復蘇液體種類及時機對脂多糖誘導的膿毒癥家兔心肺損傷的影響

程 靜，王海莉，郭 焱

膿毒癥是指由多種病原微生物及其產(chǎn)物(毒素)作用于機體導致臟器功能受累的一類疾病，即嚴重感染引起臟器功能受損甚至衰竭。急性肺功能衰竭和膿毒性心肌病是膿毒癥及膿毒性休克常見的并發(fā)癥，直接影響膿毒癥病人預后[1]。急性肺功能衰竭早期表現(xiàn)為急性肺損傷，病理變化為肺組織中性粒細胞聚集、水腫及組織纖維化[1]。盡管眾多研究者采用不同的治療方法控制膿毒癥病人急性肺損傷和心肌受累，病人死亡率仍居高不下。目前，針對急性肺損傷和膿毒性心肌病多采用對癥支持治療，療效欠佳，急需有效的治療方案改善癥狀[2-3]?？茖W的液體管理對膿毒癥病人預后有重要影響，危重病醫(yī)學實踐中，關于液體管理策略存在爭議[4]。

動物實驗，高滲鹽水(hypertonic saline，HS)復蘇的效果較好[5-6]。既往研究表明，HS可降低膿毒癥小鼠內(nèi)毒素血癥導致的炎癥反應及肺纖維化程度[7]。雖然HS復蘇在控制炎癥過程和降低實驗模型死亡率方面有好處，但臨床實踐尚未得到證實。相關研究表明，通過HS與生理鹽水(normal saline，NS)治療創(chuàng)傷的病人28 d后生存期無明顯改善[8]。有研究顯示，盡管HS復蘇未明顯降低死亡率，但其降低了多器官衰竭的發(fā)生率并改善了血流動力學指標[9]。臨床研究未得到滿意效果的原因，可能與使用HS治療時體內(nèi)白細胞活化有關，亦有研究表明，HS復蘇可直接調(diào)節(jié)體內(nèi)多形核白細胞的功能，多形核白細胞的調(diào)節(jié)及炎癥和組織損傷的預防需在疾病發(fā)作后立即進行充分的液體復蘇[10]。

盡管明確了早期液體復蘇的重要性，臨床實踐中較難在早期采用這種措施治療。實驗研究中，通常在注射脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)或盲腸結扎和穿刺術后15 min使用HS。本研究建立細菌性LPS誘導的急性肺損傷家兔模型后，觀察不同復蘇液、早期與晚期液體復蘇對心肺損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 100只健康雄性新西蘭白兔，3～4月齡，體質(zhì)量2.0～2.6 kg，由山西醫(yī)科大學動物實驗中心提供，動物健康且符合國家實驗動物健康標準。所有動物實驗均通過山西醫(yī)科大學動物實驗倫理委員會審查。

1.2 實驗分組及動物處理 實驗過程中，使用氯胺酮(100 mg/kg)和甲苯噻嗪(5 mg/kg)混合物(腹腔內(nèi))麻醉動物。100只雄性新西蘭白兔經(jīng)腹腔注射LPS后分為兩部分，一部分家兔模型中，50只用于生存率研究(每組10只)；一部分家兔模型中，50只動物用于測定心肺功能及多種細胞因子表達(每組10只)。每部分家兔模型隨機分為5組，脂多糖感染組(LPS組)：通過單次腹腔注射LPS(10 mg/kg)誘導；早期高滲鹽水治療組(HS15組)：腹腔注射LPS并采用HS處理，4 mL/kg(靜脈注射)，注射LPS后15 min；早期生理鹽水治療組(NS15組)：腹腔注射LPS并采用NS處理，34 mL/kg(靜脈注射)，注射LPS后15 min；晚期高滲鹽水治療組(HS90組)：腹腔注射LPS并采用HS處理，4 mL/kg(靜脈注射)，LPS注射后90 min；晚期生理鹽水治療組(NS90組)：腹腔注射LPS并采用NS處理，34 mL/kg(靜脈注射)，LPS注射后90 min。本研究LPS劑量(10 mg/kg體重)可引起敗血癥和急性器官損傷。LPS注射后90 min，炎癥過程已確定。膿毒癥治療指南(Surviving Sepsis Campaign，SSC)要求在發(fā)病后90 min內(nèi)進行液體復蘇，因此將發(fā)病15 min作為早期復蘇時間點，發(fā)病90 min作為晚期液體復蘇時間點。HS和NS在兩種治療中的輸注時間相同。LPS誘導急性肺損傷和心肌損傷后24 h采集右肺和右心室進行組織學分析，采集左肺和左心室并冷凍，進行細胞因子定量、實時聚合酶鏈反應(PCR)測量并分析。

1.3 實驗試劑與儀器 TRIzol試劑購自上海碧云天生物技術有限公司，PrimeScriptTMRT reagent Kit和SYBRTMPremix Ex TapTM均購自日本TaKaRa公司。DW-3000型小動物呼吸機購自上海寰熙醫(yī)療器械有限公司。腫瘤壞死因子α(TNF-α)、轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)和白細胞介素10(IL-10)檢測試劑盒均購自上海酶聯(lián)生物公司，Nano-500型分光光度計購自北京原平皓生物技術有限公司，PCR儀購自美國MyCycler公司，所有引物均由北京奧克鼎盛生物公司合成。

1.4 方法

1.4.1 生存率 按1.2所述進行內(nèi)毒素誘導的心肺損傷和治療，并分析72 h后各組生存率。LPS組、HS15組、NS15組、HS90組和NS90組均有10只家兔。麻醉恢復后，每12 h對動物進行1次監(jiān)測。通過注射CO2對家兔實施安樂死，生存率分析期為72 h后進行頸椎脫位。

1.4.2 細胞因子定量 根據(jù)試劑盒說明書，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定各組心、肺組織樣本TNF-α、TGF-β和IL-10水平。總蛋白濃度通過Bradford蛋白分析儀進行測量。對標準品進行倍比稀釋，檢測各標準品吸光度，繪制標準曲線，根據(jù)標準曲線計算細胞因子濃度，并以pg/mg總蛋白表示。

1.4.3 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR) 通過qRT-PCR分別檢測各組家兔心、肺組織熱休克蛋白47(heat shock protein 47，HSP47)、熱休克蛋白90(HSP90)和熱休克蛋白70(HSP70)mRNA表達。采用TRIzol提取組織樣本的總RNA，使用NANOVUE分光光度計測定RNA樣品的濃度。根據(jù)cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照TaKaRa的熒光實時定量PCR試劑盒說明書配備反應體系，每個樣品設3個復孔進行qRT-PCR檢測。按照預變性95 ℃、3 min，變性95 ℃、15 s，退火與延伸60 ℃、30 s，共40個循環(huán)進行擴增。以循環(huán)閾值(Ct值)作為統(tǒng)計參數(shù)，測定的數(shù)據(jù)為目的Ct值與內(nèi)參Ct值(GAPDH為內(nèi)參)，數(shù)據(jù)結果采用2-△△Ct(Livak法)進行處理分析，引物序列見表1。

表1 引物序列

2 結 果

2.1 各組家兔生存率比較 經(jīng)LPS誘導后的家兔出現(xiàn)心肺功能衰竭，導致死亡，統(tǒng)計LPS誘導72 h后各組家兔生存情況。LPS組5只死亡，存活率為(50.0%)，HS15組家兔全部存活，HS90組4只死亡，NS15組3只死亡，NS90組3只死亡。詳見圖1。

圖1 各組家兔存活數(shù)量比較

2.2 各組心肺組織細胞因子含量比較 膿毒癥發(fā)作24 h后評估早期和晚期HS和NS治療對心、肺組織細胞因子濃度的影響。與LPS組、HS15組和NS15組比較，HS90組、NS90組TNF-α升高(P<0.05)。與LPS組、HS15組和NS15組比較，HS90組、NS90組IL-10降低(P<0.05)。詳見圖2。

圖2 各組心肺組織細胞因子含量比較(A為TNF-α；B為IL-10)

2.3 各組心肺組織HSP70和HSP90 mRNA表達比較 熱休克蛋白(HSP)作為免疫反應的調(diào)節(jié)劑發(fā)揮著重要作用。與NS15組、HS90組和NS90組比較，HS15組HSP70 mRNA表達升高(P<0.05)。與NS15組、HS90組和NS90組比較，HS15組HSP90 mRNA表達升高(P<0.05)。詳見圖3。

圖3 各組心肺組織HSP70和HSP90 mRNA表達比較(A為HSP70 mRNA；B為HSP90 mRNA)

2.4 各組心肺組織TGF-β蛋白和HSP47 mRNA表達比較 心肺損傷及其組織修復發(fā)生在LPS誘導的急性肺損傷早期，TGF-β在這一修復過程中發(fā)揮著重要作用。ELISA結果顯示，與NS15組和NS90組比較，HS15組TGF-β表達降低(P<0.05)。qRT-PCR結果顯示，與LPS組比較，HS15組HSP47 mRNA表達降低(P<0.05)。詳見圖4。

圖4 各組心肺組織TGF-β蛋白和HSP47 mRNA表達比較(A為TGF-β蛋白；B為HSP47 mRNA)

3 討 論

心和肺是膿毒癥及膿毒性休克病人最易受累的靶器官[1]?？茖W積極補液是危重病人治療的重要手段，處理不善導致心肺功能惡化，并嚴重影響病人預后。維持有效滲透壓，減少液體容積的有效替代方法是使用高滲溶液或膠體溶液，其對病人預后的影響尚不明確。有研究顯示，早期使用HS治療心肺損傷有效[11]，但后期使用HS進行液體復蘇治療膿毒癥性急性肺損傷和膿毒性心肌受損療效尚不明確。本研究結果表明，早期HS治療改善家兔心肺損傷，降低了死亡率。晚期HS和NS在膿毒癥誘導的心肺損傷及死亡率方面均無改善。

目前，一種常用的動物模型提供了關于急性肺損傷發(fā)病機制的重要信息，即腹腔注射細菌LPS引起的內(nèi)毒素血癥。LPS誘導的急性肺損傷及膿毒性心肌病，由于炎性因子作用于器官小血管，引起毛細血管內(nèi)皮受損，滲漏造成器官組織水腫，進而器官功能下降。急性肺損傷表現(xiàn)為肺順應性降低及肺阻力升高的呼吸動力學改變有關[12]。膿毒性心肌病造成心肌彌漫性收縮力下降，甚至造成休克。與膿毒癥、多臟衰病人相似，造模的家兔中，觀察到肺功能和心功能下降。早期采用HS液體復蘇通過提高晶體滲透壓，增加有效血容量，提高血壓，減輕組織水腫，進而改善臟器功能。對晚期液體復蘇來說，由于已造成器官組織腫脹，功能受累甚至細胞壞死，無論采用何種液體改善療效均不明顯。本研究與既往研究[13]結果一致，表明急性肺損傷和膿毒性心肌病病人早期恰當?shù)囊后w管理可影響預后，改善心肺功能，降低死亡率。

大量炎癥介質(zhì)在LPS誘導的心肺損傷發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。這些細胞因子表達的最大量發(fā)生在LPS誘導的膿毒癥早期[14]，即注射LPS后1.5～6.0 h，心肺損傷預防需要在LPS誘導的膿毒癥臟器受累模型早期進行干預，包括充分的液體復蘇。本研究結果表明，產(chǎn)生炎癥介質(zhì)之前，HS早期液體復蘇在控制炎癥方面具有重要作用。炎癥發(fā)生后，不管采用何種液體均無效，原因可能是由于細胞因子釋放和炎癥狀態(tài)增加所致。肺部炎癥期間，熱休克蛋白的一過性產(chǎn)生與調(diào)節(jié)肺損傷有關。HSP70作為一種具有修復作用的蛋白分子，在抗炎過程中發(fā)揮著重要的作用[15]。本研究觀察到HS早期液體復蘇增加了HSP70表達。晚期液體復蘇時，HSP70表達無明顯改變。表明晚期液體復蘇的動物體內(nèi)炎癥反應已增加。

LPS誘導的心肺損傷表現(xiàn)為心和肺成纖維細胞增殖和膠原分泌，兩種現(xiàn)象在發(fā)病早期均可觀察到，可能與心肺順應性降低有關[16]。有研究顯示，膿毒性休克中，Ⅲ型膠原(維持肺彈性)可能被Ⅰ型膠原(肺纖維化的標志)取代，解釋了心和肺功能衰竭程度[17]。成纖維細胞合成膠原時需要細胞因子、生長因子和其他生物活性分子參與[18]。相關研究顯示，TGF-β在炎癥修復過程中控制細胞增殖和細胞外基質(zhì)的轉(zhuǎn)換中發(fā)揮著重要作用[19]。本研究結果顯示，HS15組肺組織TGF-β表達均低于其他組。膠原蛋白合成的另一個重要因素是HSP47，HSP47分子是膠原蛋白合成過程中特異性分子伴侶，與LPS誘導的家兔心肺Ⅰ型膠原表達增加相關[20]。本研究結果顯示，HS15組HSP47降低，晚期液體復蘇均無明顯改善。

綜上所述， HS進行早期液體復蘇后多種炎性因子含量或活性均降低，即早期液體復蘇可減輕LPS誘導的膿毒癥動物心肺損傷，晚期液體復蘇無論使用哪種液體均不理想。上述結果表明HS在疾病治療早期有效，且隨著時間延長相關作用逐漸喪失，LPS誘導的急性肺損傷和膿毒性心肌病模型中，晚期液體復蘇可能加重心肺組織炎癥和組織損傷。HS有效復蘇的治療窗口期較短，即在發(fā)病后15 min，這是臨床使用HS的一個重要限制，關于HS液體復蘇療效有待進一步研究明確。