丹參酮ⅡA對心力衰竭大鼠心室重構(gòu)和PI3K/Akt信號通路的影響

宋媛媛，史朋曉，閆洪娟

心力衰竭是多種心血管疾病的終末期，對人類健康造成嚴重威脅。心肌重構(gòu)是心力衰竭發(fā)病率和死亡率的主要決定因素，是心力衰竭進展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前心力衰竭的主要治療方法包括控制心力衰竭危險因素、藥物治療、介入治療和心臟移植等，上述方法均可改善病人臨床癥狀，延緩心力衰竭進展，但這些方法無法從根本上改善心肌重構(gòu)，防止心力衰竭發(fā)生。丹參酮ⅡA是一種從丹參中提取的脂溶性化合物，具有抑菌作用[1]，臨床廣泛用于治療心血管疾病，可減輕心肌缺血，預(yù)防心絞痛，改善冠狀動脈循環(huán)，抗動脈粥樣硬化，抑制心肌肥厚等[2]。丹參酮ⅡA具有抑制心力衰竭病人心臟重構(gòu)的作用，崔振川等[3]研究顯示，丹參酮ⅡA可改善慢性心力衰竭病人血流動力學(xué)和心肌酶譜，通過抑制心室重構(gòu)改善病人心功能；同時崔振川等[4]研究顯示，丹參酮ⅡA治療可降低左室舒張末期內(nèi)徑、室間隔厚度、左室后壁厚度、左室心肌質(zhì)量指數(shù)等，通過抑制心肌重構(gòu)發(fā)揮對心力衰竭病人的治療作用。丹參酮ⅡA改善心力衰竭心室重構(gòu)的作用已被證實，但具體機制尚未明確。相關(guān)研究顯示，磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號通路激活在心力衰竭心室重構(gòu)中發(fā)揮著重要作用[5-6]。本研究觀察丹參酮ⅡA對心力衰竭大鼠心室重構(gòu)和PI3K/Akt信號通路的影響，探討丹參酮ⅡA抑制心力衰竭心室重構(gòu)的可能機制，從動物實驗水平探討丹參酮ⅡA對心力衰竭心室重構(gòu)的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑和儀器 丹參酮ⅡA(中國北京華夏遠洋科技)，鹽酸異丙腎上腺素注射液(中國上海禾豐制藥)，酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(美國Sigma公司)，蘇木精-伊紅(HE)染色和Masson染色試劑盒(中國華美公司)，兔抗鼠Ⅰ型膠原(Col Ⅰ)多克隆抗體、兔抗鼠Ⅲ型膠原(Col Ⅲ)多克隆抗體、兔抗鼠磷酸化PI3K(p-PI3K)多克隆抗體、兔抗鼠p-PI3K多克隆抗體、兔抗鼠Akt多克隆抗體、兔抗鼠磷酸化Akt(p-Akt)多克隆抗體；VIVID E9多普勒彩色超聲(美國GE公司)等。

1.2 實驗動物和分組 健康雄性清潔級Wistar大鼠購自河北省實驗動物中心[許可證號：SCVK(冀)2014-0015]。將48只Wistar大鼠采用隨機數(shù)字表法分為正常對照組(A組)、模型組(B組)和丹參酮ⅡA治療組(C組)，各16只大鼠。

1.3 心力衰竭模型制備 B組和C組大鼠每日同時間皮下注射異丙腎上腺素[5 mg/(kg·d)]，連續(xù)7 d，建立心力衰竭大鼠模型[7]；A組每日同時間皮下注射等量生理鹽水。建模成功標(biāo)準(zhǔn)為左室射血分數(shù)下降5%、左室收縮末期內(nèi)徑和左室舒張末期內(nèi)徑均增大[7]。對建模不成功的大鼠，另取大鼠采用同樣建模方法建模作為補充。

1.4 動物處理 從建模后次日開始進行干預(yù)，C組大鼠每日上午同時間腹腔注射丹參酮ⅡA[15 mg/(kg·d)][8]；A組和B組大鼠每日上午同時間注射等量生理鹽水。共干預(yù)28 d。

1.5 ELISA法測定血清血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)、腦鈉肽(BNP)水平 藥物干預(yù)28 d后，抽取大鼠外周血，分離血清，采用ELISA法測定血清AngⅡ、BNP水平。

1.6 心室重構(gòu)參數(shù)測定 取大鼠外周血，稱取大鼠體質(zhì)量，經(jīng)靜脈注射10%的氯化鉀3 mL使心臟停止搏動，快速打開胸腔，取出大鼠心臟，用冰生理鹽水沖洗，剪去大血管、心房、心臟外結(jié)締組織等，沿心臟室間隔剪去右心室。稱取左室質(zhì)量(LVM)，計算左室質(zhì)量指數(shù)(LVMI)，LVMI=LVM/體質(zhì)量。測量左心室短軸長度(D)和左心室長軸長度(L)，計算球型指數(shù)(SI)，SI=L/D。

1.7 標(biāo)本處理 測量心室重構(gòu)參數(shù)后，將左心室分為兩部分，一部分置于甲醇溶液中固定、石蠟包埋，用于HE和Masson染色；另一部分左心室制作組織勻漿，用于免疫印跡法測定。

1.8 心臟組織HE染色 取各組大鼠心臟組織石蠟切片，常規(guī)脫蠟水化，蘇木素染色5 min，鹽酸乙醇分化30 s，氨水返藍2 min，伊紅染色2 min，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.9 心臟組織Masson染色 取各組大鼠心臟組織石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水，采用Weigert氏鐵蘇木素染色5 min，1%鹽酸乙醇分化數(shù)秒，麗春紅酸性品紅液染色5 min，1%磷淚酸水溶液處理5 min，1%冰醋酸浸泡1 min，二甲苯透明，中性樹膠封片。采用Image-Pro Plus軟件測量膠原面積，計算膠原容積比，膠原容積比=膠原面積/總面積×100%。

1.10 免疫印跡法測定心肌組織Col Ⅰ、Col Ⅲ、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白水平 各組大鼠心肌組織在液氮保護下裂解，提取總蛋白，上樣緩沖液和蛋白樣本混合、變性，每孔60 μg加入凝膠中電泳，轉(zhuǎn)膜3 h，加入脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗：兔抗鼠Col Ⅰ多克隆抗體(1∶200)，兔抗鼠Col Ⅲ多克隆抗體(1∶300)，兔抗鼠PI3K多克隆抗體(1∶200)，兔抗鼠p-PI3K多克隆抗體(1∶300)，兔抗鼠Akt多克隆抗體(1∶200)，兔抗鼠p-Akt多克隆抗體(1∶200)，過夜孵育，加入二抗(1∶5 000)孵育1 h，電化學(xué)發(fā)光(ECL)。以β-actin為內(nèi)參，采用Quantity One圖像分析系統(tǒng)測定灰度值，目標(biāo)蛋白=目標(biāo)蛋白條帶灰度值/β-actin蛋白條帶灰度值。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血清AngⅡ、BNP水平比較 與A組比較，B組大鼠血清AngⅡ、BNP水平升高(P<0.05)；與B組比較，C組大鼠血清AngⅡ、BNP水平降低(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠血清AngⅡ、BNP水平比較(±s) 單位：pg/mL

2.2 丹參酮ⅡA對大鼠心肌組織影響的HE染色結(jié)果 A組大鼠心肌細胞形態(tài)正常，纖維排列整齊；B組大鼠心肌細胞壞死，間隙增大伴水腫，壞死區(qū)心肌纖維化，并有炎性細胞浸潤；C組大鼠心肌細胞壞死程度、心肌纖維化及重構(gòu)程度較B組減輕。詳見圖1。

圖1 各組大鼠心肌組織HE染色圖(×200)

2.3 丹參酮ⅡA對心肌組織影響的Masson染色及膠原容積比 A組大鼠心肌組織纖維排列規(guī)則，僅有少量膠原纖維增生；B組大鼠心肌細胞大量壞死，被膠原纖維替代，心肌纖維化明顯，殘留心肌細胞排列紊亂；C組大鼠心肌纖維化較B組減輕。詳見圖2。與A組比較，B組大鼠心肌膠原容積比增加(P<0.05)；與B組比較，C組大鼠心肌膠原容積比降低(P<0.05)。詳見表2。

圖2 各組大鼠心肌組織Masson染色圖(×200)

表2 各組大鼠心臟膠原容積比比較(±s) 單位：%

2.4 各組大鼠心室重構(gòu)指標(biāo)比較 與A組比較，B組LVMI、LVM升高，SI降低(P<0.05)；與B組比較，C組LVMI、LVM降低，SI升高(P<0.05)。詳見表3。

表3 各組大鼠心室重構(gòu)指標(biāo)比較(±s)

2.5 各組大鼠心肌組織Col Ⅰ、Col Ⅲ蛋白含量比較 與A組比較，B組心肌組織Col Ⅰ、Col Ⅲ蛋白含量升高(P<0.05)；與B組比較，C組心肌組織Col Ⅰ、Col Ⅲ蛋白含量降低(P<0.05)。詳見表4、圖3。

表4 各組大鼠心肌組織Col Ⅰ、Col Ⅲ蛋白含量比較(±s)

圖3 各組大鼠心肌組織Col Ⅰ、Col Ⅲ蛋白條帶圖

2.6 各組大鼠心肌組織PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白含量比較 各組大鼠心肌組織PI3K、Akt蛋白含量比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。各組大鼠心肌組織p-PI3K、p-Akt蛋白含量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，與A組比較，B組心肌組織p-PI3K、p-Akt蛋白含量升高(P<0.05)；與B組比較，C組心肌組織p-PI3K、p-Akt蛋白含量降低(P<0.05)。詳見表5、圖4。

表5 各組大鼠心肌組織PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白含量比較(±s)

圖4 各組大鼠心肌組織PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白含量條帶圖

3 討 論

心力衰竭是各種心臟病的嚴重階段，心肌肥厚是心力衰竭的主要病理基礎(chǔ)，是疾病進展的指示信號，主要表現(xiàn)為心室重構(gòu)。心室重構(gòu)是在心肌缺血、心肌梗死、炎癥等因素作用下導(dǎo)致的心肌功能和結(jié)構(gòu)改變，包括心肌間質(zhì)纖維化和心肌細胞肥大，心肌間質(zhì)纖維化和心肌細胞肥大是心功能下降的代償性反應(yīng)，出現(xiàn)失代償時發(fā)生心力衰竭。故臨床上提前控制心室重構(gòu)可預(yù)防心肌肥厚向心力衰竭的轉(zhuǎn)變。

本研究采用注射異丙腎上腺素建立心力衰竭大鼠模型，結(jié)果顯示：模型組大鼠血清AngⅡ、BNP水平升高；LVMI、LVM升高，SI降低；心肌組織Col Ⅰ、Col Ⅲ蛋白水平升高，HE染色和Masson染色結(jié)果均顯示模型組大鼠出現(xiàn)心肌纖維化和心室重構(gòu)。血清AngⅡ、BNP水平升高是臨床診斷心力衰竭的標(biāo)志物[9]，也可評估大鼠心力衰竭。Col Ⅰ、Col Ⅲ過表達后在心肌組織中累積是造成心肌纖維化的原因之一，兩者水平升高程度可反映心肌纖維化情況[10]。LVMI、LVM、SI為常用的心室重構(gòu)指標(biāo)[11]，LVMI、LVM升高，SI降低，表明存在心室重構(gòu)。本研究結(jié)果表明，心力衰竭大鼠建模成功，存在心室重構(gòu)。

丹參為我國的傳統(tǒng)中藥，具有益氣、行氣、養(yǎng)血、活血等作用，含有多種脂溶性和水溶性成分[12-13]。丹參酮ⅡA為丹參脂溶性成分的代表，具有改善微循環(huán)、擴張血管等作用[14-15]。臨床上，丹參酮ⅡA治療心血管疾病具有較好的療效[16]。有研究顯示，丹參酮ⅡA對自發(fā)性高血壓大鼠心臟肥大具有保護作用[17]。本研究對心力衰竭大鼠給予丹參酮ⅡA治療，結(jié)果顯示：治療后，大鼠血清AngⅡ、BNP水平降低；LVMI、LVM降低，SI升高；心肌組織Col Ⅰ、Col Ⅲ蛋白水平降低，HE染色和Masson染色結(jié)果均顯示治療后大鼠心肌纖維化和心室重構(gòu)明顯減輕。從動物實驗研究發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA可抑制心力衰竭大鼠心室重構(gòu)。丹參酮ⅡA對心力衰竭大鼠心室重構(gòu)的抑制作用已被證實。馮俊等[18]研究顯示，丹參酮ⅡA可抑制Galectin-3蛋白表達和缺血性心力衰竭大鼠心肌纖維化；結(jié)合本研究結(jié)果可知：丹參酮ⅡA可能通過抑制Galectin-3蛋白表達等降低心肌組織Col Ⅰ、Col Ⅲ蛋白含量，從而抑制心肌纖維化，發(fā)揮對心室重構(gòu)的抑制作用。丹參酮ⅡA通過何種機制發(fā)揮對心肌纖維化及心室重構(gòu)的抑制作用尚未明確。

本研究從PI3K/Akt信號通路探討丹參酮ⅡA抑制心力衰竭大鼠心室重構(gòu)的可能機制。結(jié)果顯示：心力衰竭模型組大鼠心肌組織p-PI3K、p-Akt蛋白水平升高；與心力衰竭大鼠比較，丹參酮ⅡA治療組心力衰竭大鼠心肌組織p-PI3K、p-Akt蛋白水平降低。PI3K為細胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，是多種生命活動的關(guān)鍵分子，p-PI3K具有活性；Akt為PI3K下游信號分子，活化的PI3K可作用于Akt，導(dǎo)致Akt磷酸化，p-Akt具有活性，參與多種病理生理過程。心室重構(gòu)是心肌細胞的一種代償性反應(yīng)，相關(guān)研究顯示，PI3K/Akt信號通路在心室重構(gòu)中發(fā)揮著重要作用，PI3K/Akt信號通路的激活，可促進纖維細胞活力，從而引起心肌纖維化，抑制PI3K/Akt信號通路激活可緩解心肌細胞纖維化，從而阻止心室重構(gòu)發(fā)生[19-20]。丹參酮ⅡA在多種疾病中通過PI3K/Akt信號通路發(fā)揮作用：丹參酮ⅡA可下調(diào)PI3K/Akt通路誘導(dǎo)急性單核細胞白血病的凋亡和自噬[21]；通過PI3K/Akt信號通路逆轉(zhuǎn)HepG2細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[22]；通過減弱PI3K/Akt信號通路誘導(dǎo)卵巢癌細胞凋亡[23]；通過下調(diào)PI3K/Akt信號通路抑制非小細胞肺癌發(fā)生發(fā)展[24]。上述研究表明：PI3K/Akt信號通路參與心肌重構(gòu)過程，激活PI3K/Akt信號通路，可促進心肌纖維化和心室重構(gòu)發(fā)生，抑制PI3K/Akt信號通路可抑制心室重構(gòu)。丹參酮ⅡA具有抑制PI3K/Akt信號通路的作用，在多種疾病中丹參酮ⅡA通過抑制PI3K/Akt信號通路激活發(fā)揮治療疾病的作用。本研究結(jié)果顯示，心力衰竭大鼠心肌組織p-PI3K、p-Akt蛋白水平升高，表明心力衰竭大鼠心肌組織PI3K/Akt信號通路激活；與心力衰竭大鼠比較，丹參酮ⅡA治療組心力衰竭大鼠心肌組織p-PI3K、p-Akt蛋白水平降低，表明丹參酮ⅡA通過抑制PI3K/Akt信號通路激活發(fā)揮治療作用。

綜上所述，丹參酮ⅡA對心力衰竭大鼠心室重構(gòu)保護作用的機制可能與丹參酮ⅡA抑制PI3K/Akt信號通路激活及心肌纖維化有關(guān)。