基于網(wǎng)絡(luò)藥理學和分子對接技術(shù)探討瓜蔞薤白半夏湯治療冠心病的作用機制

王兆博，俞儀萱，王俊志

冠心病是世界范圍內(nèi)的難治愈性疾病。世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計顯示，全球心血管疾病患病率呈持續(xù)升高趨勢，2020年全球范圍內(nèi)因缺血性心臟病死亡的病人已超過1 000萬例[1]。我國2016年心血管病死亡率居首位，遠高于腫瘤等其他疾病[2]。目前藥物治療冠心病局限于改善癥狀及通過降脂穩(wěn)斑，抗血小板，以減少不良事件發(fā)生，無藥物可徹底治愈冠心病[3]，介入治療可大幅改善病人生活質(zhì)量。瓜蔞薤白半夏湯是醫(yī)圣張仲景的經(jīng)典名方，由瓜蔞、薤白、半夏、白酒組成，具有通陽散結(jié)、祛痰寬胸的功效，是臨床治療冠心病的常用方劑。實驗研究表明，瓜蔞薤白半夏湯能改善心肌供血，保護缺血心肌，降低再灌注損傷[4-5]，但作用機制尚未明確。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學與分子對接技術(shù)探討瓜蔞薤白半夏湯治療冠心病(胸痹)的作用機制，以期為實驗研究提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 方藥成分化合物與網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 運用中藥系統(tǒng)藥理學技術(shù)平臺(TCMSP)數(shù)據(jù)庫(https://tcmspw.com/tcmsp.php)檢索各中藥的化學成分和靶蛋白信息，將口服生物利用度(OB)≥30%及類藥性(DL)≥0.18作為篩選標準。若TCMSP數(shù)據(jù)庫中未檢索到有關(guān)化合物，再查詢中國科學院上海有機化學研究所化學專業(yè)數(shù)據(jù)平臺(http://www.organchem.csdb.cn)進行補充。將靶蛋白信息錄入UniProt網(wǎng)站(http://www.uniprot.org/)，選擇物種為智人(Homo Sapiens)，檢索藥物靶點蛋白對應的基因名。將數(shù)據(jù)資料導入Cytoscape 3.5.1軟件，構(gòu)建“中藥-化合物-靶基因”可視化網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2 冠狀動脈粥樣硬化疾病靶基因篩選 登錄基因數(shù)據(jù)庫對冠心病靶點基因進行查詢，關(guān)鍵檢索詞為：“coronary vasospasm”“coronary stenosis”“coronary artery disease”“coronary disease”“coronary atherosclerosis”“coronary thrombosis”?；驍?shù)據(jù)庫名稱及網(wǎng)址詳見表1。

表1 基因數(shù)據(jù)庫列表

1.3 韋恩圖與蛋白-蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 將藥物、疾病靶點信息錄入微生信網(wǎng)站(http://www.bioinformatics.com.cn/)制作韋恩圖，并取疾病與藥物靶點交集，導入STRING網(wǎng)站及Cytoscape 3.5.1構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，對交集靶點網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點進行分析與計算。運用兩種方法對關(guān)鍵靶點進行篩選與分析：篩選度值(Degree)居前10位的靶點；篩選大于Degree及介度中心性(BC)、接近中心性(CC)、網(wǎng)絡(luò)中心性(NC)、局部性連接(LAC)中位數(shù)的靶點，將兩種方法篩選出的核心靶點進行整合分析。

1.4 基因本體(GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析 將藥物與疾病交集基因錄入Metascape網(wǎng)站(http://metascape.org/)進行GO分子功能(GO-MF)、GO細胞成分(GO-CC)、GO生物過程(GO-BP)及KEGG分析，導出主要通路的KEGG通路圖并將數(shù)據(jù)導入OmicShare(https://www.omicshare.com)網(wǎng)站繪制柱狀及氣泡圖。篩選出與冠心病相關(guān)的通路，結(jié)合關(guān)聯(lián)的藥物成分、核心靶點，篩選出核心通路。

1.5 分子對接及圖形可視化 運用分子對接技術(shù)對關(guān)鍵藥物化合物-靶點關(guān)系進行驗證。檢索PDB數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org/)及ZINC數(shù)據(jù)庫(http://zinc.docking.org/)下載核心靶點蛋白PDB文件及與其對接的化合物分子MOL文件，導入AutoDock 4.2軟件進行分子對接，將對接數(shù)據(jù)導入PyMOL 2.3.2軟件進行可視化分析。

2 結(jié) 果

2.1 方劑有效成分篩選 共篩選出32種藥物化合物，其中瓜蔞10種，薤白11種，半夏12種，薤白、半夏同時含有的化合物1種，為β-谷甾醇(beta-sitosterol)。詳見表2。

表2 方劑有效成分

(續(xù)表)

2.2 藥物化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 整合檢索基因數(shù)據(jù)并篩選后得到155個藥物基因靶點，并將數(shù)據(jù)導入Cytoscape 3.5.1軟件進行可視網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，網(wǎng)絡(luò)共包含190個節(jié)點、372條邊，詳見圖1。Degree值居前5位的化合物分別是柚皮素(naringenin)、β-谷甾醇 (beta-sitosterol)、豆甾醇(stigmasterol)、松柏苷(coniferin)、槲皮素(quercetin)。詳見表3。

圖1 藥物靶點網(wǎng)絡(luò)圖

表3 核心化合物信息表

2.3 藥物與疾病的靶點韋恩圖 檢索各基因靶點數(shù)據(jù)庫后篩選出疾病基因靶點3 127個，中藥靶點155個(其中半夏65個，瓜蔞15個，薤白133個)，藥物與疾病重疊靶點116個。詳見圖2。

圖2 藥物與疾病靶點韋恩圖

2.4 藥物與疾病PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 錄入疾病及藥物重合靶點，通過STRING網(wǎng)站及Cytoscape 3.5.1軟件對PPI網(wǎng)絡(luò)進行構(gòu)建，網(wǎng)絡(luò)共包含98個節(jié)點、1 318條邊。根據(jù)Degree值分析法及關(guān)聯(lián)系數(shù)分析法篩選出核心靶點，詳見圖3、圖4及表3、表4。各系數(shù)的中位數(shù)分別是Degree值12.5、BC 0.014、CC 0.503、NC 19.556、LAC 16.333，兩種方法所篩選出的重合靶點為磷脂酰肌醇3-激酶催化亞基(PIK3CA)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP2)、雌激素受體1(ESR1)、雄激素受體(AR)。

圖3 度值法疾病-藥物靶點PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 關(guān)聯(lián)系數(shù)法疾病-藥物靶點PPI網(wǎng)絡(luò)

表3 核心靶點篩選表

表4 核心靶點-中藥化合物對應關(guān)系

2.5 GO及KEGG富集分析 通過富集分析共得到131條通路，篩選出與冠心病相關(guān)的核心通路11條。詳見圖5～圖8及表4。

圖5 GO富集分析氣泡圖(A為BP；B為CC；C為MF)

圖6 KEGG富集分析氣泡圖(CAD為冠心病)

圖7 磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B(PI3K-Akt)通路圖

表4 冠心病的相關(guān)核心通路

(續(xù)表)

2.6 分子對接及可視化驗證 對血管內(nèi)皮生長因子受體(KDR)、血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)、一氧化氮合酶3(NOS3)、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2(PTGS2)進行分子對接驗證，所有對接關(guān)系的結(jié)合能<0，說明分子間具有結(jié)合趨勢，其中PTGS2與豆甾醇對接能力最強，證實了化合物可作用于對應的靶點。詳見表5、圖8。

表5 分子對接信息 單位：kJ/mol

圖8 分子對接圖(A為KDR與柚皮素；B為VEGFA與柚皮素；C為NOS3與槲皮素；D為PTGS2與豆甾醇)

3 討 論

中藥方劑成分復雜，具有不同的藥代動力學特征和復雜的藥理學作用。目前中藥潛在的作用機制尚未明確，仍需深入分析。網(wǎng)絡(luò)藥理學是將藥物-疾病-靶點通過復雜網(wǎng)絡(luò)進行關(guān)系拓撲，深入挖掘化合物與靶點之間的互作關(guān)系，為中藥方劑的復雜作用機制提供了有效的研究方法。

冠心病屬中醫(yī)學“胸痹”“真心痛”“厥心痛”范疇，醫(yī)圣張仲景《金匱要略》提出“陽微陰弦”是“胸痹心痛”的主要病機，并于《金匱要略·胸痹心痛短氣病脈證治第九》立方瓜蔞薤白半夏湯，記載“胸痹不得臥，心痛徹背者，栝樓薤白半夏湯主之”，方劑由栝樓實(一枚，搗)、薤白(三兩)、半夏(半升)、白酒(一斗)組成。

本研究檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫，篩選出瓜蔞、薤白、半夏對應化合物32種，Degree值居前5位的分別為柚皮素、β-谷甾醇、豆甾醇、松柏苷、槲皮素。檢索各基因數(shù)據(jù)庫獲得藥物與疾病重疊靶點100個；篩選出PIK3CA、MMP2等13個核心靶點；分子對接結(jié)果顯示KDR、VEGFA、NOS3、PTGS2與對應化合物之間的結(jié)合能均<0，說明存在結(jié)合趨勢；通過富集分析共得到PI3K-Akt、RAS、Rap1、VEGF等10條與冠心病相關(guān)的核心通路。篩選核心靶點的過程中采用關(guān)聯(lián)系數(shù)法及度值法進行分析，兩種篩選方法重疊的核心靶點共4個(PIK3CA、MMP2、ESR1、AR)。分析結(jié)果差異的部分原因，可能是兩種方法對靶點不同性質(zhì)評價存在差異性所致，DC、CC、NC、LAC等系數(shù)側(cè)重于評價節(jié)點之間的關(guān)聯(lián)聚類性，Degree反映靶點間作用關(guān)系數(shù)量的多少。

將核心靶點與冠心病相關(guān)通路、關(guān)鍵化合物整合后發(fā)現(xiàn)，核心靶點密集性分布在PI3K-Akt、RAS、Rap1等10條通路上，其中PI3K-Akt富集的核心靶點最多；薤白含有的柚皮素藥效分布廣泛，作用于VEGFA、SRC、KDR等9個核心靶點；瓜蔞、薤白、半夏中的13種化合物(β-谷甾醇、豆甾醇等)同時作用于PI3K-Akt通路中的PTGS2，為關(guān)聯(lián)化合物最多的靶點。本研究具有關(guān)鍵化合物作用于核心靶點并集中富集于PI3K-Akt、VEGF等冠心病相關(guān)通路的特點，且出現(xiàn)了柚皮素等關(guān)鍵化合物同時作用于大量核心靶點的情況，一定程度說明本研究方法具有可行性。

柚皮素屬于黃酮類化合物，是薤白的主要藥物成分之一，是天然的超氧化物、過氧自由基清除劑，具有明顯的抗氧化和抗炎作用[6]。柚皮苷通過調(diào)控絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路，下調(diào)一氧化氮的生物利用度和氧化應激反應，減少血管平滑肌細胞的遷移及脂質(zhì)條紋的增殖[7-8]。柚皮素能改善線粒體功能，保護梗死和缺血損傷的心肌。豆甾醇、β-谷甾醇存在于薤白、半夏中，可競爭性抑制總膽固醇吸收，誘導膽固醇轉(zhuǎn)運體——ABCA/ABCG系列蛋白的表達，抑制炎癥過程中巨噬細胞對修飾脂蛋白的攝取[9]，從而抑制斑塊內(nèi)炎癥與脂質(zhì)沉積的過程[10-11]。調(diào)節(jié)多通路發(fā)揮對缺血再灌注損傷心肌的保護作用，減少缺血/再灌注損傷及心肌梗死后凋亡面積[12]。多項研究證實，豆甾醇、β-谷甾醇具有延緩動脈硬化，逆轉(zhuǎn)動脈斑塊的作用[13-14]。槲皮素是人參、薤白、甘草等中藥的主要成分之一，結(jié)構(gòu)中存在活性羥基，通過抑制煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶和黃嘌呤氧化酶，減少活性氧(ROS)形成，降低環(huán)氧合酶(COX)和脂氧合酶(LOX)活性，調(diào)節(jié)炎癥反應細胞內(nèi)的信號活性，具有抗氧化、內(nèi)皮保護、血管擴張等功能[15]。有研究顯示，經(jīng)槲皮素治療2個月后，冠心病病人白細胞介素(IL)-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α及IL-10水平均有不同程度降低[16]，通過靜脈注射槲皮素能減少急性心肌梗死壞死面積[17-18]。

PI3K-Akt通路廣泛調(diào)控細胞增殖、分化、凋亡等多個生物學過程[19]，VEGF是血管內(nèi)皮組織增殖過程中重要的調(diào)節(jié)蛋白[20]，VEGF家族內(nèi)多種生長因子均引起PI3K磷酸化成為肌醇磷脂產(chǎn)物并激活下游Akt，PI3K-Akt通路被激活后可抑制血管平滑肌細胞遷移，減少血小板黏附，下調(diào)血管內(nèi)皮細胞中組織因子表達，減輕血管內(nèi)皮細胞凋亡，從而發(fā)揮保護內(nèi)皮的作用[21]；另一方面，巨噬細胞中的PI3K被氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)、血管緊張素Ⅱ激活，可加強巨噬細胞自噬，增強免疫炎癥反應[22]。NOS3編碼的蛋白是磷酸化Akt下游重要的底物，也是內(nèi)源性NO分泌的重要來源[23]。缺氧狀態(tài)下，NOS3通過活化的PI3K-MAPK信號誘導HIF-1促進心血管再生，調(diào)節(jié)代謝性應激反應，從而適應缺血環(huán)境[23-24]。eNOS是NOS3基因表達的重要蛋白，也是PI3K-Akt重要的下游信號之一，Tsang等[25]對大鼠離體心臟構(gòu)建缺血/再灌注損傷模型，發(fā)現(xiàn)缺血處理可使磷酸化Akt(p-Akt)、磷酸化eNOS(p-eNOS)表達增加。PI3K抑制劑可抑制Akt磷酸化，其心臟保護作用同時消失，提示缺血預處理可經(jīng)PI3K-Akt-eNOS信號通路發(fā)揮保護缺血心肌的作用。eNOS可抑制血小板的聚集及組織因子的表達[26]，阻斷誘導損傷的冠狀動脈形成血栓[27]。

本研究局限性：不同數(shù)據(jù)庫內(nèi)錄入的疾病基因差異較大，缺乏統(tǒng)一的靶點篩選標準，采用的方法仍需更多論證；未能獲得原方中“酒”統(tǒng)一的化學成分；復雜網(wǎng)絡(luò)模型是根據(jù)既往實驗得到的基因數(shù)據(jù)所構(gòu)建的，結(jié)果仍需實驗驗證。

綜上所述，柚皮素、β-谷甾醇、豆甾醇、松柏苷、槲皮素可能是瓜蔞薤白半夏湯治療冠心病起關(guān)鍵作用的化合物，可能通過作用于PTGS2、PIK3CA、MMP2、VEGFA等靶點對RAS、Rap1、VEGF等通路進行調(diào)控，而PI3K-Akt可能是瓜蔞薤白半夏湯治療冠心病的核心通路。