基于雙指標(biāo)分析法的新疆產(chǎn)羅布麻紅外光譜指紋圖譜研究

艾比拜罕·麥提如則，徐 榮，李曉瑾，*，樊叢照，祈志勇，朱 軍，王果平，趙亞琴

1.新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830054 2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京 100730 3.新疆維吾爾自治區(qū)中藥民族藥研究所，新疆 烏魯木齊 830094

引 言

羅布麻是藥食兼用、可保護(hù)生態(tài)和極具開發(fā)潛力的藥用植物資源，因羅布泊而得名，以新疆地區(qū)的野生資源蘊(yùn)藏量最為豐富?！吨腥A人民共和國藥典》記載羅布麻葉(Apocyniveneti Folium)為夾竹桃科植物羅布麻ApocynumvenetumL.的干燥葉，有平肝安神、清熱利水功效，主要用于治療肝陽眩暈、心悸失眠、浮腫尿少，并對(duì)高血壓、抑郁癥有良好的治療效果[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，羅布麻具有抗氧化、抗糖尿病、抗癌、治療心血管疾病、保肝和抑菌等活性[2-5]。羅布麻藥材中含有黃酮、苯丙素、多糖、萜類、有機(jī)酸和香豆素等化學(xué)成分。羅布麻在新疆分布較廣，主要分布在阿勒泰、和田、博樂、塔什庫爾干、瑪納斯和塔城等地區(qū)[6]，阿勒泰地區(qū)存在大面積的種植區(qū)域[7]。本研究采收的17批藥材均來自以上產(chǎn)地，來源廣泛且具有代表性。為保證臨床用藥的安全穩(wěn)定，已有文獻(xiàn)采用傳統(tǒng)的來源、性狀、顯微、理化鑒別和現(xiàn)代色譜、波譜技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法評(píng)價(jià)了羅布麻藥材的質(zhì)量[8-9]，但結(jié)合傅里葉變換紅外光譜(FTIR)和雙指標(biāo)序列分析法分析羅布麻藥材質(zhì)量差異的研究未見報(bào)道。

當(dāng)有機(jī)物分子振動(dòng)頻率與照射的紅外區(qū)域電磁波頻率一致時(shí)，分子中的化學(xué)鍵或官能團(tuán)發(fā)生吸收，用紅外光譜可記錄這些化學(xué)鍵或官能團(tuán)不同的吸收頻率曲線。紅外光譜法分析速度快，信噪比高，樣品用量少，因此廣泛應(yīng)用于鑒定、分子結(jié)構(gòu)測(cè)定和定性定量研究中。雙指標(biāo)序列法采用兩個(gè)藥材共有峰和相對(duì)于共有峰存在的非共有吸收峰表示這兩個(gè)藥材之間的異同程度。每個(gè)藥材建立一個(gè)雙指標(biāo)空間，共有峰率和變異峰率(非共有峰率)是兩個(gè)相互獨(dú)立的指標(biāo)，這種二維度鑒別較聚類分析和相關(guān)系數(shù)分析豐富了鑒別信息，能夠互相證明分析方法是否適用。本研究采用紅外光譜相似系數(shù)，結(jié)合系統(tǒng)聚類分析和能夠多維鑒別的雙指標(biāo)序列分析法對(duì)收集的新疆羅布麻藥材紅外指紋圖譜進(jìn)行了分析，旨在為分析評(píng)價(jià)羅布麻藥材質(zhì)量差異提供參考依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Spectrum two型傅里葉變換紅外光譜儀(美國Perkin Elmer公司)；YP-2壓片機(jī)(上海山岳科學(xué)儀器有限公司)；AB265-S(1/10萬)電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；瑪瑙研缽；KBr光譜純(北京化學(xué)試劑公司)。

1.2 樣品

17批藥材于2019年7月上旬采收，除去雜質(zhì)后陰干；樣品來源于羅布麻在新疆的所有分布產(chǎn)區(qū)，并將同一產(chǎn)地的所有樣品混合后分成3個(gè)重復(fù)，使藥材取樣均勻且具有代表性。所有樣品經(jīng)新疆維吾爾自治區(qū)中藥民族藥研究所王果平研究員鑒定，為羅布麻ApocynumvenetumL.的干燥葉。藥材信息見表1。

表1 藥材信息Table 1 Information of medicinal materials

1.3 方法

1.3.1 樣品的制備

樣品充分干燥并粉碎過200目篩，取2.0 mg樣品粉末放入研缽，再放入200 mg KBr粉末混勻研磨至無明顯顆粒，轉(zhuǎn)移到模具中，20 MPa下經(jīng)1 min壓成近透明薄片。

1.3.2 光譜測(cè)定

室內(nèi)溫度保持在20 ℃左右，濕度保持在30%以下；光譜范圍4 000～400 cm-1，分辨率為4 cm-1，累計(jì)掃描16次，掃描時(shí)實(shí)時(shí)扣除H2O和CO2的干擾。以溴化鉀為背景，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)樣品獲得的3幅紅外光譜圖，進(jìn)行加和運(yùn)算取其平均圖譜作為該樣品的紅外光譜圖。得到圖譜后采用Spectrum 10.4.2軟件進(jìn)行基線自動(dòng)校正，13點(diǎn)平滑，吸光度歸一化為1.3。二階導(dǎo)數(shù)譜范圍為1 800～600 cm-1。用Spectrum 10.4.2軟件中的compare軟件，以S1為設(shè)置參比，計(jì)算紅外光譜圖譜帶較密集的指紋區(qū)(1 800～400 cm-1)的相關(guān)系數(shù)。采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，采用各個(gè)藥材的吸收波數(shù)分別計(jì)算藥材之間共有峰率和變異峰率并進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1精密度試驗(yàn)

取同一樣品片(S1)連續(xù)測(cè)定5次，計(jì)算紅外光譜圖之間的相關(guān)系數(shù)。結(jié)果，所得紅外圖譜一致，相關(guān)系數(shù)分別為1.000 0，0.999 9，0.999 9，0.999 9，0.999 9，RSD=5.50×10-5。

2.1.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一樣品片(S1)放入真空干燥器內(nèi)保存，每隔1 h測(cè)定1次，計(jì)算5 h內(nèi)所得紅外光譜圖之間的相關(guān)系數(shù)。結(jié)果，圖譜間相關(guān)系數(shù)分別為1.000 0，0.999 9，0.999 7，0.999 8，0.999 6，RSD=1.58×10-4。

2.1.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一樣品(S1)粉沫5份,稱量,分別壓片測(cè)定，計(jì)算紅外光譜圖之間的相關(guān)系數(shù)。結(jié)果，圖譜間相關(guān)系數(shù)分別為1.000 0，0.999 4，0.996 0，0.996 0，0.997 9，RSD=1.87×10-3。

2.2 羅布麻藥材的紅外指紋圖譜分析

圖1 不同產(chǎn)地(S1—S17)羅布麻藥材的紅外光譜圖Fig.1 FTIR spectra of A. venetum samples from different regions (S1—S17)

2.3 羅布麻藥材的二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜譜分析

為了獲得更多細(xì)微的差異信息，在一維紅外指紋圖譜的基礎(chǔ)上建立了二階導(dǎo)數(shù)光譜，見圖2(S1—S17)，縱坐標(biāo)為10-3A。由圖2可知，羅布麻藥材二階導(dǎo)數(shù)光譜的峰形仍具有較大的相似性，但在1 444～1 738和833～1 030 cm-1范圍內(nèi)峰數(shù)明顯增加。1 634 cm-1處為酚羥基芳環(huán)的骨架伸縮振動(dòng)峰，1 149，1 125和1 028 cm-1附近為糖類的特征吸收峰，950，921和730 cm-1處為糖環(huán)振動(dòng)特征吸收峰，都進(jìn)一步提示羅布麻中含有糖(苷)類化合物[15-16]。1 414和617～889 cm-1范圍為苯環(huán)取代基類的C—H面外彎曲振動(dòng)的特征峰[17]，不同產(chǎn)地樣品特征峰強(qiáng)弱的差異可能與其黃酮類和芳香族化合物含量存在差異有關(guān)。

圖2 不同產(chǎn)地羅布麻藥材(S1—S17)的二階導(dǎo)數(shù)光譜圖Fig.2 Secondary derivative spectra of A. venetum samples from different regions (S1—S17)

2.4 聚類分析

將17批羅布麻藥材的吸收峰波數(shù)導(dǎo)入SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，采用平均聯(lián)接(組間)法，以歐式距離平方(SED)為測(cè)度進(jìn)行聚類分析,見圖3。結(jié)果表明，S9與S14，S2與S10，S3與S8，S12與S13最先聚為一類，說明這些藥材內(nèi)部分子結(jié)構(gòu)較相似；當(dāng)歐式距離為15時(shí)，可將藥材分為四大類，即在1 615 cm-1處有吸收峰的藥材為一類，在1 646 cm-1處有吸收峰的藥材為一類，1 646和1 615 cm-1處均有吸收峰的藥材S1為一類，在2 962 cm-1處唯有吸收的藥材S5為一類；當(dāng)歐式距離為20時(shí)，可將藥材分為S5和其他藥材兩大類。分類結(jié)果與相關(guān)系數(shù)結(jié)果一致，波數(shù)相似性高樣品聚在一起，說明歐式距離較近的藥材之間化學(xué)成分的種類和含量也比較接近。

圖3 不同產(chǎn)地羅布麻藥材聚類分析結(jié)果Fig.3 Cluster analysis results of A. venetum samples from different regions

2.5 建立共有峰率和變異峰率雙指標(biāo)序列

2.5.1 共有峰的確定方法

對(duì)于一組吸收峰，若組內(nèi)吸收峰的波數(shù)最大差值小于該組峰與其相鄰組之間的平均波數(shù)之差，確定該組峰是一組共有峰。如1 102，1 102，1 102，1 103，1 102，1 101，1 104，1 104，1 103，1 104，1 103，1 104，1 103，1 103，1 103，1 103和1 102 cm-1，這組峰平均波數(shù)為1 103 cm-1，該組內(nèi)最大波數(shù)差為2 cm-1；該組峰前后相鄰組峰的平均波數(shù)值分別為1 202和1 068 cm-1，與其前后相鄰組峰的平均波數(shù)值差分別是99和35 cm-1，明顯大于組內(nèi)最大波數(shù)差2 cm-1，可判斷該組峰是共有峰。

2.5.2 羅布麻藥材紅外指紋圖譜共有峰率和變異峰率雙指標(biāo)序列

根據(jù)共有峰率公式P=Ng/Nd×100%(其中Ng為共有峰數(shù)，Nd為獨(dú)立峰數(shù))和變異峰率公式Pva=na/Ng×100%,Pvb=nb/Ng×100%(其中na和nb分別為圖譜a和b中相對(duì)于共有峰存在的非共有峰數(shù)),計(jì)算紅外光譜指紋圖譜共有峰率和變異(非共有)峰率[18]。建立不同產(chǎn)地羅布麻藥材紅外光譜指紋圖譜雙指標(biāo)分析序列后，根據(jù)共有峰率P和變異峰率Pva，Pvb大小對(duì)雙指標(biāo)序列結(jié)果進(jìn)行近似對(duì)、近似組劃分，從而判斷藥材間異同程度。

A組S2:S10(100;0,0),S3:S8(100;0,0),S9:S14(100;0,0),S12:S13(100;0,0)

B組S1:S11(94.9;21.4,7.1),S1:S15 S16(88.9;6.3,6.3),S2:S6 S9 S14(87.5;7.1,7.1),S2:S16(87.5;0,14.3),S3:S12 S13(87.5;0,14.3),S5:S6(88.2;13.3,0),S6:S5 S16(88.2;0,13.3),S6:S2 S9 S10 S14(87.5;7.1,7.1),S7:S15(94.1;0,6.3),S7:S12 S13(88.2;6.7,6.7),S8:S11 S13(93.3;0,7.1),S8:S12(87.5;0,14.3),S9:S16(88.2;0,13.3),S9:S2 S6 S10 S11(87.5;7.1,7.1),S10:S16(88.2;0,13.3),S10:S6 S9 S14(87.5;7.1,7.1),S11:S12 S13(93.8;0,6.7),S11:S15 S16(88.2;0,13.3),S11:S9 S14(87.5;7.1,7.1),S12:S15 S16 (94.1;0,6.3),S12:S11(93.8;6.7,0),S12:S7(88.2;6.7,6.7),S12:S3 S8(87.5,14.3,0),S13:S15 S16(94.1;0,6.3),S13:S11(93.8;6.7,0),S13:S8(93.3;7.1,0),S13:S7(88.2;6.7,6.7),S13:S3(87.5,14.3,0),S14:S2 S6 S10 S11(87.5;7.1,7.1),S15:S7 S12 S13(94.1;6.3,0),S15:S1 S16(88.9;6.3,6.3),S15:S11(88.2;13.3,0),S16:S12 S13(94.1;6.3,0),S16:S1 S15(88.9;6.3,6.3),S16:S6 S9 S10 S11(88.2;13.3,0),S16:S2(87.5;14.3,0)

C組S11:S3(61.9;53.8,7.7),S11:S17(66.7;7.1,42.9),S5:S3 S8(63.2；41.7，16.7)

其中S1:S11(94.9;21.4,7.1)表示S1和S11的共有峰率為94.9%，S1中相對(duì)于共有峰的非共有峰率(變異峰率)為21.4%，S11中相對(duì)于共有峰的非共有峰率為7.1%。S2:S6 S9 S14(87.5;7.1,7.1)表示S2與S6，S9和S14分別計(jì)算出來的共有峰率均為77.8%，S1變異峰率為7.1%，S6，S9和S14分別計(jì)算出來的變異峰率均為7.1%。在A組中S2:S10，S3:S8，S9:S14和S12:S13序列共有峰率為100%，說明藥材內(nèi)部信息高度一致。B組序列共有峰率相對(duì)較高，而C組序列變異峰率達(dá)53.8%，分析認(rèn)為未表現(xiàn)出明顯的產(chǎn)地差異性。

3 結(jié) 論

建立了新疆不同產(chǎn)地羅布麻藥材的指紋圖譜，其中各藥材紅外光譜的峰形、峰位相似。一維紅外光譜與二階導(dǎo)數(shù)分析方法相結(jié)合，獲得不同產(chǎn)地羅布麻藥材的化學(xué)成分結(jié)構(gòu)信息，證明該鑒定方法在藥材鑒別上具有可行性。本實(shí)驗(yàn)所采用的紅外光譜法簡(jiǎn)便靈敏，檢測(cè)出液相實(shí)驗(yàn)中直接檢測(cè)不到的鈣鹽離子。指紋圖譜強(qiáng)調(diào)整體性，紅外光譜相關(guān)系數(shù)考察樣品之間的相似性，兩種分析結(jié)果均說明不同產(chǎn)地羅布麻藥材具有一定的相似性。聚類分析將波數(shù)相似程度大的藥材聚為一類，結(jié)果與相關(guān)系數(shù)一致。共有峰率和變異峰率雙指標(biāo)序列法分別根據(jù)相似性和差異性兩個(gè)方面對(duì)各藥材間的關(guān)系進(jìn)行整體評(píng)價(jià)。紅外光譜相關(guān)系數(shù)分析、聚類分析和雙指標(biāo)序列分析結(jié)果相互補(bǔ)充和印證，可為今后新疆羅布麻藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)體系的建立提供參考。