基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討侯氏黑散治療缺血性腦卒中的作用機(jī)制

烏凱迪，蔣希成，宋 瑩，王 振

缺血性腦卒中是由于腦動(dòng)脈長時(shí)間狹窄或堵塞造成該動(dòng)脈供血區(qū)域出現(xiàn)腦細(xì)胞壞死或細(xì)胞死亡的疾病，具有較高的致殘率、致死率，為中老年多發(fā)病[1-2]。臨床常見的腦功能障礙臨床表現(xiàn)為一側(cè)肢體麻木、偏癱、視物模糊、口舌歪斜、口角流涎、語言障礙、理解障礙等，嚴(yán)重時(shí)甚至導(dǎo)致昏迷。誘發(fā)缺血性腦卒中的原因較多，相關(guān)研究顯示，高血壓、吸煙、低高密度脂蛋白膽固醇、心臟病和飲酒等為缺血性腦卒中危險(xiǎn)因素[3]。侯氏黑散首見于《金匱要略·中風(fēng)歷節(jié)》記載，由菊花、白術(shù)、牡蠣、桔梗、防風(fēng)、細(xì)辛、茯苓、人參、礬石、黃芩、當(dāng)歸、干姜、川芎、桂枝14味中藥組成，現(xiàn)代醫(yī)家多用于治療短暫性腦缺血發(fā)作、眩暈、中風(fēng)、眼目病等[4]。侯氏黑散具有降低血壓、調(diào)節(jié)血脂的作用，為治療缺血性腦卒中奠定了基礎(chǔ)[5]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，運(yùn)用計(jì)算機(jī)模擬、數(shù)據(jù)分析、多種數(shù)據(jù)庫檢索等方法，通過多層次網(wǎng)絡(luò)闡明藥物的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制[6]，為藥物的現(xiàn)代化研究提供了新思路。本研究通過檢索相關(guān)數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建“藥物成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，探討侯氏黑散治療缺血性腦卒中的多成分、多靶點(diǎn)和多通路作用特點(diǎn)，為闡明其治療缺血性腦卒中機(jī)制提供了科學(xué)依據(jù)，為進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 侯氏黑散活性成分的挖掘與篩選 檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)侯氏黑散中的菊花、白術(shù)、細(xì)辛、茯苓、牡蠣、桔梗、防風(fēng)、人參、白礬、黃芩、當(dāng)歸、干姜、川芎、桂枝14味中藥，利用TCMSP得到的數(shù)據(jù)參數(shù)中口服生物利用度(OB)和類藥性(DL)對(duì)藥物成分進(jìn)行篩選，篩選出符合OB≥30%、DL≥0.18兩個(gè)條件的藥物活性成分。因牡蠣作為動(dòng)物類藥材的特殊性，故本研究未將其納入分析。

1.2 侯氏黑散活性成分作用靶點(diǎn)的收集 利用TCMSP收集侯氏黑散所有藥物活性成分的作用靶點(diǎn)，篩選作用于“人”的靶點(diǎn)，再利用UniProt數(shù)據(jù)庫找到作用靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的Gene Symbol[7]。

1.3 缺血性腦卒中疾病靶點(diǎn)的挖掘 在GeneCards數(shù)據(jù)庫中輸入關(guān)鍵詞“ischemic stroke”，得到缺血性腦卒中的相關(guān)靶基因。

1.4 侯氏黑散治療缺血性腦卒中的核心靶點(diǎn)篩選 運(yùn)用Venny 2.1.0在線工具進(jìn)行侯氏黑散活性成分靶點(diǎn)和缺血性腦卒中疾病靶點(diǎn)的映射并繪制韋恩圖，得到侯氏黑散治療缺血性腦卒中的相關(guān)靶點(diǎn)[8]。

1.5 活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及拓?fù)浞治?采用Cytoscape 3.6.1軟件構(gòu)建侯氏黑散藥物活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，該拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)中活性成分、作用靶點(diǎn)用節(jié)點(diǎn)表示，邊代表活性成分與靶點(diǎn)的相互作用關(guān)系。利用Cytoscape 3.6.1軟件工具中的“Analyzer”功能，分析網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，計(jì)算相關(guān)拓?fù)鋮?shù)。

1.6 構(gòu)建并分析蛋白-蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò) 將篩選得到的治療缺血性腦卒中的靶點(diǎn)蛋白以Gene Symbol上傳至STRING 11.0數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建PPI并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析[9]。

1.7 侯氏黑散治療缺血性腦卒中的靶點(diǎn)通路分析 將篩選的交集靶點(diǎn)信息利用DAVID 6.7進(jìn)行基因本體(GO)富集分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析，根據(jù)信號(hào)通路富集分析結(jié)果探討侯氏黑散治療缺血性腦卒中的潛在作用機(jī)制[10]。

2 結(jié) 果

2.1 侯氏黑散活性成分和作用靶點(diǎn)的篩選 通過TCMSP分析平臺(tái)檢索到侯氏黑散共1 930個(gè)化合物，篩選條件為OB≥30%、DL≥0.18，得到主要活性成分共155個(gè)，其中菊花20個(gè)，白術(shù)7個(gè)，細(xì)辛8個(gè)，茯苓15個(gè)，桔梗7個(gè)，防風(fēng)18個(gè)，人參22個(gè)，黃芩36個(gè)，當(dāng)歸2個(gè)，干姜5個(gè)，川芎7個(gè)，桂枝7個(gè)，白礬1個(gè)。按照OB值進(jìn)行排列，居前20位的活性成分見表1。采用TCMSP平臺(tái)對(duì)155個(gè)藥物活性成分進(jìn)行靶點(diǎn)檢索，共收集到靶點(diǎn)1 246個(gè)，經(jīng)過篩選去重后得到164個(gè)。

表1 藥物活性成分(居前20位)

2.2 侯氏黑散藥物活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及拓?fù)浞治?利用Cytoscape 3.6.1軟件對(duì)侯氏黑散中藥物活性成分-作用靶點(diǎn)關(guān)系數(shù)據(jù)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和分析，得到包含273個(gè)點(diǎn)和1 246條邊的網(wǎng)絡(luò)，詳見圖1。以Degree值作為拓?fù)浞治龅闹饕獏?shù)依據(jù)，居前5位的靶點(diǎn)為前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2(PTGS2)、槲皮苷(quercetin)、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶1(PTGS1)、熱休克蛋白90(HSP90)和山奈酚(kaempferol)。詳見表2。

圖1 活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

表2 藥物活性成分靶點(diǎn)(Degree值居前5位)

2.3 侯氏黑散治療缺血性腦卒中的潛在作用靶點(diǎn) 通過GeneCards檢索到缺血性腦卒中靶點(diǎn)3 173個(gè)，利用Venny 2.1.0在線工具將缺血性腦卒中靶點(diǎn)與164個(gè)侯氏黑散作用靶點(diǎn)進(jìn)行映射取交集靶點(diǎn)121個(gè)，詳見圖2。主要包括白細(xì)胞介素6(IL-6)、血清對(duì)氧磷酶1(PON1)、PTGS2、白細(xì)胞介素2(IL-2)、趨化因子(CCL2)等。詳見表3。

圖2 藥物靶點(diǎn)-疾病靶點(diǎn)韋恩圖

表3 藥物作用靶點(diǎn)

2.4 侯氏黑散治療缺血性腦卒中PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 利用STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建侯氏黑散治療缺血性腦卒中相關(guān)靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)，包含121個(gè)節(jié)點(diǎn)，其中有兩個(gè)無相互作用的蛋白質(zhì)節(jié)點(diǎn)，1 308條邊，平均節(jié)點(diǎn)Degree值為21.6，PPI富集，P<1×10-16。詳見圖3。

圖3 交集靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

2.5 GO功能富集分析 通過DAVID 6.7數(shù)據(jù)庫對(duì)侯氏黑散治療缺血性腦卒中相關(guān)候選靶基因進(jìn)行GO功能富集分析，從分子功能(MF)、生物過程(BP)和細(xì)胞成分(CC)分別得到P<0.05的條目包括70個(gè)、494個(gè)、55個(gè)。篩選居前10位的GO條目繪制柱狀圖(見圖4～圖6)。MF相關(guān)條目主要涉及胺受體活性(amine receptor activity)、配體依賴性核受體活性(ligand-dependent nuclear receptor activity)、胺結(jié)合(amine binding)等；BP相關(guān)條目主要涉及細(xì)胞增殖調(diào)控(regulation of cell proliferation)、對(duì)有機(jī)物的反應(yīng)(response to organic substance)、系統(tǒng)過程的調(diào)節(jié)(regulation of system process)等；CC相關(guān)條目主要涉及細(xì)胞分子(cell fraction)、不溶性組分(insoluble fraction)、膜組分(membrane fraction)等。

圖4 MF富集分析(居前10位)(橫坐標(biāo)藍(lán)色表示富集該條GO條目的基因個(gè)數(shù)；橘色為P值)

圖5 BP富集分析(居前10位)(橫坐標(biāo)藍(lán)色表示富集該條GO條目的基因個(gè)數(shù)；橘色為P值)

圖6 CC富集分析(居前10位)(橫坐標(biāo)藍(lán)色表示富集該條GO條目的基因個(gè)數(shù)；橘色為P值)

2.6 KEGG通路富集分析 通過DAVID 6.7數(shù)據(jù)庫對(duì)侯氏黑散治療缺血性腦卒中靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析，以P<0.05進(jìn)行篩選，得到47條信號(hào)通路，將篩選數(shù)據(jù)繪制成氣泡圖，居前20位KEGG通路分別為癌癥信號(hào)通路(pathways in cancer)、膀胱癌(bladder cancer)、鈣信號(hào)通路(calcium signaling pathway)、黃體酮介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟(progesterone-mediate oocyte maturation)、前列腺癌(prostate cancer)、 NOD樣受體信號(hào)通路(NOD-like receptor signaling pathway)、藥物代謝(drug metabolism)、胰島素信號(hào)通路(insulin signaling pathway)、 胰腺癌(pancreatic cancer)、非小細(xì)胞性肺癌(non-small cell lung cancer)。詳見圖7。

圖7 KEGG通路富集分析(居前20位)

3 討 論

本研究以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為切入點(diǎn)，借助TCMSP、GeneCards、DAVID等數(shù)據(jù)庫檢索侯氏黑散的活性成分、作用靶點(diǎn)及缺血性腦卒中的疾病靶點(diǎn)等，通過Cytoscape等軟件構(gòu)建活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)、PPI網(wǎng)絡(luò)等，宏觀系統(tǒng)分析侯氏黑散治療缺血性腦卒中的作用機(jī)制。

通過對(duì)活性成分-作用靶點(diǎn)的分析，發(fā)現(xiàn)Degree值居前5位的靶點(diǎn)為PTGS2、槲皮苷、PTGS1、HSP90和山奈酚。有研究顯示，PTGS2表達(dá)可抑制核轉(zhuǎn)錄因子-κB通路，進(jìn)一步抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移，為缺血性腦卒中發(fā)展過程中的受損細(xì)胞提供保護(hù)和治療作用[11]。PTGS1可抑制血小板聚集，降低血栓形成風(fēng)險(xiǎn)，從而可能為治療缺血性腦卒中提供理論[12]。PTGS參與血壓調(diào)節(jié)及凝血平衡等多種生理病理過程[13]。楊冉等[14]研究顯示，槲皮素能上調(diào)相關(guān)蛋白表達(dá)，對(duì)腦缺血再灌注大鼠的血腦屏障具有保護(hù)作用，同時(shí)減少炎癥相關(guān)因子表達(dá)，如TNF-α、IL-8等[15]。槲皮素可抑制炎性小體NLRP3，改善高脂血癥[16]。Zhang等[17]采用槲皮素治療腦缺血模型大鼠，結(jié)果表明槲皮素治療可明顯改善神經(jīng)功能恢復(fù)，增加抗炎細(xì)胞因子，減少促炎因子，抑制細(xì)胞凋亡并提高受損區(qū)域修復(fù)率。Si等[18]實(shí)驗(yàn)表明，槲皮素的抗炎作用主要通過抑制核轉(zhuǎn)錄因子-κB和MAPK信號(hào)通路而發(fā)揮作用。HSP90主要參與腫瘤反應(yīng)、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞增殖過程。有研究表明，抑制HSP90可間接減少部分促炎因子表達(dá)，從而減輕腦梗死區(qū)域炎癥反應(yīng)[19]。相關(guān)研究顯示，山奈酚可能影響細(xì)胞增殖與凋亡，抑制細(xì)胞自噬，誘導(dǎo)NLRP3合成；也可抑制神經(jīng)炎癥，從而改善腦缺血再灌注引起的細(xì)胞損傷和神經(jīng)功能受損[20-21]。

通過GeneCards檢索出缺血性腦卒中疾病靶點(diǎn)3 052個(gè)，與侯氏黑散活性成分對(duì)應(yīng)的作用靶點(diǎn)共121個(gè)交集。IL-6可能參與缺血性腦卒中早期炎癥反應(yīng)，表明通過抑制IL-6表達(dá)，減少疾病早期炎癥反應(yīng)，從而保護(hù)腦細(xì)胞，降低疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[22]。有研究表明，TNF相關(guān)因子引起的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，加重缺血性腦卒中病情，增大腦梗死面積[23]。高元杰等[24]通過檢測腦梗死合并肺部感染病人相關(guān)指標(biāo)，結(jié)果顯示，感染組血清TNF相關(guān)因子高于非感染組，結(jié)果顯示TNF相關(guān)因子明顯改變，可能引起腦梗死等相關(guān)疾病。IL-1β增多可破壞磷脂雙分子層和血腦屏障，增加血管通透性；IL-1β可激活各種炎癥介質(zhì)釋放，從而加重腦損傷程度[25]。提示侯氏黑散治療缺血性腦卒中可能通過這些靶點(diǎn)發(fā)揮作用，為今后實(shí)驗(yàn)提供研究方向。

通過DAVID數(shù)據(jù)庫對(duì)交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析，結(jié)果表明交集靶點(diǎn)的生物過程富集于細(xì)胞增殖調(diào)控，對(duì)有機(jī)物的反應(yīng)和系統(tǒng)過程調(diào)節(jié)。有研究顯示，細(xì)胞的增殖調(diào)控有利于恢復(fù)受損神經(jīng)細(xì)胞局部血管的重建及受損血管的修復(fù)，對(duì)恢復(fù)組織功能具有重要的臨床意義[26]。體內(nèi)血壓、血脂、血糖等指標(biāo)變化，可能影響缺血性腦卒中的發(fā)生發(fā)展，因此，調(diào)控機(jī)體的相關(guān)指標(biāo)可能成為預(yù)防和治療缺血性腦卒中的重點(diǎn)。

通過對(duì)交集靶點(diǎn)的KEGG通路富集分析，篩選出P<0.05的信號(hào)通路47條，本研究列出了前20條通路，包括NOD樣受體信號(hào)通路、胰島素信號(hào)通路、鈣信號(hào)通路等，其中NOD樣受體信號(hào)通路參與較多疾病的生理過程，與炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)密切相關(guān)。Li等[27]通過對(duì)照組和研究組對(duì)受體肝細(xì)胞進(jìn)行處理，注入小鼠，KEGG信號(hào)通路分析結(jié)果顯示被激活的NOD樣受體信號(hào)通路在體內(nèi)外均可引起炎癥反應(yīng)。Uehara等[28]利用NOD相關(guān)配體刺激導(dǎo)致IL-6和IL-8釋放，結(jié)果顯示NOD積極參與牙齦組織的炎癥反應(yīng)和先天性免疫應(yīng)答。辛洪杰等[29]研究顯示，活化后NOD可激活下游信號(hào)通路，促進(jìn)IL-6、IL-8、IL-10和部分趨化因子(CXCL2、CCL3、CCL4及CCL5)的釋放，發(fā)揮促炎作用。NOD樣受體信號(hào)通路在細(xì)胞缺血再灌注時(shí)可減少炎癥反應(yīng)發(fā)生[30]。相關(guān)有機(jī)物通過胰島素信號(hào)通路調(diào)節(jié)體內(nèi)胰島素水平，進(jìn)而調(diào)節(jié)血糖指數(shù)，為治療高血糖引起的缺血性腦卒中提供可能[31]。鈣信號(hào)通路受損可能引起神經(jīng)元膜脂質(zhì)過氧化，使膜轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)受到氧化損害，導(dǎo)致神經(jīng)元損傷[32]。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析結(jié)果表明侯氏黑散通過多成分、多靶點(diǎn)、多通路治療缺血性腦卒中，預(yù)測侯氏黑散居前5位主要活性成分是PTGS2、槲皮苷、山奈酚、PTGS1、HSP90，主要通過調(diào)節(jié)IL-6、PON1、IL-2、CCL2等靶點(diǎn)，調(diào)控NOD樣受體信號(hào)通路、胰島素信號(hào)通路等減少炎癥反應(yīng)發(fā)生，提高免疫水平，修復(fù)受損神經(jīng)，達(dá)到治療缺血性腦卒中的目的。從整體性、系統(tǒng)性角度分析侯氏黑散的藥效機(jī)制，為今后研究奠定了基礎(chǔ)。本研究僅從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)角度分析具有局限性：本方有14味藥，藥味過多，應(yīng)結(jié)合病人臨床情況進(jìn)行具體辨證論治；進(jìn)一步驗(yàn)證上述成分、靶點(diǎn)及信號(hào)通路的作用機(jī)制。