明BPA可與TTR結(jié)合，干擾體內(nèi)正常TH的運輸[114-115]。另外也有證據(jù)表明BPA可能會通過干擾TH的合成而對生物體產(chǎn)生干擾，BPA暴露斑馬魚后，TH合成相關(guān)基因(tg、tshr)的表達量顯著上調(diào)，而大鼠甲狀腺腫瘤細胞FRTL-5暴露于較低濃度BPA后同樣使得TH合成相關(guān)基因(tg、tshr、nis和tpo)的表達上調(diào)[114, 116]。綜上所述，BPA可通過對TH的產(chǎn)生、運輸和作用環(huán)節(jié)產(chǎn)生干擾效應，從而間接影響生殖健康。雖然BPA類似物于甲狀腺干擾的研究較少，但是已有研究均表明BPA類似物會造成甲狀腺干擾。Lu等[117]利用MD模擬結(jié)合體內(nèi)及體外實驗發(fā)現(xiàn)BPA、BPS等BPs對TRβ有不同程度的抗甲狀腺激素活性。而暴露于BPF和BPS的斑馬魚甲狀腺發(fā)育相關(guān)基因(hhex和tg)、甲狀腺激素運輸相關(guān)基因(ttr)和甲狀腺激素代謝相關(guān)基因(ugt1ab)的轉(zhuǎn)錄發(fā)生了變化，且幼魚體內(nèi)的T3和T4含量顯著增加，說明BPS和BPF同樣可能干擾TH的合成、分泌及運輸[114]。分子對接結(jié)果提示BPS與BPF對TR有結(jié)合能力，體外熒光競爭結(jié)合實驗證實其能與TR結(jié)合(與BPA類似)；此外，3種BPs均能誘導TH依賴的垂體GH3細胞增殖，而在T3存在時抑制T3的誘導，表明BPS和BPF與BPA一樣具有干擾TH信號通路的潛力[118]。類似的結(jié)果也在BPAF、BPAP、BPC、BPB和BPZ暴露大鼠垂體GH3細胞后產(chǎn)生，表明BPA類似物的TH干擾能力[119]。結(jié)合上述研究可知這些BPA類似物的甲狀腺干擾效應和機制與BPA類似，需引起研究者的關(guān)注并進一步研究。

2.6 芳香烴受體途徑

芳香烴受體(AhR)是一種配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，AhR與配體結(jié)合后會被芳香烴受體核轉(zhuǎn)位蛋白(ARNT)帶入細胞核與特異性DNA反應元件結(jié)合，從而啟動包括細胞色素P450家族在內(nèi)的異源物質(zhì)代謝相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，其在生物體的發(fā)育、代謝過程和免疫炎癥中起著重要的作用。野生型和AhR-KO小鼠卵泡的BPA暴露實驗顯示，BPA可抑制2種卵泡生長并降低E2水平，且BPA對AhR-KO卵泡生長的抑制作用要弱于野生型，表明BPA可能通過AhR信號途徑部分抑制卵泡生長[120]。BPA暴露妊娠期大鼠可誘導胚胎中芳香烴受體抑制劑(AhR repressor, AhRR)的基因表達上調(diào)從而抑制胚胎中AhR的功能[121]。此外，圍產(chǎn)期暴露BPA導致的雄性后代的精子發(fā)生能力降低及精子畸形率增加，可能與睪丸中AhR信號通路所激活的炎癥反應有關(guān)[122]。最近的一項研究表明BPA類似物BPF、BPS和BPAF在低濃度(1～100 nmolL-1)下暴露HepG2細胞系均會誘導AhR的RNA和蛋白質(zhì)水平的增加，從而使受其調(diào)節(jié)的相關(guān)CYP酶的表達出現(xiàn)異常，最終加劇染色體損傷，且分子對接和分子動力學模擬結(jié)果也顯示上述BPs與AhR的結(jié)合親和力同強效激動劑(PCB 126)的親和力水平相當[123]。關(guān)于BPs與AhR相互作用的相關(guān)研究仍停留在計算模擬水平，需要更多的實驗證據(jù)來支撐這一觀點。

2.7 其他受體途徑

體外競爭結(jié)合受體測定的研究表明，除了能與上述幾種人核受體結(jié)合外，BPA、BPS、BPF、BPAF、BPB、BPC、BPE、BPZ、BPAP、BPP和BPM均可與孕烷X受體(PXR)進行結(jié)合；除BPS和BPF外，其他測試的BPs可與組成型雄烷受體(CAR)結(jié)合，且結(jié)合作用極強；而除BPS外，其他BPs均可結(jié)合糖皮質(zhì)激素受體(GR)[73]。Kojima等[99]在測定BPs暴露轉(zhuǎn)染人PXR的COS-7細胞的熒光素酶活性實驗中發(fā)現(xiàn)BPA、BPAF、BPB、BPZ、BPAP和BPP均是人PXR的激動劑，且BPZ、BPAP和BPP比BPA的激動效應更強。另一項關(guān)于HG5LN-PXR的研究顯示BPM和BPBP同樣是PXR的激動劑[79]。同時，Kojima等[99]還首次通過COS-7細胞的反式激活實驗證明了BPA及其類似物BPAF、BPB、BPZ、BPAP和BPP具有CAR逆向激動活性，同時通過基于CHO-K1細胞的反式激活實驗證明這6種BPs都是GR的拮抗劑。在一項暴露于BPA、BPS和BPF的重組酵母(穩(wěn)定表達人GR)系統(tǒng)中GR激活實驗的結(jié)果也同樣表明了BPs的GR拮抗作用[124]。

除了PXR、CAR和GR，BPAF、BPC、BPM和BPZ被證明可與人過氧化物酶體增殖物激活受體(hPPARs)和人視黃X受體(hRXRs)相互作用[125]，且與它們相比BPA具有更高的hPPARs和hRXRs結(jié)合親和力。綜上所述，BPA及其類似物同樣會對PXR、CAR、GR、PPAR和RXR這些同屬核受體家族的受體蛋白產(chǎn)生結(jié)合作用，即便最終激動或拮抗效應有所不同，但由于核受體作為配體激活的轉(zhuǎn)錄因子在特異性調(diào)節(jié)參與代謝、發(fā)育和繁殖的靶基因的表達上起著至關(guān)重要的作用，理應對這些污染物的核受體影響做更深層次的機制相關(guān)研究。

3 BPA類似物的人體生殖健康風險(Human reproductive health risks of BPA analogues)

BPA類似物主要通過消化道被人體接觸吸收，2013年的研究估算人體每日通過膳食攝入BPs的量為幼兒243 ng·kg-1(以體質(zhì)量計)和成人58.6 ng·kg-1(以體質(zhì)量計)，表明了BPs對人體的較高濃度持續(xù)暴露，由于BPA類似物在環(huán)境中的檢出量日益增多，人類對BPs的接觸也呈上升趨勢[126]。最近一項基于廢水流行病學評估人類暴露于BPA類似物的研究則表明，人類平均每日BPF、BPS、BPP、BPZ、BPB、BPAF和BPAP的暴露水平分別為10.2、5.21、1.15、0.66、0.61、0.58和0.35 μg，說明BPA類似物的人體暴露風險正在升高[32]。相較于多數(shù)模式動物研究中的BPs暴露濃度而言，人類暴露劑量水平相對較低，但已有環(huán)境相關(guān)濃度的研究表明在人類可接觸的BPs濃度下，動物研究仍顯示出了BPs的生殖毒性，提示BPA類似物的人體生殖健康風險不容忽視[40, 47, 49, 65]。BPS、BPAF和BPB被人體攝入后主要在肝臟和腸道中被代謝為BPs-葡糖苷酸，少量代謝為BPs-硫酸鹽、羥基化BPs和其他代謝產(chǎn)物，而BPF主要代謝為BPF-硫酸鹽后隨尿液排出[31, 126]。一項d4-BPS于人體內(nèi)的藥代動力學研究表明，與BPA相比，BPS吸收快、代謝慢，其在口服后1 h內(nèi)被迅速吸收，人體內(nèi)半衰期為6.8 h，且在人體內(nèi)主要以毒性更強的未偶聯(lián)形式存在，48 h時BPS在男性中通過尿液排泄率約為92.17%，女性排泄率為70.36%，提示女性可能有更高的BPs暴露風險[127]。BPF和BPAF同樣在動物研究中被報道有比BPA更長的體內(nèi)半衰期和更高的殘留量[128]。Karrer等[129]基于生理毒物動力學計算機模型分析發(fā)現(xiàn)，在環(huán)境相關(guān)濃度下BPs在腸道和肝臟中代謝速率的排序為：BPA>BPF>BPS。此外，BPs在體內(nèi)的代謝產(chǎn)物同樣存在健康風險，研究表明BPAF的主要代謝產(chǎn)物BPAF-葡糖苷酸可對PXR和PPARγ產(chǎn)生拮抗作用[130]；BPB、BPC和BPF可通過多種途徑產(chǎn)生二聚代謝產(chǎn)物，盡管對其毒性研究甚少，但由于BPA的二聚代謝物被證明比BPA具有更強的雌激素效應，故而BPs的代謝產(chǎn)物毒性也應引起關(guān)注[9]。雖然大部分BPs可能通過人體代謝降低毒性后排出，但因環(huán)境中BPs的廣泛存在和日益升高的含量，人體處在持續(xù)暴露中，使得體內(nèi)游離BPs暴露風險增加。

由于BPA類似物的酚類結(jié)構(gòu)與人體性激素結(jié)構(gòu)相似，被認為可干擾人體內(nèi)雌二醇、孕酮、黃體生成素、促卵泡激素、睪酮和雄烯二酮等性激素水平，從而對人體的生殖系統(tǒng)造成擾亂，影響人類生殖健康[131-133]。BPE、BPF同BPA一樣可抑制人類睪丸外植體睪酮的生成，BPS和BPB則會加快睪丸間質(zhì)細胞INSL3的生成，表明BPA類似物對雄性生殖具干擾效應[134]。BPAF、BPB和BPC等BPs可通過激活CatSper影響人類精子細胞Ca2+信號通路，而破壞人類精子功能[135]。流行病學研究表明BPA類似物的暴露與男性生殖障礙、前列腺癌、女性不孕、乳腺癌和多囊卵巢綜合征等生殖相關(guān)疾病的發(fā)生有關(guān)[2, 136-137]。除此之外，BPA類似物與女性孕產(chǎn)風險及胎兒生長緩慢具有相關(guān)性。孕婦尿液中BPS含量與女性妊娠年齡和女嬰晚產(chǎn)風險的增加相關(guān)[138]，另有報道孕婦尿液中BPS濃度與早產(chǎn)相關(guān)[139]。母親尿液BPS含量與女嬰體質(zhì)量偏低和下腹圍及股骨長度相關(guān)[140]。而產(chǎn)前暴露于BPF可能與男嬰出生體質(zhì)量降低有相關(guān)性[141]。BPB則被報道與子宮內(nèi)膜異位有關(guān)[128]。最新的一項橫斷面分析顯示適孕女性尿液BPC含量與甲狀腺體積呈顯著負相關(guān)，與促甲狀腺激素含量呈顯著正相關(guān)，而BPC的持續(xù)暴露可能會導致甲狀腺功能退化進而造成孕婦先兆子癇、胎盤早剝、胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩、早產(chǎn)以及流產(chǎn)等生殖健康風險[142]。此外，在葉酸補充不足條件下，孕期女性尿液中總雙酚類物質(zhì)(包括BPA、BPS、BPF、BPAF、BPZ、BPB、BPAP和BPP)含量與孕期時間延長有關(guān)[143]。綜上所述，盡管BPs在人體內(nèi)可能被代謝排出，但是持續(xù)暴露于BPs仍然可能引發(fā)生殖健康風險。

綜合計算機模擬(QSAR和MD模擬)和體外實驗(酵母或細胞報告基因檢測)的結(jié)果，對各BPA類似物的ER結(jié)合親和力和類雌激素或抗雌激素效應作為指標進行評估得知，相較于BPA而言，除BPS外，其他BPA類似物均表現(xiàn)出與BPA相似或更強的ER結(jié)合能力且體外實驗同樣證實這一結(jié)果(表3)[79, 81, 83-85]。在眾多BPs中，BPAF所展現(xiàn)出的類雌激素作用最強，而這與BPAF分子結(jié)構(gòu)中酚環(huán)間烷基部分的鹵化作用相關(guān)，其對配體-ERα結(jié)合過程中的靜電相互作用和氫鍵的產(chǎn)生有較大影響[144]。相比之下，BPS表現(xiàn)出比BPA更低的ER結(jié)合親和力以及更弱的雌激素效應，這可能與其結(jié)構(gòu)中碳氧雙鍵飽和的連接方式有關(guān)，在今后新型BPA類似物的設計中應充分考慮。這提示我們計算機模擬是對新型BPA替代物毒性預測的有效手段，未來應該綜合開發(fā)基于不同核受體(NRs)的毒性預測模型以期更準確地預測新型化合物毒性。

表3 BPA類似物的內(nèi)分泌干擾能力(基于競爭性結(jié)合人雌激素受體(ER)的實驗結(jié)果)[79, 81, 83-85]Table 3 Endocrine activity of BPA analogues (based on the competitive receptor-binding assays of human estrogen receptor (ER)) [79, 81, 83-85]

4 展望(Perspectives)

BPs作為環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，盡管BPA在人類直接接觸途徑上因各國政策的調(diào)整而使其風險降低，但是BPA類似物的開發(fā)以及應用已然成了新的問題，且目前已經(jīng)在世界范圍內(nèi)多種人體樣本中普遍存在，其能通過胎盤屏障和血睪屏障影響生殖腺而最終可能對子代產(chǎn)生危害，在職業(yè)接觸人群的分析中也發(fā)現(xiàn)這類化學品的長期接觸會對人類生殖產(chǎn)生不利影響，嚴重時可導致不孕不育。通過在哺乳類模式動物和水生魚類模式動物上的研究也進一步說明了其在雄性和雌性生殖系統(tǒng)上的毒性作用，但目前關(guān)于BPA類似物在動物模型研究中的暴露濃度主要是基于BPA對于實驗室動物的最低可見有害作用濃度和人體每日耐受攝入量進行設置，普遍高于環(huán)境濃度且暴露時間相對較短，真實環(huán)境濃度下BPA類似物對生物體長期暴露的研究偏少，不利于評估BPA類似物對人體健康的影響。隨著相關(guān)研究的增多，環(huán)境相關(guān)濃度已經(jīng)受到更多國際同行的重視，所以暴露劑量的降低、暴露時間的延長以及模擬人群的暴露途徑是環(huán)境毒理學領(lǐng)域的關(guān)注重點。另外，目前的研究仍舊以BPA環(huán)境檢測和人體檢出為基礎，但隨著BPA限用，多種類似物可能取而代之，因此化學品的實際使用情況在確定毒理研究的優(yōu)先次序中也很重要。此外，生活環(huán)境的復雜性使得人體暴露于多種BPs下，在單一BPA類似物的研究基礎上也應考察復合暴露可能帶來的影響。

BPA類似物的生物利用度、偶聯(lián)度以及體內(nèi)半衰期存在差異，相關(guān)研究較少且多為體外代謝模型，無法模擬化合物的體內(nèi)Ⅱ期代謝，故而BPA類似物的動物體內(nèi)代謝同樣是這一領(lǐng)域的新關(guān)注點。盡管進入人體的BPs大部分可通過葡萄糖醛酸化和硫酸化而排出體外，但不少研究仍表明一些已投入生產(chǎn)應用的新型BPA類似物(如BPAF、BPB)的生殖毒性相較BPA反而更高，而對這些類似物的生物安全性的研究仍然較少，在其生殖毒性的機制方面同樣需要更深的探究?，F(xiàn)有研究表明BPA的體內(nèi)代謝產(chǎn)物具有比BPA更強的雌激素效應，但BPA類似物的相關(guān)研究同樣較少，了解BPs在體內(nèi)的代謝過程和代謝產(chǎn)物的毒性能對BPs生殖毒性發(fā)生的機制有更全面的解釋，在未來的研究中應該更加關(guān)注BPA類似物在人體內(nèi)代謝產(chǎn)物的毒性評估。

伴隨著計算機科學在環(huán)境領(lǐng)域的廣泛應用和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析方法的日益成熟，開發(fā)高通量、穩(wěn)定、易操作的體外模擬技術(shù)對化合物毒性進行預測同樣是毒理學領(lǐng)域的發(fā)展重點，由于其在化學品毒性預測方面的極大潛力，如今已經(jīng)得到了廣泛應用并受到了領(lǐng)域內(nèi)的認可。依托于上述計算機模擬技術(shù)，BPA及其類似物對ER蛋白結(jié)合和效應產(chǎn)生機制已得到了較為充分的研究，但隨著對其他核受體和膜受體在EDC引起生殖和其他內(nèi)分泌干擾研究中的關(guān)注，相關(guān)的機制研究仍然極為缺乏，也需要更多從業(yè)者探究和解釋，并且需要更多體內(nèi)研究以補充體外研究的不足。