PEAR1不同位點基因突變與雙重抗血小板治療病人預后的相關性分析

王藝臻，高 慧，賈 菲

阿司匹林和氯吡格雷雙重抗血小板治療常用于急性冠脈綜合征(acute coronary syndrome，ACS)或接受經皮冠狀動脈介入(percutaneous coronary intervention，PCI)治療的病人。抗血小板治療過程中的血小板聚集不同個體之間差異較大，未獲得抗血小板藥物治療的病人可能導致高治療血小板反應性(high on-treatment platelet reactivity，HPR)和不良臨床缺血事件，對血小板藥物反應過度導致低治療血小板反應性(low on-treatment platelet reactivity，LPR)和不良出血事件[1-2]。藥物反應導致遺傳變異性，因此，基因測試可識別攜帶某些可改變血小板反應性個體化基因(多態(tài)性)病人并指導個性化治療。增加藥物劑量或改用替卡格雷或普拉格雷的抗血小板新藥治療LRP是可行的[3-4]。

血小板內皮聚集受體-1(platelet endothelial aggregation receptor-1，PEAR1)是一種通過血小板與血小板接觸和受體激動劑激活的血小板跨膜蛋白。通過激活的PEAR1依賴GPⅡb/Ⅲa功能傳遞信號，穩(wěn)定血小板凝血酶[5-7]。臨床研究顯示，阿司匹林治療期間PEAR1基因變異是血小板反應性的決定因素[8-9]。分析環(huán)氧化酶1/血栓素A2通路被阿司匹林充分抑制，最大聚合的發(fā)生可能依賴于其他信號通路，如PEAR1血小板和血小板的相互作用通路對血小板聚集有影響。病人PEAR1基因突變對采用阿司匹林和氯吡雙重抗血小板治療二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)誘導血小板聚集的影響較少。本研究旨在分析PEAR1不同位點基因突變與雙重抗血小板治療病人預后的相關性，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年10月—2019年10月我院收治的冠心病病人612例，所有病人均接受PCI治療，同時給予阿司匹林和氯吡格雷雙重抗血小板治療。采用血栓彈性成像法測定血小板聚集，并測定血小板聚集抑制率(IPA)，其中IPA<30%的307例病人作為高治療血小板反應性組(HRP組)，另外IPA>70%的305例病人作為低治療血小板反應性組(LRP組)。本研究經醫(yī)學倫理學會批準，且所有病人均知情同意。所有病人PCI術前均接受300 mg阿司匹林和300 mg氯吡格雷治療，之后1年內口服氯吡格雷每日75 mg，并終身口服阿司匹林每日100 mg。

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準 年齡≥50歲；確診為冠心??；臨床資料齊全。

1.2.2 排除標準 年齡<50歲；血小板功能檢測結果不全；血小板計數(shù)<100×109/L或>300×109/L；血流動力學不穩(wěn)定；1年內主動出血或有出血事件；出血傾向；口服血小板抗凝藥劑等。

1.3 血小板功能 PCI術后12～36 h，抽取病人空腹靜脈血于兩個真空管中，其中1個真空管中含3.2%檸檬酸三鈉抗凝劑，而另1個含鋰肝素抗凝劑，真空管顛倒混勻3～5次與抗凝血劑充分混合。采用血小板成像法測定ADP誘導的血小板聚集[11]，采用TEG止血分析儀(Haemonetics Corp，Braintree，MA)和自動化分析軟件測量，計算IPA：IPA=100%-100%×[(MAADP×MAFIBRIN)/(MATHROMBIN-MAFIBRIN)]；其中MAADP是ADP誘導聚集強度(抗血小板藥物效應的測量)，MAFIBRIN是纖維誘導聚集強度，MATHROMBIN是凝血酶誘導最大聚集強度。

1.4 基因分析 采用HapMap(http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/)選擇16個PEAR1的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)進行分析[12]。HapMap的選擇包括次等位基因頻率(minor allele frequency，MAF)>0.05和連鎖不平衡(linkage disequilibrium，LD)測定r2閾值為0.8。并采用SHEsis(http://analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php)軟件進行單體型分析。抽取病人4 mL血樣并貯存于含有乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝真空管中。根據(jù)鹽析法提取全血樣本基因組DNA。選擇PEAR1的SNPS采用改良多重連接酶檢測反應(improved multiple ligase detection reaction，imLDR)進行基因分型(上海捷斯基生物科技有限公司)測定。同時采用隨機重復樣本(n=17)和DNA測序進行重復基因分型。

2 結 果

2.1 兩組臨床資料比較(見表1)

表1 兩組臨床資料比較

2.2 兩組PEAR1基因型分布 兩組16個PEAR1的SNPs頻率和Hardy-Weinberg平衡檢驗是一致的。17個隨機重復基因型的符合率和16個SNPs評估的覆蓋率分別為100.00%和99.29%，HPR組和LPR組5個SNPs分布不同。HRP組rs11264580次要等位基因C、rs2644592次要等位基因G、rs3737224次要等位基因T和rs41273215次要等位基因T頻率高于LPR組(P<0.05)。LPR組rs57731889純合TT基因型頻率高于HPR組(P<0.05)。單因素分析顯示：所有的SNPs中，rs11264580、rs2644592、rs3737224和rs41273215與HPR相關，rs57731889與LPR相關。詳見表2。

表2 兩組PEAR1基因型分布 單位：例(%)

2.3 PEAR1的SNPs與血小板反應性的影響因素Logistic回歸分析 以病人是否發(fā)生高血小板聚集作為因變量，以REAR1的16個SNPs基因型及病人一般資料作為自變量。將單因素分析中發(fā)現(xiàn)的PEAR1的5個SNPs進行多因素Logistic回歸分析，進一步確定SNPs與血小板反應性的相關性?；貧w模型校正了可能影響血小板功能的潛在混雜因素，如年齡、性別、血小板計數(shù)、紅細胞計數(shù)和危險因素等。結果顯示，rs41273215位點次要等位基因T與HPR獨立相關，rs57731889純合子TT基因型與LPR獨立相關。詳見表3。

表3 PEAR1的SNPs與血小板反應性的影響因素Logistic回歸分析

2.4 PEAR1的SNPs與血小板反應性的單倍型相關性分析 對5個SNPs(rs11264580、rs2644592、rs3737224、rs41273215、rs57731889)進行單倍型分析，結果表明，5個SNPs單倍型分析中的結合產生8個單倍型。8個單倍型中，CGTTC表達與HPR相關，單倍型TACCT與LPR相關。詳見表4。

表4 PEAR1的SNPs與血小板反應性的單倍型相關性分析 單位：例(%)

3 討 論

PEAR1是一種影響血小板聚集和內皮功能的血小板跨膜蛋白，且PEAR1基因遺傳變異可能影響血小板抗血小板治療前后反應性，并可能發(fā)生心血管事件。本研究采用阿司匹林和氯吡格雷對冠心病病人進行ADP誘導血小板聚集，分析其與PEAP1基因的SNPs的相關性。通過單變量分析揭示了次要等位基因C為rs11264580，次要等位基因G為rs2644592，次要等位基因T為rs3737224，次要等位基因T為rs41273215，且單倍型C-G-T-T-C與HPR相關，而rs57731889基因型TT和單倍型T-A-C-C-T與LPR相關。進一步采用多元回歸模型對混雜因素進行校正分析，發(fā)現(xiàn)rs41273215是HPR的獨立預測因素，rs57731889是LPR的獨立預測因子。

有研究表明，病人通過口服新型抗血小板藥物普拉格雷引起血小板聚集，且發(fā)現(xiàn)PEAR1的SNPs中rs11264580、rs3737224和rs41273215與普拉格雷引起的血小板聚集增加有關[13-14]，與本研究結果一致。有研究顯示，rs3737224和rs41273215對血小板聚集的重要性[15]。

本研究證實了rs57731889純合TT基因型與血小板低反應性相關。有研究表明，PEAR1中rs12041331次要等位基因A與膠原誘導的血小板聚集減少存在相關性[16-17]，rs12041331次要等位基因A與氯吡格雷誘導低膠原刺激血小板聚集有關[18]。本研究結果顯示，rs12041331次要等位基因A與ADP誘導的血小板聚集減少無相關性(P>0.05)，分析可能是由于不同的激動劑可刺激血小板，提示不同的藥物作用途徑不同，結論可能存在差異，說明rs12041331的血小板聚集可能是通過膠原介導的受體途徑，而不是依賴ADP途徑。與以往研究不同，其他幾個SNPs在本研究中得到證實，這些基因包括位于PEAR1基因啟動子區(qū)SNP的rs2768759等位基因C，rs11264579次要等位基因T和rs56260937(C/T)的同義變體。有研究顯示，SNP的rs2768759等位基因C與血小板聚集增加有關，不論是ADP、膠原蛋白或腎上腺素激動劑還是阿司匹林治療[8]。另有研究發(fā)現(xiàn)，通過ADP刺激，rs11264579次要等位基因T與高纖維蛋白原結合和P選擇素表達相關[12]，且rs56260937(C/T)的同義變異在血小板聚集中發(fā)揮著重要作用。本研究涉及的SNPs與血小板反應性相關性無統(tǒng)計學意義，分析可能是由于研究人群、臨床因素、環(huán)境因素及檢測血小板功能方法存在差異導致的。

有研究分析PEAR1多態(tài)性和臨床結果的關系，認為提高血小板功能的遺傳變異可能增加冠心病病人死亡、心肌梗死和腦卒中風險[12]，病人接受阿司匹林和氯吡格雷雙重抗血小板治療后，與GG純合子相比，rs12041331等位基因A攜帶者更易發(fā)生心血管事件或死亡；單獨阿司匹林治療，rs12041331等位基因A攜帶者相較于GG純合子，可能增加心肌梗死風險[19]。因此，PEAR1基因多態(tài)性對臨床的影響需進一步深入研究，可能需要大樣本研究證實臨床結論，通過PEAR1基因檢測進行個體化治療，從而改善病人預后，且PEAR1可能是潛在的抗血栓治療靶點藥物。

綜上所述，與血小板相關的SNPs中rs2644592、rs41273215、rs57731889為反應性位點，分別位于PEAR1基因的4，15，16內含子區(qū)域。rs11264580和rs3737224分別位于外顯子區(qū)10和12，但為同義突變。推測這些內含子或啟動子變異可能為轉錄因子的結合位點，這些轉錄因子可能通過攜帶增強子元件和選擇性剪接位點上調基因表達。因此，PEAR1基因在不同位點變化對血小板反應活性影響存在差異，今后需進一步研究揭示PEAR1基因突變、基因表達及血小板之間的相互作用機制。